Organ bağışçıları ve aileleri paha biçilmez bağışları için takdir edilmektedir ve Uluslararası Organ Tedarik Organizasyonları Enstitüsü, Tıbbın İlerlemesi (IIAM) ve Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi (NDRI), insan pankreas dokusunu araştırma için erişilebilir hale getirme konusundaki ortaklıkları için kabul edilmektedir. Bu çalışma, İnsan Adacık Araştırma Ağı (RRID:SCR_014393), İnsan Pankreas Analiz Programı (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ve DK20593 (Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi), Leona M. ve Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, ABD Gazi İşleri Bakanlığı (BX000666), Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu (1937963) NIGMS.

İnsan Psödoisletlerinde Hücre İçi Sinyalleşme Olayları ve Hormon Salgılanması

<ol>
	<li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+systemic+insulin+function.">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li><li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells.">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li><li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+islet+glucagon+secretion:+Beyond+calcium.">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li><li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Halban, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-cell+failure+in+type+2+diabetes:+Postulated+mechanisms+and+prospects+for+prevention+and+treatment.">&#946;-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;+cell+function+and+gene+expression+are+compromised+in+type+1+diabetes.">&#945; cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes.</a> Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).</li><li>Walker, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+human+pseudoislet+system+and+microfluidic+platform+demonstrate+differences+in+GPCR+signaling+in+islet+cells.">Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells.</a> JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).</li><li>Giannoukakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+intact+human+islets+by+a+lentiviral+vector.">Infection of intact human islets by a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).</li><li>Curran, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+pancreatic+islets+by+feline+immunodeficiency+virus+vectors1.">Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1.</a> Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).</li><li>Kayton, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles.">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li><li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resealable,+optically+accessible,+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets.">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li><li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories.">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li><li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+&#946;-cell.">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic &#946;-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li><li>Klemen, M. S., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triggering+pathway+to+insulin+secretion:+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+&#946;+cells+and+their+translational+relevance.">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse &#946; cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bir mikroperifüzyon sisteminin, biyosensör eksprese eden psödoadacıkların ve lazer taramalı konfokal mikroskopinin entegrasyonu, hücre içi sinyal olaylarının ve dinamik hormon salgı profillerinin senkronize değerlendirmesine izin verir. Dinamik mikroperifüzyon sistemi, psödoisletlere bir dizi iyi tanımlanmış uyaran iletebilir ve insülin ve glukagon konsantrasyonlarının ticari olarak temin edilebilen ELISA ile ölçülebildiği atık suyun toplanmasına izin verir. Aynı zamanda, bir konfokal mikroskop...

