このプロトコルは付着したセルの取り外しそして浮遊のようなウイルス伝染の間にある形態学的な変化の形態学的な変化の形で一時的な効果の連続的な検出を、可能にした。このプロトコルにより、細胞の形態学的変化を継続的にモニタリングし、エンドポイントアッセイでは見逃される可能性のある血管漏出などの一時的な影響を捕捉するための、非侵襲的で労働集約的でないアプローチが可能になりました。このプロトコルがセルが付着性のセルなら異なった実験組み立ての他のセルラインの管の完全性の変更を分析するのに使用することができる。
HUVECの準備ができたら、デスクトップのアイコンをダブルクリックしてRTCAソフトウェアアプリケーションを起動します。ログインウィンドウにユーザー名とパスワードを入力します。A1ウェルを内側に向けて、96ウェルRTCA抵抗プレートを細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションに配置します。
次に、RTCAソフトウェアの実験ノートタブに移動し、実験名、デバイスのシリアル番号、およびデバイスタイプを入力します。RTCAソフトウェアのセルタブの下にあるレイアウトタブで、すべてのウェルをハイライトし、ハイライトされたウェルを右クリックして、すべてのウェルがオンになっていることを確認します。次に、RTCAソフトウェアのスケジュールタブを開きます。
[Step_1] をクリックし、[sweeps] を 10 に、[interval] を 30 秒に設定します。次に、ソフトウェアの左上隅にある[開始][続行]をクリックして、検証の実行を開始します。実行後、セルのインデックスタブを開いてデータを確認します。
すべてのセル インデックス値は 0.063 未満である必要があります。次に、セルインデックスタブの下部にある生のスキャンデータで、原稿に記載されているように繰り返される値のパターンを確認します。検証の実行を終了するには、plateをクリックし、release plateを選択します。
96 ウェル RTCA 抵抗プレートを RTCA ステーションから取り外します。RTCAのバックグラウンド読み取り値を得るには、コラーゲンタイプ1でコーティングされた特殊な金微小電極プレートを、ウェルあたり60マイクロリットルのHBSSで2回洗浄します。残りのHBSSを廃棄し、ウェルあたり50ミリリットルの細胞外マトリックスを追加します。
次に、A1ウェルを内側に向けて、細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションにプレートを置きます。RTCA ソフトウェアの exp notes タブで、実験名、デバイスのシリアル番号、およびデバイスの種類を入力します。RTCAソフトウェアのセルタブに移動し、レイアウトタブを選択します。
使用する井戸をハイライト表示し、強調表示された井戸を右クリックして、すべての井戸がオンになっていることを確認します。次に、RTCAソフトウェアのスケジュールタブに移動します。[Step_1] をクリックし、左上隅の [開始] または [続行] をクリックして、背景の読み取り値を取得します。
これで、プレートは細胞の播種とRTCAステーションからの除去の準備が整いました。その後、1ウェル当たり50マイクロリットルの馴化培地を用いて、金微小電極プレート内のHUVECの4ウェル当たり10個に播種する。プレートを細胞培養インキュベーターにあるRTCAステーションに戻し、A1ウェルを内側に向けて置きます。
次に、ソフトウェアの[スケジュール]タブで、左上隅にある[ステップの追加]をクリックします。[Step_2]をクリックします。スイープを 601 に、間隔を 2 分に変更して、[適用] をクリックします。
Step_2をクリックし、ソフトウェアの左上隅にある[開始]または[続行]をクリックします。20時間のインキュベーション後、ウェルグラフタブの細胞インデックス値がプラトーを示すと、プレートは感染の準備が整います。RTCAソフトウェアのスケジュールタブで、abort stepをクリックします。
これで、プレートをRTCAステーションから取り外す準備が整いました。HUVECに感染させるには、マイナス80°Cの冷凍庫からジカウイルス株を取り出します。ジカウイルス株を1.5ミリリットルの遠心分離管で無血清細胞外マトリックスで希釈し、0.1と1の感染の多重度を達成します。
次に、各ウェルから馴化培地を廃棄し、ウェルの側面を使用しながら、各ウェルを60マイクロリットルのHBSSですすいでください。40マイクロリットルの希釈したウイルスサンプルを、ウェルの側面を使用して、希釈率の高いものから低いものへとウェルに加えます。プレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターで5%の二酸化炭素でインキュベートし、ウイルスの吸収を可能にします。
プレートを15分ごとに5回回転させ、細胞単層全体にウイルスを吸収させます。1時間のインキュベーション後、ウイルス懸濁液を最低濃度から最高濃度まで除去し、廃棄します。感染した細胞を60ミリリットルのHBSSで2回洗浄します。
ウェルに2%FBSを添加した細胞外マトリックスをオーバーレイします。ポジティブコントロールウェルの場合、2%FBSを添加した細胞外マトリックスでトロンビンを1ミリリットルあたり20単位に希釈し、ウェルの側面を使用して、細胞外マトリックス培地を含むトロンビンでウェルをオーバーレイします。次に、[スケジュール]タブをクリックし、左上隅にステップを追加します。
[Step_3] に移動し、スイープを 3, 601 に、間隔を 2 分に変更します。[適用]をクリックし、ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。A1ウェルを内側に向けて、感染した特殊な金微小電極プレートを培養インキュベーターにあるRTCAステーションに入れます。
最後に、[Step_3]をクリックし、ソフトウェアの左上隅にある[続行]をクリックします。ジカウイルスP6-740に感染したHUVECの細胞指数値は、感染多重度0.1で、感染後15時間で陰性感染対照と比較して低下し始めました。高用量のジカウイルスP6-740を1回の感染で大量に感染させたHUVECは、感染後11時間で細胞指数の低下を示しました。
感染後24時間で、内皮細胞を感染させた場合、正規化細胞指数値がそれぞれ0.1と1の多重度で5%と7%低下しました。感染後96時間および感染後66.75時間で、それぞれ0.1と1の感染の多重度で、正規化された細胞指数値の50%の減少が記録されました。正規化された細胞指数値は、感染後107時間で最低点に達し、感染の多重度が0.1と1の感染でそれぞれ51%と60%減少しました。
正規化された細胞指数値は、感染後107時間から感染後168時間で実験が終了するまで、4%および13%増加することがわかりました。各RTCA実験の前に、各バイオセンサーが正常に動作し、信頼性の高いセルインデックス値を生成することを確認するために、96ウェルRTCAプレートを使用した抵抗検証が不可欠です。
