Nuestro protocolo presenta un método altamente eficiente y fácilmente reproducible para cuantificar el ADN monocatenario, que es un marcador de estrés de replicación en una variedad de líneas celulares. Además, su simplicidad permite aplicaciones y pantallas de alto rendimiento. En particular, este método permite una cuantificación rápida de un estrés de replicación, un sello distintivo de varios cánceres de ovario.
También es susceptible a un software de análisis automático de host, lo que aumenta aún más la eficiencia. El ADN monocatenario ahora se está considerando activamente como un biomarcador para la respuesta a la quimioterapia dirigida a las vías de reparación del ADN. Por lo tanto, este método es altamente aplicable en ese escenario.
El estrés de replicación existe más allá de los contextos de cáncer de ovario o BRCA1, cánceres deficientes en BRCA2. Y por lo tanto, este método se puede aplicar a una amplia gama de otros tipos de células o contextos de enfermedades. Para comenzar, haga cubrevestimientos de polilisina agregando cubreobjetos de cubierta de 12 milímetros de diámetro en autoclave y solución de polilisina a un tubo cónico de 50 mililitros, y colóquelos en un balancín durante 15 minutos.
Aspirar la solución en una campana de cultivo de tejidos. Lave los cubreobjetos agregando agua estéril y vuelva a colocar el tubo que contiene los resbalones de cobertura en el balancín durante cinco minutos. Después de lavar los resbalones de la cubierta tres veces, aspire agua del tubo y extienda los resbalones de la cubierta en un plato estéril.
Aspire el agua restante y déjelos secar en la campana de cultivo de tejidos durante una hora o hasta que no queden gotas de agua. Una vez seco, sella el plato con Parafilm y colócalo a 4 grados centígrados. Para evitar el desprendimiento de las células de los cubreobjetos durante la etapa previa a la extracción, coloque un resbalón de cobertura recubierto de polilisina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
Una vez que las células OVCAR3 alcancen 70 a 80% de confluencia, aspirar el medio de la placa y lavar las células con 5 a 7 mililitros de PBS. Aspire el PBS de la placa. Después de aspirar el PBS, agregue 1 mililitro de tripsina al 0,25% y coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados durante 8 a 10 minutos o hasta que las células se levanten del fondo de la placa.
Recoja las celdas con 5 a 10 mililitros de medio y agregue la suspensión celular a un tubo cónico. Contar las células manualmente con un hemocitómetro utilizando procedimientos estándar. A continuación, diluya la suspensión celular y obtenga un número que produzca una confluencia del 70 al 80% después de tres poblaciones.
Agregue 1 mililitro de suspensión celular en los cubreobjetos de polilisina colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos y cultive las células en el medio de cultivo en condiciones estándar. Después de duplicar una población, aspirar los medios existentes de la placa y pulsar las células con 10 IdU micromolares para las dos duplicaciones de población posteriores. Para cosechar las células, reemplace el medio con hielo 0.5% PBSTx en hielo durante cinco minutos.
Para la fijación de células, aspirar PBSTx e incubar las células durante 15 minutos con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente. Después de tres o cuatro lavados con PBS, mantenga las celdas fijas a 4 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Después de la fijación, permeabilice las células usando 0.5% PBSTx en hielo durante cinco minutos, asegurándose de cubrir todo el cubreobjetos.
Después de lavar las células de tres a cuatro veces con 1 mililitro de 0.2% PBST a temperatura ambiente, aspire el PBST y bloquee las muestras usando 5% BSA hecho en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para la inmunotinción, prepare una cámara unificada colocando una toalla de papel húmeda en un Tupperware de fondo plano. Cubra la tapa de la placa de 24 pocillos con Parafilm.
Colóquelo en la cámara humidificada y coloque los cubreobjetos en la tapa de la placa. Agregue 60 microlitros de anticuerpo primario de ratón anti-BrdU diluido en la parte superior de la cubierta. Alternativamente, para reducir el secado del anticuerpo y usar menos volumen, coloque una gota de anticuerpo diluido en el Parafilm y voltee el deslizamiento de la cubierta sobre él.
Luego incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, aspire el anticuerpo primario. Devuelva los trozos de la cubierta a una placa de 24 pocillos y lávelos con 0.2% PBST cuatro veces.
Agregue anticuerpo secundario diluido en la cubierta como se demostró anteriormente, e incube durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Etiquete un portaobjetos de microscopio y monte el deslizamiento de la cubierta en los portaobjetos con el medio de montaje DAPI. Guarde los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas si es necesario curar o endurecer el medio de montaje.
Los núcleos derivados de las células no tratadas y tratadas con hidroxiurea 0,5 milimolar se tiñeron e identificaron en los canales DAPI e IdU. El análisis de estas imágenes consiste en cuantificar el número de focos en cada núcleo. El número de focos es proporcional al grado de tensión de replicación.
Es importante considerar el tiempo de duplicación de la línea celular de elección, ya que el tiempo de pulsación de IdU puede variar durante períodos de duplicación más largos o más cortos. Alternativamente, podemos sondear las células en busca de la proteína de replicación A para confirmar los resultados y evaluar varias respuestas de estrés de replicación en las células. Esta técnica se utiliza para muchas líneas celulares en conjunto con cualquier agente inductor de daño del ADN para examinar la acumulación de ADN de una sola cepa.
Por lo tanto, este método es ampliamente accesible y aplicable.