Langerhans adacıkları, işlevi glikoz homeostazının sürdürülmesi için çok önemli olan pankreas boyunca dağılmış mini organlardır. İnsülin, glikoz metabolizmasını, ATP/ADP oranındaki artışı, ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının kapanmasını, plazma zarının depolarizasyonunu ve hücre dışı kalsiyum1 akışını takiben beta hücrelerinden salgılanır. Alfa hücrelerinden glukagon sekresyonu daha az anlaşılmıştır, ancak hücre içi ve parakrin yolların glukagon granül ekzositozunakatkıda bulunduğu varsayılmıştır 2,3,4. Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet, adacık hücresi disfonksiyonu ile ilişkilidir 5,6,7. Bu nedenle, pankreas adacıklarında adacık hormonu sekresyonuna aracılık eden hücre içi sinyal yolaklarının aydınlatılması, fizyolojik ve patolojik mekanizmaların anlaşılması için gereklidir.
Adacıkların küresel mimarisi, deney için bazı engeller sunar. Bu zorluklar arasında adacık boyutu varyasyonu ve adacıkların 3 boyutlu doğası yer alır, bu da adacık çekirdeği 8,9 içindeki viral iletimi azaltır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil insan adacıklarının tek hücrelere dağıldığı, ilgilenilen hedefleri kodlayan yapılarla adenoviral olarak dönüştürüldüğü ve psödoadacıklar7 olarak adlandırılan boyut kontrollü, adacık benzeri yapılar oluşturmak üzere yeniden toplandığı bir psödoislet sistemi geliştirilmiştir. Paralel olarak kültürlenen aynı donörden alınan doğal adacıklarla karşılaştırıldığında, bu psödoadacıklar morfoloji, endokrin hücre bileşimi ve hormon sekresyonu bakımından benzerdir7. Bu yöntem, psödoadacık boyunca yapıların ifadesine izin verir, yani birincil insan adacıklarının tek tip genetik manipülasyonunakarşı önceki bir engelin üstesinden gelir 7,8,9.
Bu protokolde, psödoislet sistemi, primer insan adacık hücrelerinde biyosensörleri eksprese etmek ve dinamik perifüzyon sırasında psödoislet hormonu sekresyonunun zamansal çözünürlüğünü kazanmak için bir mikroakışkan cihaz ile entegre edilmiştir10,11,12. Psödoadacıklar bir mikroçip içine yerleştirilir ve peristaltik bir pompa12 aracılığıyla farklı sekretagogların sabit akışına maruz bırakılır. Mikroçip şeffaf bir cam tabana sahiptir ve biyosensör floresan yoğunluğundaki değişiklikler yoluyla hücre içi sinyal dinamiklerini kaydetmek için konfokal bir mikroskop üzerine monte edilmiştir. Biyosensör görüntüleme, insülin ve glukagon sekresyonunun müteakip analizi için mikroperifüzyon atık suyunun toplanmasıyla senkronize edilir7. Makroperifüzyon ile karşılaştırıldığında, bu mikroperifüzyon yaklaşımı, makroperifüzyon odasına kıyasla mikroakışkan cihazın daha küçük hacmi nedeniyle daha az psödoadacık kullanılmasına izin verir7.
Bu sistemin faydasından yararlanmak için, cAMP dinamiklerini ve hormon sekresyonunu değerlendirmek için insan psödoisletlerinde siklik adenozin monofosfat (cAMP) fark dedektörü in situ (cADDis) biyosensörü eksprese edildi. cADDis biyosensörü, düzenleyici ve katalitik bölgelerini birbirine bağlayan, cAMP 2 (EPAC2) tarafından aktive edilen bir değişim proteininin menteşe bölgesine yerleştirilmiş dairesel olarak permütasyonlu bir yeşil floresan proteinden (cpGFP) oluşur. cAMP'nin EPAC2'nin düzenleyici bölgesine bağlanması, menteşe bölgesinde cpGFP13'ten floresansı artıran konformasyonel bir değişiklik ortaya çıkarır. cAMP gibi hücre içi haberciler, G-proteinine bağlı reseptörlerin yukarı akış aktivasyonundan sonra insülin ve glukagon sekresyonunu ortaya çıkarır14. Mikroperifüzyon ile birleştirilmiş canlı hücre görüntüleme, hücre içi cAMP dinamiklerini adacık hormonu sekresyonu ile ilişkilendirmeye yardımcı olur. Spesifik olarak, bu protokolde, alfa ve beta hücrelerinde çeşitli uyaranlara cAMP yanıtlarını izlemek için cADDis eksprese eden psödoisletler üretilir: düşük glikoz (2 mM glikoz; G 2), yüksek glikoz artı izobütilmetilksantin (IBMX; 20 mM glikoz + 100 μM IBMX; G20 + IBMX) ve düşük glukoz artı epinefrin (Epi; 2 mM glukoz + 1 μM Epi; G2 + Epi). Bu tedavi iş akışı, hücre içi cAMP dinamiklerinin doğrudan 1) bozulmasını önleyerek hücre içi cAMP seviyelerini artıran IBMX aracılı fosfodiesteraz inhibisyonu ve 2) β-adrenerjik reseptör aktivasyonunun aracılık ettiği alfa hücresi glukagon sekresyonunun bilinen bir cAMP'ye bağlı uyarıcısı olan epinefrin aracılığıyla değerlendirilmesine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme deneyleri için mikroperifüzyon aparatının kurulması, psödoisletlerin mikroçipe yüklenmesi, senkron canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon ve mikroplaka bazlı hormon tahlilleri ile biyosensör izlerinin ve hormon sekresyonunun analizi için adımlar aşağıda detaylandırılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad-CMV-cADDis</td>
			<td>Welgen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.01&#8221; FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1527L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL and conical tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;m PTFE filter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-21940-41</td>
			<td>Change every 8-10 runs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2816</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap&#160;</td>
			<td>Omnifit</td>
			<td>006BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier ULA&#160;96-well Microplates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v3.1</td>
			<td>Software used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL 1066</td>
			<td>MediaTech&#160;</td>
			<td>15-110-CV</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>P-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>okolab</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinepherine (Epi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4250</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1281-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon Kit HTRF</td>
			<td>Cisbio</td>
			<td>62CGLPEH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (12N)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7523</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cell Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex Derlin nut &#38; ferrule 1/4-24</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-00414-LW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylonine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip (University of Miami, FP-3W)</td>
			<td>University of Miami</td>
			<td>FP-3W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip holder&#160;</td>
			<td>Micronit Microfluidics</td>
			<td>FC_PRO_CH4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10, P200, and P1000 pipets and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>P720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>depends on dish diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td>&#160;DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filter all buffers twice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pseudoislet system for synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and hormone secretory profiles

