器官捐献者及其家人因其宝贵的捐献而受到赞赏，国际器官采购组织、医学促进研究所 （IIAM） 和国家疾病研究交流 （NDRI） 因其在使人类胰腺组织可用于研究方面的合作而受到认可。这项工作得到了人类胰岛研究网络 （RRID：SCR_014393）、人类胰腺分析计划 （RRID：SCR_016202）、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442 和 DK20593（范德比尔特糖尿病研究与培训中心）、Leona M. 和 Harry B. Helmsley 慈善信托基金、JDRF、美国退伍军人事务部 （BX000666）、 美国国立卫生研究院 （T32GM007347）、F30DK134041、F30DK118830 和美国国家科学基金会研究生研究奖学金 （1937963） 的 NIGMS。

人胰岛（N = 4 种制剂）是通过与综合胰岛分布计划、人类胰腺分析计划、Prodo Laboratories， Inc. 和 Imagine Pharma 合作获得的。范德比尔特大学机构审查委员会不认为去识别化的人类胰腺标本是人类受试者研究。如果没有器官捐献者、他们的家人和器官采购组织，这项工作是不可能的。捐助者人口统计信息见 表1 。从没有糖尿病的胰腺供体中分离出人胰岛，冷缺血时间少于 15 小时。
1.假胰岛形成（详见Walker等人。七）
<ol><li>使用P200移液器和台式显微镜获取并手动挑选原代人胰岛，密切注意不要污染胰岛培养基以外的任何表面上的移液器吸头（10%FBS，100μg/ mL链霉素，100U / mL青霉素，CMRL 1066中的2mM L-谷氨酰胺）。</li>
	<li>将原代胰岛转移到 15 mL 试管中，并在组织培养罩下执行以下所有假胰岛形成步骤，以防止污染。在室温下用P1000移液管在0.025%胰蛋白酶中缓慢解离原发胰岛7分钟。当胰岛开始分裂时，溶液将变得不透明。<ol><li>对于这些研究，将 200-300 个直径约为 200 μm 的人工挑选的原代胰岛分散在 500 μL 的 0.025% 胰蛋白酶中，产生 1 至 2 个 96 孔板的假胰岛;确切的数量可能因平均胰岛大小和活力而异。对于 >500 个原代胰岛，以 1：1 的比例增加 0.025% 胰蛋白酶的体积（例如，600 个手工挑选的胰岛使用 600 μL 0.025% 胰蛋白酶）。</li>
	</ol></li>
	<li>通过添加相当于所用胰蛋白酶体积的范德比尔特假胰岛培养基（VPM）来淬灭分散体。然后，用 1 mL VPM 洗涤两次。对于洗涤，在台式离心机中，在4°C下以485× g 离心分散的细胞2-3分钟。将细胞重悬于规定体积的 VPM（通常为 1 mL）中进行计数。 注：假胰岛生成和 VPM 组成详见先前的出版物7。简而言之，VPM 包含等体积的富集 CMRL 培养基（20% FBS、100 μg/mL 链霉素、100 U/mL 青霉素、1 mM 丙酮酸钠、2 mM Glutamax、CMRL 1066 中的 2 mM HEPES）和 iEC 培养基（VEGF 培养基完整试剂盒减去 FBS + 1 瓶内皮细胞培养基添加剂）。假胰岛生成的摘要示意图包括 在图1A中。</li>
	<li>通过将 10 μL 台盼蓝与 10 μL 细胞悬液混合，使用自动细胞计数仪确定细胞计数和活力。充分混合细胞悬液以确保准确的细胞计数。</li>
	<li>计算所需数量的假胰岛所需的细胞悬液、病毒和 VPM 的体积。所有计算基于步骤1.4中获得的活细胞计数。<ol><li>对于这些研究，用 Ad-CMV-cADDis 以 500 μL 的总体积转导 MOI 500 （N = 1） 或 1,000 （N = 2） 分散的人胰岛细胞。一板转导的假胰岛（2,000 个细胞/假胰岛）每个供体产生 3 个技术重复（32 个假胰岛/实验）。腺病毒是在这项工作中商业获得的。</li>
