Наш протокол представляет собой высокоэффективный и легко воспроизводимый метод количественного определения одноцепочечной ДНК, которая является маркером репликационного стресса в различных клеточных линиях. Кроме того, его простота позволяет использовать приложения и экраны с высокой пропускной способностью. В частности, этот метод позволяет быстро количественно оценить репликационный стресс, отличительный признак нескольких видов рака яичников.
Он также поддается программному обеспечению для автоматического анализа хоста, что еще больше повышает эффективность. Одноцепочечная ДНК в настоящее время активно рассматривается в качестве биомаркера ответа на химиотерапию, нацеленную на пути репарации ДНК. Следовательно, этот метод очень применим в этом сценарии.
Репликационный стресс существует за пределами контекста рака яичников или рака с дефицитом BRCA1, BRCA2. И, таким образом, этот метод может быть применен к широкому спектру других типов клеток или контекстов заболевания. Для начала сделайте покровные листы с полилизином, добавив автоклавные покровные листы диаметром 12 миллиметров и раствор полилизина в коническую трубку объемом 50 миллилитров и поместите на коромысло на 15 минут.
Аспирируйте раствор на вытяжку для культивирования тканей. Промойте крышки, добавив стерильную воду, и поместите трубку с накладками на коромысло на пять минут. После мытья крышка трижды проскальзывает, аспирирует воду из трубки и выкладывает крышку на стерильную посуду.
Отдохните оставшуюся воду и дайте ей высохнуть в вытяжке для культивирования тканей в течение одного часа или до тех пор, пока не останется капель воды. После высыхания закройте блюдо Parafilm и поставьте его при температуре 4 градуса Цельсия. Чтобы предотвратить отсоединение ячеек от покровных накладок на этапе предварительной экстракции, поместите по одному покрытому полилизином покровному листу в каждую лунку 24-луночного планшета.
Как только ячейки OVCAR3 достигнут слияния от 70 до 80%, аспирируйте среду из пластины и промойте клетки 5-7 миллилитрами PBS. Аспирируйте PBS с тарелки. После аспирации PBS добавьте 1 миллилитр 0,25% трипсина и поместите блюдо в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 8-10 минут или до тех пор, пока ячейки не оторвутся от дна тарелки.
Соберите клетки с 5-10 миллилитрами среды и добавьте клеточную суспензию в коническую трубку. Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра, используя стандартные процедуры. Затем разбавьте клеточную суспензию и получите число, которое даст от 70 до 80% слияния после трех популяций.
Добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии на полилизиновые покровные листы, помещенные в лунки 24-луночной пластины, и выращивайте клетки в питательной среде в стандартных условиях. После удвоения одной популяции аспирируйте существующую среду из пластины и импульсируйте клетки 10 микромолярным IdU для двух последующих удвоений популяции. Чтобы собрать клетки, замените среду ледяным 0,5% PBSTx на льду в течение пяти минут.
Для фиксации клеток аспирируют PBSTx и инкубируют клетки в течение 15 минут с 3% параформальдегидом при комнатной температуре. После трех-четырех стирок с PBS держите неподвижные ячейки при температуре 4 градуса Цельсия до дальнейшего использования. После фиксации пермеабилизируйте клетки, используя 0,5% PBSTx на льду в течение пяти минут, чтобы покрыть весь покровный листок.
После промывки клеток три-четыре раза 1 миллилитром 0,2% PBST при комнатной температуре аспирируйте PBST и блокируйте образцы с помощью 5% BSA, изготовленного в PBS, в течение 30 минут при комнатной температуре. Для иммуноокрашивания подготовьте унифицированную камеру, положив влажное бумажное полотенце на посуду Tupperware с плоским дном. Накройте крышку пластины с 24 лунками Parafilm.
Поместите его в увлажненную камеру и положите крышку на крышку тарелки. Добавьте 60 микролитров разбавленного первичного антитела против BrdU мыши в верхнюю часть покровного листа. В качестве альтернативы, чтобы уменьшить антитело от высыхания и использовать меньший объем, поместите каплю разбавленного антитела на парапленку и переверните на нее крышку.
Затем инкубировать в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. После инкубации аспирируют первичное антитело. Верните слипы крышки обратно на пластину с 24 лунками и промойте их 0,2% PBST четыре раза.
Добавьте разбавленные вторичные антитела на покровное стекло, как показано ранее, и выдерживайте в течение одного часа в темноте при комнатной температуре. Пометьте предметное стекло микроскопа и закрепите защитное стекло на предметных стеклах с помощью монтажного носителя DAPI. Храните предметные стекла в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов, если монтажная среда нуждается в отверждении или затвердевании.
Ядра, полученные из необработанных и обработанных клеток 0,5 миллимолярной гидроксимочевиной, окрашивали и идентифицировали в каналах DAPI и IdU. Анализ этих изображений заключается в количественной оценке количества очагов в каждом ядре. Количество очагов пропорционально степени репликационного стресса.
Важно учитывать время удвоения выбранной клеточной линии, поскольку время пульсации IdU может варьироваться в течение более длительных или более коротких периодов удвоения. В качестве альтернативы мы можем исследовать клетки на наличие репликационного белка А, чтобы подтвердить результаты и оценить различные реакции репликационного стресса в клетках. Этот метод используется для многих клеточных линий в тандеме с любым агентом, вызывающим повреждение ДНК, для изучения накопления одноштаммовой ДНК.
Таким образом, этот метод широко доступен и применим.