Pankreas boyunca serpiştirilmiş özel endokrin ve destekleyici hücrelerin küçük 3D koleksiyonları olan Langerhans'ın pankreas adacıkları, kan şekerini düşüren beta hücreleri tarafından insülin salgılanması yoluyla glikoz homeostazının kontrolünde merkezi bir role sahiptir ve glukagon, kan şekerini yükselten alfa hücreleri tarafından. cAMP'nin aracılık ettiği hücreler de dahil olmak üzere hücre içi sinyal yolları, düzenlenmiş alfa ve beta hücre hormonu sekresyonu için anahtardır. 3D adacık yapısı, koordineli adacık işlevi için gerekli olmakla birlikte, birincil insan adacık hücrelerinde hücre içi sinyal yollarının mekanik çalışmaları için deneysel zorluklar sunar. Bu zorlukların ve sınırlamaların üstesinden gelmek için bu protokol, morfolojileri, bileşimleri ve işlevleri bakımından doğal adacıklara benzeyen, diyabeti olmayan donörlerden üretilen birincil insan psödoisletlerini kullanan entegre bir canlı hücre görüntüleme ve mikroakışkan platformunu tanımlar. Bu psödoadacıklar, birincil insan adacık hücrelerinin dağılma ve yeniden toplanma süreci yoluyla boyut kontrollüdür. Dağınık durumda, adacık hücresi gen ekspresyonu manipüle edilebilir; örneğin, genetik olarak kodlanmış cAMP biyosensörü, cADDis gibi biyosensörler tanıtılabilir. Bir kez oluşturulduktan sonra, genetik olarak kodlanmış bir biyosensörü ifade eden psödo-adacıklar, konfokal mikroskopi ve bir mikroperifüzyon platformu ile birlikte, hücresel süreçler ve işlev hakkında daha fazla bilgi sağlamak için floresan biyosensör dinamiklerinin ve alfa ve beta hücre hormonu salgı profillerinin eşzamanlı değerlendirmesine izin verir.