	</ol></li>
	<li>将计算出的细胞悬液、病毒和 VPM 量合并到 1.5 mL 试管中。通过上下移液轻轻混合内容物。</li>
	<li>在转导过程中，用开口盖孵育试管，并用无菌培养皿在37°C和5%CO 2 / 95%空气的组织培养箱中覆盖2小时。</li>
	<li>向每个试管中加入500μL VPM，并通过在4°C下以500× g 离心3分钟来洗涤细胞。 再完成两次洗涤，总共洗涤三次。吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL VPM 中。</li>
	<li>计算总细胞接种体积（200μL/假胰岛）。将 VPM（计算出的细胞接种体积减去 2 mL）加入适当大小的锥形管中。将步骤1.7中转导的细胞悬液加入锥形管中。保持锥形管略微关闭，但不要紧闭，以允许细胞进行空气交换。</li>
	<li>用 1 mL VPM 冲洗 1.5 mL 管（从步骤 1.7 开始），并将内容物转移到锥形管中，此时锥形管应包含总细胞接种体积。</li>
	<li>用电动血清移液管上下移液，将锥形管的内容物充分混合，然后将内容物转移到无菌试剂储液器中。如果储液槽不能容纳整个细胞接种体积，则进行连续转移，并确保悬浮液在每个步骤中都充分混合。</li>
	<li>使用多通道P200移液器，将试剂储液槽中的细胞悬液上下移液3-4次以确保均一性，然后将200μL细胞悬液移液到微孔板的每个孔中。</li>
	<li>将假胰岛在37°C和5%CO2 / 95%空气的组织培养箱中孵育6天，不更换培养基。到第6天，假胰岛应完全形成并准备好进行实验（图1B-D）。</li>
</ol>2.活细胞成像和微观灌注的准备（实验前1天）
注：有关微量灌注培养基制备的信息可通过 protocols.io 资源（https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html）获得。
<ol><li>使用多通道移液器收集假胰岛，将它们从96孔板转移到无菌培养皿中。然后，手工挑选假胰岛，并将它们转移到另一个含有新鲜VPM的无菌培养皿中。让假胰岛在37°C和5%CO2 / 95%空气下的组织培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>通过将 1 g BSA（放射免疫测定级）、0.11 g 丙酮酸钠、0.58 g L-谷氨酰胺、3.2 g 碳酸氢钠、1.11 g HEPES 和 1 瓶 DMEM 加入 1 L 超纯水中来制备 1 L DMEM。在DMEM中制备1M葡萄糖储备溶液。将两种溶液保持在4°C过夜。</li>
	<li>在实验前一天检查微量灌注系统的流量。将所有管道连接到装有空微芯片的芯片支架上，如图 2A-B 所示。使用超纯水作为流出物，以确认馏分收集器的流速为 100 μL/min。</li>
</ol>3. 在DMEM中添加促分泌剂（实验当天）
<ol><li>向DMEM中加入0.07mg / mL抗坏血酸，并使用1M葡萄糖储备液在DMEM +抗坏血酸缓冲液中制备促分泌剂。 注意：抗坏血酸用于通过防止肾上腺素氧化来稳定肾上腺素。如果不使用肾上腺素，则可以在 DMEM 中省略抗坏血酸。</li>
	<li>通过0.22μm孔过滤器过滤促分泌剂两次，每次使用新鲜过滤器。将溶液加热至37°C， 并通过 血糖仪测量葡萄糖以确认所需浓度。</li>
</ol>4. 微腹膜装置设置
<ol><li>将共聚焦激光扫描显微镜的环境室加热至37°C，确保所有门都关闭并且室保持稳定的温度。将装有微芯片的芯片支架放入腔室中预热。用红外线枪验证芯片温度。 注意：在这种情况下，环境室设置为 38.5 °C，允许芯片达到 37 °C。</li>
