이 프로토콜은 부착 세포의 분리 및 부유와 같은 바이러스 감염 중 일부 형태학적 변화의 형태로 일시적인 효과를 지속적으로 감지할 수 있도록 했습니다. 이 프로토콜은 세포 형태학적 변화를 지속적으로 모니터링하고 종말점 분석에서 놓칠 수 있는 혈관 누출과 같은 일시적인 효과를 포착하기 위한 비침습적이고 노동 집약적이지 않은 접근 방식을 허용했습니다. 이 프로토콜은 세포가 부착 세포인 경우 다른 실험 설정에서 다른 세포주의 혈관 무결성 변화를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
HUVEC를 준비한 후 바탕 화면의 아이콘을 두 번 클릭하여 RTCA 소프트웨어 응용 프로그램을 시작합니다. 로그인 창에 사용자 이름과 비밀번호를 입력합니다. A96 웰이 안쪽을 향하도록 1웰 RTCA 저항 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다.
그런 다음 RTCA 소프트웨어의 실험 노트 탭으로 이동하여 실험 이름, 장치 일련 번호 및 장치 유형을 입력합니다. RTCA 소프트웨어의 셀 탭 아래에 있는 레이아웃 탭에서 모든 웰을 강조 표시하고 강조 표시된 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모든 웰이 켜져 있는지 확인합니다. 그런 다음 RTCA 소프트웨어의 일정 탭을 엽니다.
Step_1 클릭하고 스윕을 10으로, 간격을 30초로 설정합니다. 그런 다음 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작, 계속을 클릭하여 확인 실행을 시작합니다. 실행 후 셀 인덱스 탭을 열어 데이터를 확인합니다.
모든 셀 인덱스 값은 0.063보다 작아야 합니다. 그런 다음 셀 인덱스 탭의 아래쪽에 있는 원시 스캔 데이터에서 원고에 설명된 대로 반복되는 값 패턴을 확인합니다. 검증 실행을 완료하려면 플레이트를 클릭하고 릴리스 플레이트를 선택합니다.
RTCA 스테이션에서 96웰 RTCA 저항판을 제거합니다. RTCA에 대한 배경 지식을 얻으려면 콜라겐 유형 1 코팅 된 특수 금 미세 전극 플레이트를 HBSS 웰 당 60 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 나머지 HBSS를 버리고 세포외 기질 웰당 50밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 플레이트를 A1 웰이 안쪽을 향하도록 하여 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다. RTCA 소프트웨어의 exp notes 탭에서 실험 이름, 장치 일련 번호 및 장치 유형을 입력합니다. RTCA 소프트웨어의 셀 탭으로 이동하여 레이아웃 탭을 선택합니다.
사용할 웰을 강조 표시하고 강조 표시된 웰을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모든 웰이 켜져 있는지 확인합니다. 이제 RTCA 소프트웨어의 일정 탭으로 이동합니다. Step_1 클릭하고 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작 또는 계속을 클릭하여 배경 읽기를 가져옵니다.
이제 플레이트는 RTCA 스테이션에서 세포 파종 및 제거를 위한 준비가 되었습니다. 그 후, 금 미세 전극 플레이트에서 HUVEC의 웰 당 10 내지 4 개의 세포를 조절 된 배지의 웰 당 50 마이크로 리터로 파종합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 다시 놓고 A1 웰이 안쪽을 향하도록 합니다.
그런 다음 소프트웨어의 일정 탭에서 왼쪽 상단 모서리에 있는 단계 추가를 클릭합니다. Step_2 클릭합니다. 스윕을 601로, 간격을 2분으로 변경하고 적용을 클릭합니다.
Step_2 클릭하고 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 시작 또는 계속을 클릭합니다. 20시간 배양 후 웰 그래프 탭의 세포 인덱스 값이 안정기를 나타내면 플레이트가 감염될 준비가 된 것입니다. RTCA 소프트웨어의 일정 탭에서 단계 중단을 클릭합니다.
이제 플레이트를 RTCA 스테이션에서 제거할 준비가 되었습니다. HUVEC을 감염시키려면 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 지카 바이러스 스톡을 회수하십시오. 지카 바이러스 스톡을 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 무혈청 세포외 기질로 희석하여 0.1과 1의 다중성 감염을 달성합니다.
그런 다음 각 웰에서 컨디셔닝된 배지를 버리고 웰 측면을 사용하면서 각 웰을 60마이크로리터의 HBSS로 헹굽니다. 40마이크로리터의 희석된 바이러스 샘플을 웰의 측면을 사용하여 가장 높은 희석량에서 가장 낮은 희석액으로 웰에 추가합니다. 바이러스 흡수를 위해 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다.
플레이트를 15분마다 5번 휘저어 세포 단층 전체에 바이러스가 흡수되도록 합니다. 배양 1시간 후 바이러스 현탁액을 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 제거하고 폐기합니다. 감염된 세포를 60ml의 HBSS로 두 번 씻어냅니다.
2%FBS가 보충된 세포외 기질로 웰을 오버레이합니다. 양성 대조군 웰의 경우 트롬빈을 2% FBS가 보충된 세포외 기질로 밀리리터당 20단위로 희석하고 웰 측면을 사용하여 세포외 기질 배지가 포함된 트롬빈으로 웰을 오버레이합니다. 이제 일정 탭을 클릭하고 왼쪽 상단 모서리에 단계를 추가합니다.
Step_3로 이동하고 스윕을 3, 601로 수정하고 간격을 2분으로 수정합니다. apply(적용)를 클릭한 다음 팝업 창에서 OK(확인)를 클릭합니다. A1 웰이 안쪽을 향하도록 감염된 특수 금 미세 전극 플레이트를 배양 인큐베이터에 있는 RTCA 스테이션에 놓습니다.
마지막으로 Step_3 클릭하고 소프트웨어 왼쪽 상단 모서리에 있는 계속을 클릭합니다. 지카 바이러스 P6-740에 감염된 HUVEC의 세포 지수 값은 0.1의 다중 감염 경로에서 감염 후 15시간이 지나면서 감소하기 시작했으며, 이는 감염 대조군이 음성인 경우와 비교된다. 고용량의 지카 바이러스 P6-740에 감염된 HUVEC은 감염 후 11시간에 세포 지수가 떨어지는 것으로 나타났습니다.
감염 후 24시간 후, 내피 세포가 각각 0.1과 1의 다중감염으로 감염되었을 때 정규화된 세포 지수 값이 5%와 7% 감소했습니다. 정규화된 세포 지수 값의 50% 감소는 감염 후 96시간 및 감염 후 66.75시간에 각각 0.1과 1의 감염 다중성에서 기록되었습니다. 정규화된 세포 지수 값은 감염 후 107시간에 가장 낮은 지점에 도달했으며, 감염 다중성에서 각각 0.1과 1의 감염 시 51%와 60%의 감소를 보였습니다.
정규화된 세포 지수 값은 감염 후 107시간부터 감염 후 168시간에 실험이 끝날 때까지 4%와 13% 증가하는 것으로 나타났습니다. 각 RTCA 실험 전에 96웰 RTCA 플레이트를 사용한 저항 검증 실행은 각 바이오센서가 신뢰할 수 있는 세포 인덱스 값을 생성하기 위해 잘 작동하는지 확인하는 데 필수적입니다.
