我们的协议提供了一种高效且易于重现的方法来量化单链DNA，单链DNA是各种细胞系中复制应激的标志物。此外，其简单性允许高通量应用和屏幕。特别是，这种方法允许快速量化复制应激，这是几种卵巢癌的标志。
它还适用于主机自动分析软件，进一步提高效率。单链DNA现在正被积极考虑作为靶向DNA修复途径的化疗反应的生物标志物。因此，此方法非常适用于该方案。
复制应激存在于卵巢癌背景或BRCA1，BRCA2缺陷癌症之外。因此，这种方法可以应用于各种其他细胞类型或疾病背景。首先，通过将高压灭菌的12毫米直径盖玻片和聚赖氨酸溶液添加到50毫升锥形管中来制作聚赖氨酸涂层的盖玻片，并放在摇臂上15分钟。
在组织培养罩上吸出溶液。加入无菌水清洗盖玻片，然后将装有盖玻片的管子放回摇杆上五分钟。清洗盖玻片三次后，从管中吸出水并将盖玻片铺在无菌盘子上。
吸出剩余的水，让它们在组织培养罩中干燥一小时或直到没有水滴残留。干燥后，用石蜡膜密封盘子并将其置于 4 摄氏度。为了防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上脱落，在24孔板的每个孔中放置一个聚赖氨酸包被的盖玻片。
一旦OVCAR3细胞达到70%至80%汇合度，从平板中吸出培养基并用5至7毫升PBS洗涤细胞。从平板中吸出PBS。吸出PBS后，加入1毫升0.25%胰蛋白酶，并将培养皿放入37摄氏度的培养箱中8至10分钟或直到细胞从板底部升起。
用5至10毫升培养基收集细胞，并将细胞悬液加入锥形管中。使用标准程序用血细胞计数器手动计数细胞。接下来，稀释细胞悬液，并获得一个在三个群体后产生70%至80%汇合度的数字。
在放置在24孔板孔中的聚赖氨酸盖玻片上加入1毫升细胞悬液，并在标准条件下在培养基中培养细胞。在一次群体加倍后，从平板中吸出现有培养基并用 10 微摩尔 IdU 脉冲细胞以进行随后的两次群体加倍。要收获细胞，请在冰上用冰冷的0.5%PBSTx替换培养基五分钟。
为了固定细胞，吸出PBSTx并在室温下用3%多聚甲醛孵育细胞15分钟。用PBS洗涤三到四次后，将固定细胞保持在4摄氏度，直到进一步使用。固定后，使用0.5%PBSTx在冰上透化细胞五分钟，确保覆盖整个盖玻片。
在室温下用1毫升0.2%PBST洗涤细胞三到四次后，吸出PBST并使用PBS制成的5%BSA在室温下封闭样品30分钟。对于免疫染色，通过将湿纸巾放在平底特百惠器皿上来准备统一的腔室。用石蜡膜盖住 24 孔板盖。
将其放入加湿室中，然后将盖玻片放在板盖上。在盖玻片顶部加入60微升稀释的抗BrdU小鼠一抗。或者，为了减少抗体干燥并使用较小的体积，将一滴稀释的抗体放在封口膜上，然后将盖玻片翻转到其上。
然后在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育后，吸出一抗。将盖玻片放回24孔板中，并用0.2%PBST洗涤四次。
如前所述，在盖玻片上加入稀释的二抗，并在室温下在黑暗中孵育一小时。标记显微镜载玻片，并使用DAPI安装介质将盖玻片安装在载玻片上。如果需要固化或硬化，请将载玻片在室温下在黑暗中存放 24 小时。
来自未处理和用0.5毫摩尔羟基脲处理的细胞的细胞核在DAPI和IdU通道中染色和识别。对这些图像的分析包括量化每个细胞核中的病灶数量。病灶的数量与复制应激的程度成正比。
重要的是要考虑所选细胞系的倍增时间，因为IdU脉冲的时间可能会因更长或更短的倍增期而变化。或者，我们可以探测细胞中的复制蛋白A以确认结果并评估细胞中的各种复制应激反应。该技术与任何DNA损伤诱导剂一起用于许多细胞系，以检查单株DNA的积累。
因此，这种方法是广泛可访问和适用的。