	<li>将所有管道连接到芯片座（如图 2A-B 所示）。与基线促泌素齐平 5 分钟。在这项研究中，用 2 mM 葡萄糖 （G 2） 冲洗管路。每 8-10 次实验更换一次除泡器的气泡捕集膜。</li>
</ol>5. 将假胰岛加载到微芯片中
<ol><li>在加载微芯片之前，拍摄假胰岛的明场和暗场图像（10倍放大倍率），该图像将用于实验中，用于胰岛当量（IEQ）的后续定量。 注：IEQ用于将激素分泌标准化为实验中胰岛数量的变化。此步骤也可以在实验前一天完成。</li>
	<li>从微芯片的下半部分和上半部分吸出任何多余的液体。微芯片的上半部分包含垫圈，可确保每个孔的充分密封，而微芯片的下半部分包含附有玻璃盖玻片的孔。用 5 μL DMEM 在微芯片中预润湿一个孔。确保在孔的外边缘周围移液以润湿缝隙。</li>
	<li>使用预润湿的移液器以 23 μL 体积收集 30-32 个假胰岛，并将假胰岛缓慢分配到微芯片底部的孔中心。检查移液器的尖端是否有任何可能已附着的假胰岛。</li>
	<li>使用凝胶加载尖端轻轻地将假胰岛操纵到孔的中心。这确保了在视野中捕获最大数量的假胰岛。</li>
	<li>在立体镜上拍摄微芯片中的假胰岛的图像。此计数将用于调整计算出的 IEQ，以了解在此过程中的任何假胰岛损失。<ol><li>如果步骤 5.3 中的所有假胰岛均未加载到微芯片中，请相应地调整 IEQ。例如，如果现在可视化了 30 个假胰岛，但在步骤 5.1 中可视化了 32 个假胰岛，则计算步骤 5.1 中图像的 IEQ，然后乘以 30/32。</li>
	</ol></li>
	<li>将微芯片底部放入微芯片支架中。小心地将微芯片的顶部放在绿色垫圈面朝下。</li>
	<li>在将微芯片固定到位的同时，轻轻关闭微芯片支架以将微芯片夹在一起。在此过程中尽量不要对微芯片施加过大的压力，因为这样做会置换孔中的流体，并可能导致假胰岛损失。避免将气泡引入井中。</li>
</ol>6. 同步活细胞成像和微观灌注
<ol><li>将支架中的促分泌剂，泵和微芯片转移到安装在共聚焦显微镜上的环境室中。将外排管从腔室引出到馏分收集器。<ol><li>将缓冲液放入 15 mL 锥形管中，并在其盖子上钻出开口。这些孔可防止收集管从管中漂移出来。</li>
		<li>将管子拧入除泡器时，将螺母和套圈分开，然后拧入除泡器。这样可以防止线条扭曲。</li>
	</ol></li>
	<li>将馏分收集器设置为每 2 分钟旋转一次。将适当数量的试管装入馏分收集器中，考虑洗涤和实验馏分。对于这些实验，使用了 15 个洗涤管（总洗涤 30 分钟）和 28 个用于馏分收集的管。</li>
	<li>启动泵以 100 μL/min 的速度输送基线培养基（包含基线葡萄糖浓度）（以 100 μL/min 流速收集 2 分钟，每个馏分管产生 200 μL 流出物）。选择这种流速是为了限制假胰岛上的纯粹压力，并防止在实时成像过程中出现明显的假胰岛移动。<ol><li>当流体流过设备时，请注意以下几点：<ol><li>注意馏分收集器喷口末端的液滴，这些液滴表明流经系统。</li>
			<li>注意系统外排量的减少;如果收集管中有 <200 μL，则表明系统中可能存在堵塞或泄漏。有关出水量减少的潜在原因、解决方案和预防技巧的列表，请参见 表 2 。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>一旦有稳定的介质从外排管流出，旋转馏分收集器头以分配到管中，然后启动馏分收集器。收集前 15 个馏分（30 分钟）作为洗涤液，以使假胰岛平衡。使用前 15 个馏分来确保连续和准确的介质流过系统。之后丢弃这些馏分。</li>