The islets of Langerhans are mini organs scattered throughout the pancreas whose function is crucial for the maintenance of glucose homeostasis. Insulin is secreted from beta cells following the metabolism of glucose, an increase in the ATP/ADP ratio, the closure of ATP-sensitive potassium channels, depolarization of the plasma membrane, and the influx of extracellular calcium1. Glucagon secretion from alpha cells is less understood, but it has been postulated that intracellular and paracrine pathways contribute to glucagon granule exocytosis2,3,4. Both type 1 and type 2 diabetes are associated with islet cell dysfunction5,6,7. Therefore, elucidating the intracellular signaling pathways mediating islet hormone secretion is essential for understanding physiologic and pathologic mechanisms in pancreatic islets.
The spherical architecture of islets presents certain obstacles to experimentation. These challenges include islet size variation and the 3D nature of islets, which reduces viral transduction within the islet core8,9. To overcome these challenges, a pseudoislet system was developed, in which primary human islets are dispersed into single cells, adenovirally transduced with constructs encoding targets of interest, and reaggregated to form size-controlled, islet-like structures termed pseudoislets7. Compared to native islets from the same donor that have been cultured in parallel, these pseudoislets are similar in morphology, endocrine cell composition, and hormone secretion7. This method allows for the expression of constructs throughout the pseudoislet, meaning it overcomes a previous barrier to the uniform genetic manipulation of primary human islets7,8,9.
In this protocol, the pseudoislet system is integrated with a microfluidic device to express biosensors in primary human islet cells and gain temporal resolution of&#160;pseudoislet hormone secretion during dynamic perifusion10,11,12. The pseudoislets are placed in a microchip and exposed to a steady flow of different secretagogues via a peristaltic pump12. The microchip has a transparent glass bottom and is mounted on a confocal microscope to record the intracellular signaling dynamics via changes in the biosensor fluorescence intensity. Biosensor imaging is synchronized with the collection of microperifusion effluent for the subsequent analysis of insulin and glucagon secretion7. Compared to macroperifusion, this microperifusion approach allows for fewer pseudoislets to be used due to the smaller volume of the microfluidic device compared to the macroperifusion chamber7.
To harness the utility of this system, the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) difference detector in situ (cADDis) biosensor was expressed in human pseudoislets to assess cAMP dynamics and hormone secretion. The cADDis biosensor is composed of a circularly permuted green fluorescent protein (cpGFP) positioned in the hinge region of an exchange protein activated by cAMP 2 (EPAC2), connecting its regulatory and catalytic regions. The binding of cAMP to the regulatory region of EPAC2 elicits a conformational change in the hinge region that increases fluorescence from the cpGFP13. Intracellular messengers such as cAMP elicit insulin and glucagon secretion after the upstream activation of G-protein coupled receptors14. Live-cell imaging coupled with microperifusion helps to connect the intracellular cAMP dynamics with islet hormone secretion. Specifically, in this protocol, cADDis-expressing pseudoislets are generated to monitor cAMP responses in alpha and beta cells to various stimuli: low glucose (2 mM glucose; G 2), high glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 &#181;M IBMX; G 20 + IBMX), and low glucose plus epinephrine (Epi; 2 mM glucose + 1 &#181;M Epi; G 2 + Epi). This treatment workflow allows for the assessment of the intracellular cAMP dynamics directly via 1) IBMX-mediated phosphodiesterase inhibition, which enhances intracellular cAMP levels by preventing its degradation, and 2) epinephrine, a known cAMP-dependent stimulator of alpha cell glucagon secretion mediated by &#946;-adrenergic receptor activation. The steps for setting up the microperifusion apparatus for live-cell imaging experiments, the loading of the pseudoislets into the microchip, synchronous live-cell imaging and microperifusion, and the analysis of the biosensor traces and hormone secretion by microplate-based hormone assays are detailed below.

