يقدم بروتوكولنا طريقة عالية الكفاءة وقابلة للتكرار بسهولة لتحديد كمية الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل ، وهو علامة على إجهاد النسخ المتماثل في مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح بساطته بالتطبيقات والشاشات عالية الإنتاجية. على وجه الخصوص ، تسمح هذه الطريقة بالقياس الكمي السريع لإجهاد النسخ المتماثل ، وهي السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض.
كما أنه قابل لبرنامج التحليل التلقائي المضيف ، مما يزيد من الكفاءة. يتم الآن اعتبار الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل بنشاط كعلامة حيوية للاستجابة للعلاج الكيميائي الذي يستهدف مسارات إصلاح الحمض النووي. ومن ثم ، فإن هذه الطريقة قابلة للتطبيق بشكل كبير في هذا السيناريو.
يوجد إجهاد النسخ المتماثل خارج سياقات سرطان المبيض أو سرطانات BRCA1 ، BRCA2 الناقصة. وبالتالي ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الأخرى أو سياقات المرض. للبدء ، قم بعمل زلات غطاء مطلية بالبولي ليسين عن طريق إضافة زلات غطاء بقطر 12 مم ومحلول بوليسين إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ، وضعه على كرسي متأرجح لمدة 15 دقيقة.
نضح الحل على غطاء زراعة الأنسجة. اغسل زلات الغطاء بإضافة ماء معقم ، وضع الأنبوب الذي يحتوي على الغطاء ينزلق مرة أخرى على الروك لمدة خمس دقائق. بعد غسل الغطاء ينزلق ثلاث مرات ، استنشاق الماء من الأنبوب ونشر زلات الغطاء على طبق معقم.
نضح الماء المتبقي واتركه يجف في غطاء زراعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة أو حتى لا تبقى قطرات الماء. بمجرد أن يجف ، أغلق الطبق باستخدام Parafilm وضعه على حرارة 4 درجات مئوية. لمنع انفصال الخلايا عن انزلاق الغطاء أثناء خطوة ما قبل الاستخراج ، ضع زلة غطاء واحدة مطلية بالبولي ليسين في كل بئر من لوحة 24 بئرا.
بمجرد أن تصل خلايا OVCAR3 إلى التقاء 70 إلى 80٪ ، قم بشفط الوسط من اللوحة واغسل الخلايا ب 5 إلى 7 ملليلتر من PBS. نضح برنامج تلفزيوني من اللوحة. بعد استنشاق برنامج تلفزيوني ، أضف 1 ملليلتر من 0.25٪ تربسين وضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 إلى 10 دقائق أو حتى تنطلق الخلايا من قاع اللوحة.
اجمع الخلايا التي تحتوي على 5 إلى 10 ملليلتر من الوسط وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي. عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم باستخدام الإجراءات القياسية. بعد ذلك ، قم بتخفيف تعليق الخلية ، واحصل على رقم ينتج عنه التقاء بنسبة 70 إلى 80٪ بعد ثلاث مجموعات سكانية.
أضف 1 ملليلتر من تعليق الخلية على زلات غطاء البولي ليسين الموضوعة في آبار صفيحة 24 بئرا ، وقم بتنمية الخلايا في وسط الاستزراع في ظل الظروف القياسية. بعد مضاعفة عدد السكان ، قم باستنشاق الوسائط الموجودة من اللوحة ونبض الخلايا باستخدام 10 ميكرومولار IdU لمضاعفة السكان اللاحقة. لحصاد الخلايا ، استبدل الوسط بالثلج البارد 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة خمس دقائق.
لتثبيت الخلايا ، نضح PBSTx واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة مع 3٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث إلى أربع غسلات باستخدام برنامج تلفزيوني ، احتفظ بالخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. بعد التثبيت ، قم بتخلل الخلايا باستخدام 0.5٪ PBSTx على الجليد لمدة خمس دقائق ، مع التأكد من تغطية انزلاق الغطاء بالكامل.
بعد غسل الخلايا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 1 ملليلتر من 0.2٪ PBST في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط PBST ومنع العينات باستخدام 5٪ BSA المصنوع في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للتلطيخ المناعي ، قم بإعداد غرفة موحدة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة على Tupperware ذات قاع مسطح. قم بتغطية غطاء اللوحة المكون من 24 بئرا باستخدام Parafilm.
ضعه في الغرفة المرطبة وضع زلات الغطاء على غطاء اللوحة. أضف 60 ميكرولترا من الجسم المضاد للماوس الأساسي المخفف المضاد ل BrdU أعلى قسيمة الغطاء. بدلا من ذلك ، لتقليل الجسم المضاد من الجفاف واستخدام حجم أقل ، ضع قطرة من الجسم المضاد المخفف على Parafilm واقلب الغطاء المنزلق عليه.
ثم احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، نضح الجسم المضاد الأساسي. أعد الغطاء ينزلق مرة أخرى إلى طبق مكون من 24 بئرا واغسله بنسبة 0.2٪ PBST أربع مرات.
أضف جسما مضادا ثانويا مخففا على زلة الغطاء كما هو موضح سابقا ، واحتضنه لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. قم بتسمية شريحة مجهر وقم بتركيب انزلاق الغطاء على الشرائح باستخدام وسيط تركيب DAPI. قم بتخزين الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة إذا كان وسيط التثبيت بحاجة إلى المعالجة أو التصلب.
كانت النوى المشتقة من الخلايا غير المعالجة والمعالجة التي تحتوي على 0.5 مليمولار هيدروكسي يوريا ملطخة ويمكن التعرف عليها في قنوات DAPI و IdU. يتكون تحليل هذه الصور من تحديد عدد البؤر في كل نواة. عدد البؤر يتناسب مع درجة إجهاد النسخ المتماثل.
من المهم مراعاة وقت مضاعفة خط الخلية المختار لأن وقت نبض IdU قد يختلف لفترات مضاعفة أطول أو أقصر. بدلا من ذلك، يمكننا فحص الخلايا بحثا عن البروتين المتماثل A لتأكيد النتائج وتقييم استجابات إجهاد التضاعف المختلفة في الخلايا. تستخدم هذه التقنية للعديد من خطوط الخلايا جنبا إلى جنب مع أي عامل يسبب تلف الحمض النووي لفحص تراكم الحمض النووي أحادي التوتر.
وبالتالي ، فإن هذه الطريقة يمكن الوصول إليها على نطاق واسع وقابلة للتطبيق.