	<li>在30分钟洗涤期间，根据以下参数设置显微镜进行活细胞成像：物镜：U Plan Fluorite 20x，1x变焦;荧光通道：EGFP（发射 = 510 nm，激光波长 = 488，检测波长 = 500-600 nm）;时间序列：在整个实验过程中（即 56 分钟）每 2 秒采集一次图像;采样速度：2 μs/像素。<ol><li>识别视野中假胰岛的底部，并将焦平面调整到该位置上方15μm。这是将在整个成像实验中使用的框架。</li>
	</ol></li>
	<li>30分钟洗涤完成后，开始馏分收集和图像采集。 注意：在此步骤之前，应尽一切努力识别和纠正任何问题。一旦数据收集开始，实验中的任何暂停或过度接触促分泌剂都可能对结果产生不利影响。</li>
	<li>在第一次基线收集期间，继续用基线培养基周灌注假胰岛，将流出物收集到 1.5 mL 管中。当时间适合实验时，用手将管子从基线缓冲液切换到新的刺激缓冲液管。<ol><li>标准微围灌注序列如 表3所示。</li>
		<li>收集~10个馏分后，将所有馏分放入4°C冰箱中直至实验结束，以防止激素，特别是胰高血糖素的降解。</li>
		<li>通过检查每个管中的流出物量，在整个实验过程中继续监测系统流量。</li>
	</ol></li>
	<li>实验完成后，切换回基线培养基，并让泵继续运行5分钟，以用基线培养基（在这种情况下为2mM葡萄糖）洗去刺激物。</li>
	<li>停止泵，并断开除泡器和馏分收集器处的微芯片支架管道，以从环境室中取出微芯片支架。取下微芯片后关闭所有门以保持温度。</li>
	<li>将周融合液储存在-80°C，用于随后的激素分析。</li>
</ol>7.假胰岛酸乙醇萃取
<ol><li>小心地打开微芯片支架并提起微芯片的顶部。使用移液器和台式显微镜从孔中取出假胰岛，并将其转移到 1.5 mL 试管中。如果需要，确保使用台式显微镜收集所有假胰岛。<ol><li>在从孔中取出之前，在微芯片中获取假胰岛的最终图像，以调整胰岛提取物IEQ，类似于步骤5.5。</li>
	</ol></li>
	<li>用 500 μL PBS 洗涤两次。在每次洗涤之间以94× g 旋转假胰岛1分钟，并吸出上清液。</li>
	<li>除去最后一次洗涤液后，加入 200 μL 酸性乙醇（5.5 mL 95% 乙醇 + 50 μL 12 N HCl）。在4°C下储存过夜。</li>
	<li>第二天，将提取物在15,989× g和4°C下旋转10分钟。 将 45 μL 分装到三个新试管中。储存在-80°C用于激素含量分析。作为将激素分泌归一化为IEQ的替代方法，激素分泌也可以归一化为从提取物中测量的假胰岛激素含量。</li>
</ol>8. 额外的实验和清理
<ol><li>对随后的假胰岛组重复步骤5-7，以获得额外的技术重复。</li>
	<li>完成所有微灌注实验后，将 10% 漂白剂通过微芯片和管道运行 5 分钟，然后用超纯水 30 分钟对管道进行消毒。</li>
</ol>9. 数据分析
注：使用激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞成像。使用显微镜相关成像软件包对图像进行分析。以下是一般指南，但可能因显微镜制造商和图像采集软件而异。
<ol><li>确定用于数据规范化的总胰岛当量 （IEQ）<ol><li>打开软件程序，然后单击窗口右上角的“采集”选项卡。通过在宏管理器（“宏管理器”>“视图”工具窗口“中选择”批量烧录“功能>批量刻录所有暗场图像。<ol><li>要一次刻录多个图像，请单击“切换批处理模式”按钮，然后单击“宏管理器”中的“运行”按钮。按照屏幕上的说明为刻录的图像选择源图像位置和目标位置。对于图像文件类型，选择标记的想象文件格式 （*.tif）。</li>
		</ol></li>
		<li>对于 IEQ 测量，打开在步骤 10.1 中拍摄的 5.1 倍暗场图像的刻录版本。单击顶部的“ 计数和测量 ”选项卡，然后选择左侧的 “手动 HSV 阈值 ”按钮。<ol><li>使用滴管功能添加/删除正区域（红色），直到每个假胰岛都以红色突出显示，而不会超出假胰岛边界。单击“ 计数和测量”。</li>
