Bu protokol, viral bir enfeksiyon sırasında, yapışık hücrelerin ayrılması ve yüzmesi gibi bazı morfolojik değişiklikler şeklinde geçici etkinin sürekli olarak tespit edilmesine izin verdi. Bu protokol, hücresel morfolojik değişikliklerin sürekli izlenmesi ve son nokta tahlili ile gözden kaçırılabilecek vasküler sızıntı gibi geçici etkilerin yakalanması için invaziv olmayan ve emek yoğun olmayan bir yaklaşıma izin verdi. Bu protokol, hücreler yapışık hücreler ise, farklı deney düzeneklerinde diğer hücre hatlarının vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için kullanılabilir.
HUVEC'leri hazırladıktan sonra, masaüstündeki simgeye çift tıklayarak RTCA yazılım uygulamasını başlatın. Oturum açma penceresine kullanıcı adını ve parolayı yazın. Hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna A96 kuyusu içe bakacak şekilde 1 kuyulu bir RTCA direnç plakası yerleştirin.
Ardından RTCA yazılımının deney notları sekmesine gidin ve deney adını, cihaz seri numarasını ve cihaz türünü yazın. RTCA yazılımının hücre sekmesinin altındaki düzen sekmesinde, tüm kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın. Ardından, RTCA yazılımının program sekmesini açın.
Step_1'ı tıklatın ve taramaları 10'a ve aralığı 30 saniyeye ayarlayın. Ardından, doğrulama çalıştırmasını başlatmak için yazılımın sol üst köşesindeki devam etmeye başla'yı tıklayın. Çalıştırdıktan sonra, verileri kontrol etmek için hücre dizini sekmesini açın.
Tüm hücre dizini değerleri 0,063'ten küçük olmalıdır. Ardından, makalede açıklandığı gibi tekrarlanan değer kalıpları için hücre dizini sekmesinin alt kısmındaki ham tarama verilerini kontrol edin. Doğrulama çalıştırmasını tamamlamak için plakaya tıklayın ve plakayı serbest bırak'ı seçin.
96 kuyulu RTCA direnç plakasını RTCA istasyonundan çıkarın. RTCA'da arka plan okuması elde etmek için, kollajen tipi bir kaplamalı özel altın mikroelektrot plakasını HBSS'nin oyuğu başına 60 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Kalan HBSS'yi atın ve hücre dışı matris kuyusu başına 50 mililitre ekleyin.
Ardından plakayı, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin. RTCA yazılımının exp notes sekmesinde deney adını, cihaz seri numarasını ve cihaz türünü yazın. RTCA yazılımının hücre sekmesine gidin ve düzen sekmesini seçin.
Kullanılacak kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın. Şimdi RTCA yazılımının program sekmesine gidin. Step_1'ye tıklayın ve arka plan okuması elde etmek için sol üst köşedeki başlat veya devam et'e tıklayın.
Plaka artık hücre tohumlama ve RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır. Daha sonra, altın mikroelektrot plakasındaki HUVEC'lerin oyuğu başına 10 ila dördüncü hücreleri, şartlandırılmış ortamın oyuğu başına 50 mikrolitre ile tohumlayın. Plakayı, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna geri yerleştirin.
Ardından yazılımın program sekmesinde, sol üst köşedeki bir adım ekle'yi tıklayın. Step_2'e tıklayın. Taramaları 601 olarak, aralığı iki dakika olarak değiştirin ve uygula'yı tıklayın.
Step_2'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki başlat veya devam et'e tıklayın. 20 saatlik inkübasyondan sonra, kuyu grafiği sekmesindeki hücre indeksi değerleri bir plato gösterdiğinde, plaka enfeksiyona hazırdır. RTCA yazılımının zamanlama sekmesinde adımı iptal et'e tıklayın.
Plaka artık RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır. HUVEC'leri enfekte etmek için, eksi 80 santigrat derece dondurucudan Zika virüsü stoğunu alın. Zika virüsü stoğunu 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde serumsuz hücre dışı matris ile seyrelterek 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğu elde edin.
Daha sonra, şartlandırılmış ortamı her bir kuyudan atın ve kuyu tarafını kullanırken her bir kuyuyu 60 mikrolitre HBSS ile durulayın. Kuyu kenarını kullanarak en yüksekten en düşüğe doğru 40 mikrolitre seyreltilmiş virüs örneği ekleyin. Virüs emilimine izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Hücre tek tabakası boyunca virüs emilimine izin vermek için plakayı her 15 dakikada bir beş kez döndürün. Bir saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın. Enfekte olmuş hücreleri 60 mililitre HBSS ile iki kez yıkayın.
Kuyucukları% 2 FBS ile desteklenmiş hücre dışı matris ile kaplayın. Pozitif kontrol kuyucukları için, trombini mililitrede 20 birim olarak% 2 FBS ile desteklenmiş hücre dışı matris ile seyreltin ve kuyucukların yan tarafını kullanarak hücre dışı matris ortamı içeren trombin ile kaplayın. Şimdi zamanlama sekmesine tıklayın ve sol üst köşeye bir adım ekleyin.
Step_3'a gidin ve taramaları 3.601 ve aralığı iki dakika olarak değiştirin. Uygula'yı tıklayın, ardından açılan pencerede Tamam'ı tıklayın. Enfekte olmuş özel altın mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde kültür inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.
Son olarak, Step_3'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki devam etmeye başla'ya tıklayın. Zika virüsü P6-740 ile enfekte olan HUVEC'lerin 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda hücre indeksi değeri, negatif enfeksiyon kontrolüne kıyasla enfeksiyondan 15 saat sonra düşmeye başladı. Daha yüksek dozda Zika virüsü P6-740 ile enfekte olan HUVEC'ler, enfeksiyondan 11 saat sonra hücre indeksinde bir düşüş gösterdi.
Enfeksiyondan 24 saat sonra, endotel hücreleri sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda enfekte olduğunda normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde% 5 ve% 7'lik bir düşüş oldu. Normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde, enfeksiyondan 96 saat sonra ve enfeksiyondan 66.75 saat sonra, sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda normalleştirilmiş hücre indeksi değerinde% 50'lik bir azalma kaydedildi. Normalleştirilmiş hücre indeksi değeri, enfeksiyondan 107 saat sonra en düşük noktasına ulaştı ve enfeksiyondan sonra sırasıyla 0.1 ve bir enfeksiyon çokluğunda %51 ve %60'lık bir azalma oldu.
Normalleştirilmiş hücre indeksi değerinin, enfeksiyondan 107 saat sonra, enfeksiyondan 168 saat sonra deneyin sonuna kadar% 4 ve% 13'lük bir artışa sahip olduğu bulundu. Her RTCA deneyinden önce, her bir biyosensörün güvenilir hücre indeksi değerleri üretmek için iyi çalışmasını sağlamak için 96 kuyulu RTCA plakasını kullanan bir direnç doğrulama çalışması gereklidir.
