Este protocolo permitió la detección continua del efecto transitorio en forma de algunos cambios morfológicos durante una infección viral, como el desprendimiento y la flotación de células adherentes. Este protocolo permitió un enfoque no invasivo y no intensivo en mano de obra para la monitorización continua de los cambios morfológicos celulares y la captura de efectos transitorios, como la fuga vascular, que podrían pasar desapercibidos en el ensayo de punto final. Este protocolo se puede utilizar para analizar los cambios en la integridad vascular de otras líneas celulares en diferentes configuraciones experimentales si las células son células adherentes.
Después de preparar los HUVEC, inicie la aplicación de software RTCA haciendo doble clic en el icono en el escritorio. Escriba el nombre de usuario y la contraseña en la ventana de inicio de sesión. Coloque una placa de resistencia RTCA de 96 pocillos con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares.
A continuación, vaya a la pestaña de notas del experimento del software RTCA y escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo. En la pestaña de diseño debajo de la pestaña de celda del software RTCA, resalte todos los pozos y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos. A continuación, abra la pestaña de programación del software RTCA.
Haga clic en Step_1 y establezca los barridos en 10 y el intervalo en 30 segundos. A continuación, haga clic en iniciar continuar en la esquina superior izquierda del software para comenzar la ejecución de la verificación. Después de la ejecución, abra la pestaña de índice de celda para verificar los datos.
Todos los valores del índice de celda deben ser inferiores a 0,063. A continuación, compruebe los datos de escaneo sin procesar en la parte inferior de la pestaña de índice de celda para ver si hay patrones de valores repetidos como se describe en el manuscrito. Para finalizar la ejecución de verificación, haga clic en la placa y seleccione la placa de liberación.
Retire la placa de resistencia RTCA de 96 pocillos de la estación RTCA. Para obtener una lectura de fondo en RTCA, lave la placa de microelectrodo de oro especializado recubierta de colágeno tipo uno dos veces con 60 microlitros por pocillo de HBSS. Deseche el HBSS restante y agregue 50 mililitros por pocillo de matriz extracelular.
A continuación, coloque la placa en la estación RTCA situada en la incubadora de cultivos celulares con el pocillo A1 hacia dentro. En la pestaña de notas de experiencia del software RTCA, escriba el nombre del experimento, el número de serie del dispositivo y el tipo de dispositivo. Vaya a la pestaña de celda del software RTCA y seleccione la pestaña de diseño.
Resalte los pozos que se utilizarán y haga clic con el botón derecho en los pozos resaltados para asegurarse de que todos los pozos estén encendidos. Ahora vaya a la pestaña de programación del software RTCA. Haga clic en Step_1 y haga clic en Iniciar o Continuar en la esquina superior izquierda para obtener una lectura de fondo.
La placa ya está lista para la siembra celular y la eliminación de la estación RTCA. Después, siembre de 10 a la cuarta celda por pocillo de HUVEC en la placa de microelectrodos de oro con 50 microlitros por pocillo de medio acondicionado. Vuelva a colocar la placa en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivos celulares, con el pocillo A1 hacia adentro.
Luego, en la pestaña de programación del software, haga clic en agregar un paso en la esquina superior izquierda. Haga clic en Step_2. Cambie los barridos a 601, el intervalo a dos minutos y haga clic en aplicar.
Haga clic en Step_2 y haga clic en Inicio o Continuar en la esquina superior izquierda del software. Después de 20 horas de incubación, cuando los valores del índice celular en la pestaña del gráfico de pocillos muestran una meseta, la placa está lista para la infección. En la pestaña de programación del software RTCA, haga clic en abortar paso.
La placa ya está lista para ser retirada de la estación RTCA. Para infectar los HUVEC, saque las existencias del virus del Zika del congelador a menos 80 grados Celsius. Diluir el stock del virus del Zika con matriz extracelular libre de suero en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros para lograr multiplicidades de infección de 0,1 y uno.
A continuación, deseche el medio acondicionado de cada pocillo y enjuague cada pocillo con 60 microlitros de HBSS mientras usa el costado del pocillo. Agregue 40 microlitros de muestra de virus diluida en el pocillo, comenzando de la dilución más alta a la más baja, usando el costado del pocillo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono para permitir la absorción del virus.
Agite la placa cinco veces cada 15 minutos para permitir la absorción del virus en toda la monocapa celular. Después de una hora de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta. Lave las células infectadas dos veces con 60 mililitros de HBSS.
Recubrimiento de los pocillos con matriz extracelular suplementada con 2% de FBS. Para los pocillos de control positivo, diluir la trombina en 20 unidades por mililitro con matriz extracelular suplementada con 2% de FBS, y recubrir los pocillos con medio de matriz extracelular que contenga trombina, utilizando el lado del pocillo. Ahora haga clic en la pestaña de programación y agregue un paso en la esquina superior izquierda.
Vaya a Step_3 y modifique los barridos a 3, 601 y el intervalo a dos minutos. Haga clic en Aplicar y, a continuación, haga clic en Aceptar en la ventana emergente. Coloque la placa de microelectrodo de oro especializada infectada con el pocillo A1 hacia adentro en la estación RTCA ubicada en la incubadora de cultivo.
Finalmente, haga clic en Step_3 y haga clic en iniciar continuar en la esquina superior izquierda del software. El valor del índice celular de los HUVEC infectados con el virus del Zika P6-740 con una multiplicidad de infección de 0.1 comenzó a disminuir a las 15 horas después de la infección, en comparación con el control negativo de la infección. Los HUVEC infectados con una dosis más alta del virus del Zika P6-740 en una multiplicidad de infección de uno mostraron una caída en el índice celular a las 11 horas después de la infección.
A las 24 horas después de la infección, hubo una caída del 5% y del 7% en el valor del índice celular normalizado cuando las células endoteliales se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente. Se registró una reducción del 50% en el valor del índice celular normalizado a las 96 horas después de la infección y a las 66,75 horas después de la infección en el momento de la infección con una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente. El valor del índice celular normalizado alcanzó su punto más bajo a las 107 horas después de la infección, con una reducción del 51% y del 60% tras la infección a una multiplicidad de infección de 0,1 y uno respectivamente.
Se encontró que el valor del índice celular normalizado tenía un aumento del 4% y del 13% desde las 107 horas posteriores a la infección hasta el final del experimento a las 168 horas posteriores a la infección. Antes de cada experimento RTCA, es esencial realizar una verificación de la resistencia utilizando la placa RTCA de 96 pocillos para garantizar que cada biosensor funcione bien para producir valores fiables del índice celular.