		</ol></li>
		<li>使用自动拆分或手动拆分功能拆分连接在一起的假胰岛。<ol><li>要手动拆分假胰岛，请选择手动拆分功能，单击鼠标左键绘制一条分隔假胰岛的线，然后右键单击以完成该线。要自动拆分，请选择自动拆分功能，然后单击感兴趣的分组假胰岛。之后确认正确的自动拆分。</li>
		</ol></li>
		<li>在批量刻录的图像中，比例尺和放大文本可能被标记为正面。通过使用鼠标突出显示文本和比例尺并按 Delete 键盘键来删除这些对象以获得准确的计数。</li>
		<li>打开和关闭过滤器以确认正在计算所有假胰岛。该文件也可以在程序外部打开以进行交叉引用。完成后，单击 “导出到 Excel”。</li>
		<li>打开电子表格，并按如下方式对其进行修改。<ol><li>删除底部的计数、平均值和排序信息。根据对象的平均直径对对象进行排序。在平均直径后插入一列，并将该列命名为“假胰岛计数”。</li>
			<li>胰岛计数由平均直径在以下每个指数内的假胰岛数量决定。将每个索引的假胰岛数乘以相应的 IEQ 转换因子，并将这些值相加以确定总 IEQ。对每次实验前采集的图像进行IEQ计算。使用以下索引和 IEQ 转换因子： 1-49 μm：× 0.167 50-100 μm：× 0.667 101-150 μm：× 1.685 151-200 μm：× 3.500 201-300 μm：× 6.315 301-350 μm：× 10.352</li>
			<li>有关用于确定 IEQ 计数的电子表格示例，请参阅 补充文件 1。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>软件中的活细胞成像定量<ol><li>在cellSens中打开所需的文件（.oir）。</li>
		<li>按如下方式指定感兴趣区域 （ROI）。<ol><li>使用绘图工具指定 ROI（即每个假胰岛）。如果使用手绘选项，请右键单击以关闭形状。</li>
			<li>通过使用箭头手并拖动它以包含图像中的所有 ROI 来突出显示所有 ROI。突出显示所有 ROI 后，右键单击并选择 “随时间转换为动态 ROI”</li>
			<li>播放 XYT 文件以确认 ROI 随时间推移是否准确。如果 ROI 在特定时间段内不准确，请更正其在该时间段的大小/位置。随着时间的推移，软件将逐渐调整 ROI 的大小/位置以匹配这些变化。重复这些步骤，直到ROI在整个成像实验中准确无误。</li>
		</ol></li>
		<li>对每个 ROI 执行强度测量，如下所示。<ol><li>在工具栏中，单击 “测量强度曲线”。突出显示要分析的投资回报率;使用 Shift + 单击选择多个 ROI。 注意：虽然在软件中一次可以打开多个文件，但一次只能分析一个文件的投资回报率。</li>
			<li>要考虑背景噪声，请选择一个常量值以从每个强度值中减去，或指定一个 ROI 作为背景。单击 “执行”。</li>
			<li>在 “强度配置文件 ”工具栏中，单击 “导出到 Excel ”以导出数据。</li>
			<li>将所有数据点归一化为从7-8分钟（即第一个基线培养基围灌注的最后一分钟）测量的强度的平均值。每个时间点的这些归一化值被定义为相对 cADDis 强度。有关成像数据分析和归一化的电子表格示例，请参阅 补充文件 2。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>测量每个馏分和胰岛提取物中的激素分泌。在这些实验中，通过ELISA测量胰岛素和胰高血糖素浓度。使用步骤9.1中确定的IEQ测量值或通过提取物激素含量将每个级分中的激素分泌归一化为假胰岛体积。</li>
</ol>