Yazar Spotlight: Pseudoislet Protokolü ile Adacık Anormalliklerinin ve İşlevinin Araştırılması 

Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Our lab is working to understand, prevent, and reverse beta cell dysfunction and other eyelid abnormalities in type one and type two diabetes. Our studies focus on the pathogenesis of human diabetes by integrating studies of the human pancreas and eyelid biology and health and disease. Human eyelets are 3D spherical structures, and accessing cells throughout the entire eyelet presents some experimental challenges.For example, when trying to introduce biosensors to understand eyelet cell signaling, our pseudo eyelid protocol overcomes this challenge by performing genetic manipulations in the single cell state and aggregating these transduced human eyelet cells into pseudo eyelids for downstream studies. Our pseudo eyelid system allows us to express biosensors throughout the entire eyelet, rather than just the eyelid surface. Combined with our live cell imaging and Microperfusion System, we can both measure and co-register dynamic intracellular processes with downstream hormone secretion.This protocol could be applied to answer a variety of important scientific questions. For example, gene silencing strategies could be combined with this approach to understand the impact of a gene of interest on eyelid function and associated signaling pathways, either globally or in a self-specific manner.

Biyosensör eksprese eden insan psödoisletleri, cAMP biyosensör cADDis'i kodlayan yapıların adenoviral iletimi yoluyla oluşturuldu (Şekil 1A). Şekil 1B, 6 günlük kültürden sonra gözlemlenen tam olarak oluşmuş psödoisletler ile transdüksiyona uğramış insan adacık hücrelerinin zaman içinde yeniden toplanmasını göstermektedir. Hücreler 48 saat içinde görünür cADDis floresansı göstermeye başladı ve kültür periyodunun sonu...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol at JoVE.com

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Laboratuvarımız, tip bir ve tip iki diyabette beta hücre disfonksiyonunu ve diğer göz kapağı anormalliklerini anlamak, önlemek ve tersine çevirmek için çalışıyor. Çalışmalarımız, insan pankreas ve göz kapağı biyolojisi ile sağlık ve hastalık çalışmalarını entegre ederek insan diyabetinin patogenezine odaklanmaktadır. İnsan kuşgözü 3D küresel yapılardır ve tüm kuşgözü boyunca hücrelere erişmek bazı deneysel zorluklar sunar.Örneğin, kuşgözü hücresi sinyalini anlamak için biyosensörleri tanıtmaya çalışırken, yalancı göz kapağı protokolümüz, tek hücre durumunda genetik manipülasyonlar gerçekleştirerek ve bu dönüştürülmüş insan kuşgözü hücrelerini sonraki çalışmalar için yalancı göz kapaklarında toplayarak bu zorluğun üstesinden gelir. Yalancı göz kapağı sistemimiz, biyosensörleri sadece göz kapağı yüzeyinden ziyade tüm kuşgözü boyunca ifade etmemizi sağlar. Canlı hücre görüntüleme ve Mikroperfüzyon Sistemimiz ile birlikte, aşağı akış hormon sekresyonu ile dinamik hücre içi süreçleri hem ölçebilir hem de birlikte kaydedebiliriz.Bu protokol, çeşitli önemli bilimsel soruları yanıtlamak için uygulanabilir. Örneğin, gen susturma stratejileri, ilgilenilen bir genin göz kapağı fonksiyonu ve ilişkili sinyal yolları üzerindeki etkisini küresel olarak veya kendine özgü bir şekilde anlamak için bu yaklaşımla birleştirilebilir.

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

1.4K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. Laboratuvarımız, tip bir ve tip iki diyabette beta hücre disfonksiyonunu ve diğer göz kapağı anormalliklerini anlamak, önlemek ve tersine çevirmek için çalışıyor. Çalışmalarımız, insan pankreas ve göz kapağı biyolojisi ile sağlık ve hastalık çalışmalarını entegre ederek insan diyabetinin patogenezine odaklanmaktadır. İnsan kuşgözü 3D küresel yapılardır ve tüm kuşgözü boyunca hücrelere erişmek bazı deneysel zorluklar sunar.Örneğin, kuşgöz...