Protokolümüz, çeşitli hücre hatlarında replikasyon stresinin bir belirteci olan tek sarmallı DNA'yı ölçmek için oldukça verimli ve kolayca tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Ek olarak, sadeliği yüksek verimli uygulamalara ve ekranlara izin verir. Özellikle, bu yöntem, birkaç yumurtalık kanserinin ayırt edici özelliği olan bir replikasyon stresinin hızlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.
Ayrıca, verimliliği daha da artıran bir ana bilgisayar otomatik analiz yazılımına da uygundur. Tek sarmallı DNA şimdi aktif olarak DNA onarım yollarını hedef alan kemoterapiye yanıt için bir biyobelirteç olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, bu yöntem bu senaryoda oldukça uygulanabilir.
Replikasyon stresi, yumurtalık kanseri bağlamlarının veya BRCA1, BRCA2 eksikliği olan kanserlerin ötesinde mevcuttur. Ve böylece, bu yöntem çok çeşitli diğer hücre tiplerine veya hastalık bağlamlarına uygulanabilir. Başlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe otoklavlanmış 12 milimetre çapında kapak kaymaları ve polilizin çözeltisi ekleyerek polilizin kaplı kapak kaymaları yapın ve 15 dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin.
Çözeltiyi bir doku kültürü davlumbazına aspire edin. Kapak fişlerini steril su ekleyerek yıkayın ve kapak kaymalarını içeren tüpü beş dakika boyunca rocker'a geri yerleştirin. Kapak kaymalarını üç kez yıkadıktan sonra, tüpten suyu aspire edin ve kapak kaymalarını steril bir kaba yayın.
Kalan suyu aspire edin ve doku kültürü davlumbazında bir saat boyunca veya su damlacıkları kalmayana kadar kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, kabı Parafilm ile kapatın ve 4 santigrat dereceye yerleştirin. Ön ekstraksiyon adımı sırasında hücrelerin kapak kaymalarından ayrılmasını önlemek için, 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna bir polilizin kaplı kapak kayması yerleştirin.
OVCAR3 hücreleri% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, ortamı plakadan aspire edin ve hücreleri 5 ila 7 mililitre PBS ile yıkayın. PBS'yi plakadan aspire edin. PBS'yi aspire ettikten sonra, 1 mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve çanağı inkübatöre 8 ila 10 dakika boyunca veya hücreler plakanın altından kalkıncaya kadar 37 santigrat derecede yerleştirin.
Hücreleri 5 ila 10 mililitre orta ile toplayın ve hücre süspansiyonunu konik bir tüpe ekleyin. Standart prosedürleri kullanarak hücreleri bir hemositometre ile manuel olarak sayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu seyreltin ve üç popülasyondan sonra% 70 ila% 80 akıcılık sağlayacak bir sayı elde edin.
24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilen polilizin kapak kaymalarına 1 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin ve standart koşullar altında kültür ortamındaki hücreleri büyütün. Bir popülasyon ikiye katlandıktan sonra, mevcut ortamı plakadan aspire edin ve sonraki iki popülasyon iki katına çıkması için hücreleri 10 mikromolar IdU ile darbeleyin. Hücreleri hasat etmek için, ortamı beş dakika boyunca buz üzerinde% 0.5 PBSTx buz soğukluğuyla değiştirin.
Hücrelerin sabitlenmesi için, PBSTx'i aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında% 3 paraformaldehit ile 15 dakika boyunca inkübe edin. PBS ile üç ila dört kez yıkandıktan sonra, sabit hücreleri daha fazla kullanıma kadar 4 santigrat derecede tutun. Fiksasyondan sonra, beş dakika boyunca buz üzerinde% 0.5 PBSTx kullanarak hücreleri geçirgenleştirin ve tüm kapak kaymasını örtmeyi sağlayın.
Hücreleri oda sıcaklığında 1 mililitre% 0.2 PBST ile üç ila dört kez yıkadıktan sonra, PBST'yi aspire edin ve PBS'de yapılan % 5BSA'yı kullanarak numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bloke edin. İmmün boyama için, düz tabanlı bir Tupperware üzerine ıslak bir kağıt havlu koyarak birleşik bir oda hazırlayın. 24 delikli plaka kapağını Parafilm ile örtün.
Nemlendirilmiş odaya yerleştirin ve kapak kapaklarını plaka kapağına yerleştirin. Kapak kapağının üstüne 60 mikrolitre seyreltilmiş anti-BrdU birincil fare antikoru ekleyin. Alternatif olarak, antikorun kurumasını azaltmak ve daha az hacim kullanmak için, Parafilm üzerine bir damla seyreltilmiş antikor yerleştirin ve kapak kaymasını üzerine çevirin.
Daha sonra 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, birincil antikoru aspire edin. Kapak kapaklarını 24 delikli bir plakaya geri döndürün ve dört kez% 0,2 PBST ile yıkayın.
Daha önce gösterildiği gibi kapak kaymasına seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Bir mikroskop slaytını etiketleyin ve kapak kaymasını DAPI montaj ortamıyla slaytlara monte edin. Montaj ortamının kürlenmesi veya sertleştirilmesi gerekiyorsa, slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat saklayın.
0.5 milimolar hidroksiüre ile tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücrelerden türetilen çekirdekler, DAPI ve IdU kanallarında boyanmış ve tanımlanabilir. Bu görüntülerin analizi, her çekirdekteki odakların sayısını ölçmekten ibarettir. Odakların sayısı, replikasyon stresinin derecesi ile orantılıdır.
IdU darbesinin süresi daha uzun veya daha kısa iki katına çıkma süreleri için değişebileceğinden, tercih edilen hücre hattının iki katına çıkma süresini dikkate almak önemlidir. Alternatif olarak, sonuçları doğrulamak ve hücrelerdeki çeşitli replikasyon stres tepkilerini değerlendirmek için replikasyon proteini A için hücreleri araştırabiliriz. Bu teknik, tek gergin DNA'nın birikimini incelemek için herhangi bir DNA hasarına neden olan ajanla birlikte birçok hücre hattı için kullanılır.
Bu nedenle, bu yöntem yaygın olarak erişilebilir ve uygulanabilir.