人假胰岛的细胞内信号转导事件和激素分泌

<ol>
	<li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+systemic+insulin+function.">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li><li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells.">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li><li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. 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S., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triggering+pathway+to+insulin+secretion:+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+&#946;+cells+and+their+translational+relevance.">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse &#946; cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

微潜灌系统、表达生物传感器的假胰岛和激光扫描共聚焦显微镜的集成允许同步评估细胞内信号转导事件和动态激素分泌谱。动态微周灌注系统可以向假胰岛提供一系列明确的刺激，并允许收集流出物，其中胰岛素和胰高血糖素浓度可以通过市售的ELISA测量。同时，通过共聚焦显微镜平台对表达生物传感器的假胰岛进行活细胞成像，捕获实时生物传感器荧光活性，从而提供有关细胞内信号转导事?...

朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的微型器官，其功能对于维持葡萄糖稳态至关重要。胰岛素是在葡萄糖代谢、ATP/ADP 比值增加、ATP 敏感钾通道关闭、质膜去极化和细胞外钙流入后从 β 细胞分泌的1。α 细胞分泌胰高血糖素知之甚少，但据推测，细胞内和旁分泌途径有助于胰高血糖素颗粒胞吐作用 2,3,4。1 型和 2 型糖尿病都与胰岛细胞功能障碍有关 5,6,7。因此，阐明介导胰岛激素分泌的细胞内信号通路对于理解胰岛的生理和病理机制至关重要。
胰岛的球形结构给实验带来了一定的障碍。这些挑战包括胰岛大小变化和胰岛的 3D 性质，这会减少胰岛核心内的病毒转导 8,9。为了克服这些挑战，开发了一种假胰岛系统，其中原代人类胰岛分散到单个细胞中，用编码目标靶标的构建体进行腺病毒转导，并重新聚集以形成大小可控的胰岛样结构，称为假胰岛7。与平行培养的来自同一供体的天然胰岛相比，这些假胰岛在形态、内分泌细胞组成和激素分泌方面相似7。该方法允许在整个假胰岛中表达构建体，这意味着它克服了先前对原代人类胰岛进行统一遗传操作的障碍7,8,9。
在该协议中，假胰岛系统与微流控装置集成，以在原代人胰岛细胞中表达生物传感器，并在动态围灌注期间获得假胰岛激素分泌的时间分辨率10,11,12。将假胰岛置于微芯片中，并通过蠕动泵12暴露于稳定流的不同促分泌剂中。该微芯片具有透明的玻璃底部，并安装在共聚焦显微镜上，以通过生物传感器荧光强度的变化来记录细胞内信号传导动力学。生物传感器成像与微过周灌注流出物的收集同步，用于随后分析胰岛素和胰高血糖素分泌7。与大腹膜融合相比，由于与大腹膜腔相比，微流控装置的体积较小，因此这种微腹膜灌注方法允许使用更少的假胰岛7。
为了利用该系统的实用性，在人假胰岛中表达环磷酸腺苷 （cAMP） 原位差异检测 器 （ cADDis） 生物传感器，以评估 cAMP 动力学和激素分泌。cADDis 生物传感器由环状置换绿色荧光蛋白 （cpGFP） 组成，该荧光蛋白位于由 cAMP 2 （EPAC2） 激活的交换蛋白的铰链区域，连接其调节和催化区域。cAMP 与 EPAC2 调控区的结合会引起铰链区域的构象变化，从而增加 cpGFP13 的荧光。细胞内信使（如 cAMP）在上游激活 G 蛋白偶联受体后引发胰岛素和胰高血糖素分泌14。活细胞成像与微腹膜融合相结合，有助于将细胞内 cAMP 动力学与胰岛激素分泌联系起来。具体来说，在该协议中，产生表达cADDis的假胰岛以监测α和β细胞对各种刺激的cAMP反应：低葡萄糖（2mM葡萄糖;G 2）、高葡萄糖加异丁基甲基黄嘌呤（IBMX;20 mM 葡萄糖 + 100 μM IBMX;G 20 + IBMX）和低葡萄糖加肾上腺素（Epi;2 mM葡萄糖+ 1μM Epi;G 2 + Epi）。该治疗工作流程允许 通过 1） IBMX 介导的磷酸二酯酶抑制（通过防止其降解来增强细胞内 cAMP 水平）和 2） 肾上腺素（一种已知的 cAMP 依赖性刺激剂）来评估细胞内 cAMP 动力学，该刺激剂由 β-肾上腺素能受体激活介导。下面详细介绍了设置用于活细胞成像实验的微周灌注装置的步骤，将假胰岛加载到微芯片中，同步活细胞成像和微周灌注，以及通过基于微孔板的激素测定分析生物传感器痕迹和激素分泌。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad-CMV-cADDis</td>
			<td>Welgen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.01&#8221; FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1527L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL and conical tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;m PTFE filter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-21940-41</td>
			<td>Change every 8-10 runs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2816</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap&#160;</td>
			<td>Omnifit</td>
			<td>006BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier ULA&#160;96-well Microplates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v3.1</td>
			<td>Software used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL 1066</td>
			<td>MediaTech&#160;</td>
			<td>15-110-CV</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>P-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>okolab</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinepherine (Epi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4250</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1281-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon Kit HTRF</td>
			<td>Cisbio</td>
			<td>62CGLPEH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (12N)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7523</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cell Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex Derlin nut &#38; ferrule 1/4-24</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-00414-LW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylonine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip (University of Miami, FP-3W)</td>
			<td>University of Miami</td>
			<td>FP-3W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip holder&#160;</td>
			<td>Micronit Microfluidics</td>
			<td>FC_PRO_CH4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10, P200, and P1000 pipets and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>P720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>depends on dish diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td>&#160;DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filter all buffers twice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pseudoislet system for synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and hormone secretory profiles

朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的特化内分泌和支持细胞的小型 3D 集合，通过降低血糖的 β 细胞分泌胰岛素和升高血糖的 α 细胞分泌胰高血糖素，在控制葡萄糖稳态方面发挥着核心作用。细胞内信号通路，包括由cAMP介导的信号通路，是调节α和β细胞激素分泌的关键。3D胰岛结构虽然对协调胰岛功能至关重要，但对原代人胰岛细胞细胞内信号通路的机制研究提出了实验挑战。为了克服这些挑战和局限性，该协议描述了一个集成的活细胞成像和微流体平台，该平台使用由非糖尿病供体产生的原代人假胰岛，其形态，组成和功能类似于天然胰岛。这些假胰岛通过原代人胰岛细胞的分散和再聚集过程进行大小控制。在分散状态下，胰岛细胞基因表达可以纵;例如，可以引入生物传感器，例如基因编码的cAMP生物传感器cADDis。一旦形成，表达基因编码生物传感器的假胰岛，结合共聚焦显微镜和微周灌注平台，可以同步评估荧光生物传感器动力学以及 α 和 β 细胞激素分泌谱，以更深入地了解细胞过程和功能。

The islets of Langerhans are mini organs scattered throughout the pancreas whose function is crucial for the maintenance of glucose homeostasis. Insulin is secreted from beta cells following the metabolism of glucose, an increase in the ATP/ADP ratio, the closure of ATP-sensitive potassium channels, depolarization of the plasma membrane, and the influx of extracellular calcium1. Glucagon secretion from alpha cells is less understood, but it has been postulated that intracellular and paracrine pathways contribute to glucagon granule exocytosis2,3,4. Both type 1 and type 2 diabetes are associated with islet cell dysfunction5,6,7. Therefore, elucidating the intracellular signaling pathways mediating islet hormone secretion is essential for understanding physiologic and pathologic mechanisms in pancreatic islets.
The spherical architecture of islets presents certain obstacles to experimentation. These challenges include islet size variation and the 3D nature of islets, which reduces viral transduction within the islet core8,9. To overcome these challenges, a pseudoislet system was developed, in which primary human islets are dispersed into single cells, adenovirally transduced with constructs encoding targets of interest, and reaggregated to form size-controlled, islet-like structures termed pseudoislets7. Compared to native islets from the same donor that have been cultured in parallel, these pseudoislets are similar in morphology, endocrine cell composition, and hormone secretion7. This method allows for the expression of constructs throughout the pseudoislet, meaning it overcomes a previous barrier to the uniform genetic manipulation of primary human islets7,8,9.
In this protocol, the pseudoislet system is integrated with a microfluidic device to express biosensors in primary human islet cells and gain temporal resolution of&#160;pseudoislet hormone secretion during dynamic perifusion10,11,12. The pseudoislets are placed in a microchip and exposed to a steady flow of different secretagogues via a peristaltic pump12. The microchip has a transparent glass bottom and is mounted on a confocal microscope to record the intracellular signaling dynamics via changes in the biosensor fluorescence intensity. Biosensor imaging is synchronized with the collection of microperifusion effluent for the subsequent analysis of insulin and glucagon secretion7. Compared to macroperifusion, this microperifusion approach allows for fewer pseudoislets to be used due to the smaller volume of the microfluidic device compared to the macroperifusion chamber7.
To harness the utility of this system, the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) difference detector in situ (cADDis) biosensor was expressed in human pseudoislets to assess cAMP dynamics and hormone secretion. The cADDis biosensor is composed of a circularly permuted green fluorescent protein (cpGFP) positioned in the hinge region of an exchange protein activated by cAMP 2 (EPAC2), connecting its regulatory and catalytic regions. The binding of cAMP to the regulatory region of EPAC2 elicits a conformational change in the hinge region that increases fluorescence from the cpGFP13. Intracellular messengers such as cAMP elicit insulin and glucagon secretion after the upstream activation of G-protein coupled receptors14. Live-cell imaging coupled with microperifusion helps to connect the intracellular cAMP dynamics with islet hormone secretion. Specifically, in this protocol, cADDis-expressing pseudoislets are generated to monitor cAMP responses in alpha and beta cells to various stimuli: low glucose (2 mM glucose; G 2), high glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 &#181;M IBMX; G 20 + IBMX), and low glucose plus epinephrine (Epi; 2 mM glucose + 1 &#181;M Epi; G 2 + Epi). This treatment workflow allows for the assessment of the intracellular cAMP dynamics directly via 1) IBMX-mediated phosphodiesterase inhibition, which enhances intracellular cAMP levels by preventing its degradation, and 2) epinephrine, a known cAMP-dependent stimulator of alpha cell glucagon secretion mediated by &#946;-adrenergic receptor activation. The steps for setting up the microperifusion apparatus for live-cell imaging experiments, the loading of the pseudoislets into the microchip, synchronous live-cell imaging and microperifusion, and the analysis of the biosensor traces and hormone secretion by microplate-based hormone assays are detailed below.

