Questo protocollo ha permesso la rilevazione continua dell'effetto transitorio sotto forma di alcuni cambiamenti morfologici durante un'infezione virale, come il distacco e il galleggiamento delle cellule aderenti. Questo protocollo ha consentito un approccio non invasivo e non laborioso per il monitoraggio continuo dei cambiamenti morfologici cellulari e la cattura di effetti transitori come le perdite vascolari che potrebbero non essere rilevate dal test finale. Questo protocollo può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti dell'integrità vascolare di altre linee cellulari in diverse configurazioni sperimentali se le cellule sono cellule aderenti.
Dopo aver preparato gli HUVEC, avviare l'applicazione software RTCA facendo doppio clic sull'icona sul desktop. Digita il nome utente e la password nella finestra di accesso. Posizionare una piastra resistiva RTCA a 96 pozzetti con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore di colture cellulari.
Quindi vai alla scheda delle note dell'esperimento del software RTCA e digita il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo. Nella scheda del layout sotto la scheda delle celle del software RTCA, evidenziare tutti i pozzetti e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi. Quindi, apri la scheda di pianificazione del software RTCA.
Fate clic su Step_1 e impostate sweep su 10 e interval su 30 secondi. Quindi fare clic su avvia continua nell'angolo in alto a sinistra del software per iniziare l'esecuzione della verifica. Dopo l'esecuzione, apri la scheda dell'indice delle celle per controllare i dati.
Tutti i valori dell'indice di cella devono essere inferiori a 0,063. Quindi controlla i dati di scansione grezzi nella parte inferiore della scheda dell'indice delle celle per i modelli di valori ripetuti come descritto nel manoscritto. Per completare l'esecuzione della verifica, fare clic su piastra e selezionare piastra di rilascio.
Rimuovere la piastra del resistore RTCA a 96 pozzetti dalla stazione RTCA. Per ottenere la lettura di fondo su RTCA, lavare due volte la piastra di microelettrodi in oro specializzato rivestita di collagene di tipo uno con 60 microlitri per pozzetto di HBSS. Scartare l'HBSS rimanente e aggiungere 50 millilitri per pozzetto di matrice extracellulare.
Quindi posizionare la piastra nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno. Nella scheda exp notes del software RTCA, digitare il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo. Passare alla scheda cella del software RTCA e selezionare la scheda layout.
Evidenziare i pozzetti da utilizzare e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi. Ora vai alla scheda di pianificazione del software RTCA. Fare clic su Step_1 e fare clic su Avvia o Continua nell'angolo in alto a sinistra per ottenere una lettura di fondo.
La piastra è ora pronta per la semina e la rimozione delle cellule dalla stazione RTCA. Successivamente, seminare 10 cellule al quarto per pozzetto di HUVEC nella piastra del microelettrodo d'oro con 50 microlitri per pozzetto di terreno condizionato. Riposizionare la piastra nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari, con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno.
Quindi, nella scheda di pianificazione del software, fai clic su aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su Step_2. Impostate le sweep su 601, l'intervallo su due minuti e fate clic su Applica.
Fare clic su Step_2 e fare clic su Avvia o continua nell'angolo in alto a sinistra del software. Dopo 20 ore di incubazione, quando i valori dell'indice cellulare nella scheda del grafico del pozzetto mostrano un plateau, la piastra è pronta per l'infezione. Nella scheda di pianificazione del software RTCA, fare clic su Interrompi passaggio.
La piastra è ora pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA. Per infettare gli HUVEC, recupera le scorte di virus Zika dal congelatore a meno 80 gradi Celsius. Diluire lo stock di virus Zika con matrice extracellulare priva di siero in provette da centrifuga da 1,5 millilitri per ottenere una molteplicità di infezione di 0,1 e uno.
Quindi, scartare il mezzo condizionato da ciascun pozzetto e sciacquare ogni pozzetto con 60 microlitri di HBSS mentre si utilizza il lato del pozzetto. Aggiungere 40 microlitri di campione virale diluito nel pozzetto, partendo dalla diluizione più alta a quella più bassa, utilizzando il lato del pozzetto. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire l'assorbimento del virus.
Agitare la piastra cinque volte ogni 15 minuti per consentire l'assorbimento del virus in tutto il monostrato cellulare. Dopo un'ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dalla concentrazione più bassa a quella più alta. Lavare le cellule infette due volte con 60 millilitri di HBSS.
Sovrapporre i pozzetti con matrice extracellulare integrata con FBS al 2%. Per i pozzetti di controllo positivo, diluire la trombina in 20 unità per millilitro con matrice extracellulare integrata con FBS al 2% e sovrapporre i pozzetti con mezzo di matrice extracellulare contenente trombina, utilizzando il lato del pozzetto. Ora fai clic sulla scheda del programma e aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra.
Passare a Step_3 e modificare le sweep in 3, 601 e l'intervallo in due minuti. Fare clic su Applica, quindi fare clic su OK nella finestra visualizzata. Posizionare la piastra del microelettrodo in oro specializzato infetto con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore di coltura.
Infine, fai clic su Step_3 e fai clic su avvia continua nell'angolo in alto a sinistra del software. Il valore dell'indice cellulare degli HUVEC infettati dal virus Zika P6-740 con una molteplicità di infezione di 0,1 ha iniziato a scendere a 15 ore dopo l'infezione, rispetto al controllo negativo dell'infezione. Gli HUVEC infettati con una dose più elevata di virus Zika P6-740 a una molteplicità di infezione di uno hanno mostrato un calo dell'indice cellulare a 11 ore dopo l'infezione.
A 24 ore dall'infezione, c'è stato un calo del 5% e del 7% nel valore dell'indice cellulare normalizzato quando le cellule endoteliali sono state infettate a una molteplicità di infezione rispettivamente di 0,1 e uno. Una riduzione del 50% del valore dell'indice cellulare normalizzato è stata registrata a 96 ore dopo l'infezione e 66,75 ore dopo l'infezione con una molteplicità di infezione rispettivamente di 0,1 e uno. Il valore dell'indice cellulare normalizzato ha raggiunto il suo punto più basso a 107 ore dopo l'infezione, con una riduzione del 51% e del 60% dopo l'infezione con una molteplicità di infezione rispettivamente di 0,1 e uno.
È stato riscontrato che il valore dell'indice cellulare normalizzato ha avuto un aumento del 4% e del 13% da 107 ore dopo l'infezione in poi fino alla fine dell'esperimento a 168 ore dopo l'infezione. Prima di ogni esperimento RTCA, è essenziale eseguire una verifica del resistore utilizzando la piastra RTCA a 96 pozzetti per garantire che ogni biosensore funzioni bene per produrre valori di indice cellulare affidabili.