作者聚焦：使用 Pseudoislet 方案研究胰岛异常和功能 

用于同步评估荧光生物传感器动力学和激素分泌谱的人假胰岛系统

通过编码cAMP生物传感器cADDis的构建体的腺病毒递送产生表达生物传感器的人类假胰岛（图1A）。图 1B 显示了转导的人胰岛细胞随时间推移的重新聚集，培养 6 天后观察到完全形成的假胰岛。细胞在48小时内开始显示可见的cADDis荧光，并且在培养期结束时转导的细胞中生物传感器表达较高。使用该方案，假胰岛在α细胞中的平均转导效率为60%，在β...

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该协议描述了一种使用环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器，cAMP原 位 差异检测器（cADDis）和微灌注系统的腺病毒递送，通过原代人假胰岛同步获取和共同注册细胞内信号转导事件以及胰岛素和胰高血糖素分泌的方法。

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

我们的实验室正在努力了解、预防和逆转 1 型和 2 型糖尿病的 β 细胞功能障碍和其他眼睑异常。我们的研究重点是通过整合人类胰腺和眼睑生物学以及健康和疾病的研究来研究人类糖尿病的发病机制。人类孔眼是3D球形结构，在整个孔眼中访问细胞会带来一些实验挑战。例如，当尝试引入生物传感器来理解孔眼细胞信号传导时，我们的假眼睑方案通过在单细胞状态下进行遗传操作并将这些转导的人眼细胞聚集到假眼睑中以进行下游研究来克服这一挑战。我们的假眼睑系统使我们能够在整个孔眼中表达生物传感器，而不仅仅是眼睑表面。结合我们的活细胞成像和微灌注系统，我们可以测量和共同注册动态细胞内过程与下游激素分泌。该协议可用于回答各种重要的科学问题。例如，基因沉默策略可以与这种方法相结合，以了解目标基因对眼睑功能和相关信号通路的影响，无论是全局还是以自我特异性方式。

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

1.4K 次观看.  Vanderbilt University School of Medicine. 我们的实验室正在努力了解、预防和逆转 1 型和 2 型糖尿病的 β 细胞功能障碍和其他眼睑异常。我们的研究重点是通过整合人类胰腺和眼睑生物学以及健康和疾病的研究来研究人类糖尿病的发病机制。人类孔眼是3D球形结构，在整个孔眼中访问细胞会带来一些实验挑战。例如，当尝试引入生物传感器来理解孔眼细胞信号传导时，我们的假眼睑方案通过在单细胞状态下进?...

视频: 作者聚焦：使用 Pseudoislet 方案研究胰岛异常和功能 

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.