I donatori di organi e le loro famiglie sono apprezzati per le loro inestimabili donazioni, e l'International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) e il National Disease Research Exchange (NDRI) sono riconosciuti per la loro collaborazione nel rendere il tessuto pancreatico umano accessibile per la ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Rete di Ricerca sulle Isole Umane (RRID:SCR_014393), dal Programma di Analisi del Pancreas Umano (RRID:SCR_016202), dalla DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 e DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), The Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, il Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti (BX000666), il NIGMS del National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 e la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).

Eventi di segnalazione intracellulare e secrezione ormonale in pseudoisole umane

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+islet+glucagon+secretion:+Beyond+calcium.">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li><li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes:+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis.">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li><li>Halban, P. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles.">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function.">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li><li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resealable,+optically+accessible,+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets.">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li><li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories.">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li><li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+&#946;-cell.">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic &#946;-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li><li>Klemen, M. S., Dolen&#353;ek, J., Rupnik, M. S., Sto&#382;er, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triggering+pathway+to+insulin+secretion:+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+&#946;+cells+and+their+translational+relevance.">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse &#946; cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'integrazione di un sistema di microperifusione, di pseudoisolette che esprimono biosensori e di microscopia confocale a scansione laser consente la valutazione sincrona degli eventi di segnalazione intracellulare e dei profili dinamici della secrezione ormonale. Il sistema dinamico di microperifusione è in grado di fornire una serie di stimoli ben definiti alle pseudoisole e consente la raccolta dell'effluente, in cui le concentrazioni di insulina e glucagone possono essere misurate mediante ELISA disponibile in comme...

Le isole di Langerhans sono mini organi sparsi in tutto il pancreas la cui funzione è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio. L'insulina viene secreta dalle cellule beta in seguito al metabolismo del glucosio, all'aumento del rapporto ATP/ADP, alla chiusura dei canali del potassio sensibili all'ATP, alla depolarizzazione della membrana plasmatica e all'afflusso di calcio extracellulare1. La secrezione di glucagone da parte delle cellule alfa è meno compresa, ma è stato ipotizzato che le vie intracellulari e paracrine contribuiscano all'esocitosidei granuli di glucagone 2,3,4. Sia il diabete di tipo 1 che quello di tipo 2 sono associati alla disfunzione delle cellule insulari 5,6,7. Pertanto, chiarire le vie di segnalazione intracellulare che mediano la secrezione dell'ormone insulare è essenziale per comprendere i meccanismi fisiologici e patologici nelle isole pancreatiche.
L'architettura sferica degli isolotti presenta alcuni ostacoli alla sperimentazione. Queste sfide includono la variazione delle dimensioni delle isole e la natura 3D degli isolotti, che riduce la trasduzione virale all'interno del nucleo dell'isolotto 8,9. Per superare queste sfide, è stato sviluppato un sistema di pseudoisole, in cui le isole umane primarie sono disperse in singole cellule, trasdotte adenoviralmente con costrutti che codificano i bersagli di interesse e riaggregate per formare strutture simili a isole di dimensioni controllate, denominate pseudoisole7. Rispetto alle isole native dello stesso donatore che sono state coltivate in parallelo, queste pseudoisole sono simili nella morfologia, nella composizione delle cellule endocrine e nella secrezione ormonale7. Questo metodo consente l'espressione di costrutti in tutto lo pseudoisolotto, il che significa che supera una precedente barriera alla manipolazione genetica uniforme delle isole umane primarie 7,8,9.
In questo protocollo, il sistema delle pseudoisole è integrato con un dispositivo microfluidico per esprimere i biosensori nelle cellule insulari umane primarie e ottenere la risoluzione temporale della secrezione dell'ormone delle pseudoisole durante la perifusione dinamica10,11,12. Le pseudoisole vengono inserite in un microchip ed esposte a un flusso costante di diversi secretagoghi tramite una pompa peristaltica12. Il microchip ha un fondo in vetro trasparente ed è montato su un microscopio confocale per registrare le dinamiche di segnalazione intracellulare attraverso le variazioni dell'intensità di fluorescenza del biosensore. L'imaging con biosensore è sincronizzato con la raccolta dell'effluente di microperifusione per la successiva analisi della secrezione di insulina e glucagone7. Rispetto alla macroperifusione, questo approccio di microperifusione consente di utilizzare un minor numero di pseudoisole a causa del volume inferiore del dispositivo microfluidico rispetto alla camera di macroperifusione7.
Per sfruttare l'utilità di questo sistema, il biosensore del rivelatore di differenza di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) in situ (cADDis) è stato espresso in pseudoisole umane per valutare la dinamica del cAMP e la secrezione ormonale. Il biosensore cADDis è composto da una proteina fluorescente verde permutata circolarmente (cpGFP) posizionata nella regione cerniera di una proteina di scambio attivata da cAMP 2 (EPAC2), collegando le sue regioni regolatorie e catalitiche. Il legame del cAMP alla regione regolatoria di EPAC2 provoca un cambiamento conformazionale nella regione cerniera che aumenta la fluorescenza dal cpGFP13. I messaggeri intracellulari come il cAMP suscitano la secrezione di insulina e glucagone dopo l'attivazione a monte dei recettori accoppiati a proteine G14. L'imaging di cellule vive abbinato alla microperifusione aiuta a collegare la dinamica intracellulare del cAMP con la secrezione dell'ormone insulare. In particolare, in questo protocollo, vengono generate pseudoisole che esprimono cADDis per monitorare le risposte di cAMP nelle cellule alfa e beta a vari stimoli: basso livello di glucosio (2 mM di glucosio; G 2), glucosio alto più isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM di glucosio + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) e basso contenuto di glucosio più adrenalina (Epi; 2 mM di glucosio + 1 μM di Epi; G 2 + Epi). Questo flusso di lavoro di trattamento consente la valutazione della dinamica intracellulare del cAMP direttamente tramite 1) l'inibizione della fosfodiesterasi mediata da IBMX, che migliora i livelli intracellulari di cAMP prevenendone la degradazione, e 2) l'epinefrina, un noto stimolatore cAMP-dipendente della secrezione di glucagone delle cellule alfa mediata dall'attivazione del recettore β-adrenergico. Di seguito sono descritti in dettaglio i passaggi per la configurazione dell'apparato di microperifusione per esperimenti di imaging su cellule vive, il caricamento delle pseudoisole nel microchip, l'imaging sincrono di cellule vive e la microperifusione e l'analisi delle tracce del biosensore e della secrezione ormonale mediante saggi ormonali basati su micropiastre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad-CMV-cADDis</td>
			<td>Welgen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.01&#8221; FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1527L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL and conical tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;m PTFE filter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-21940-41</td>
			<td>Change every 8-10 runs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2816</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap&#160;</td>
			<td>Omnifit</td>
			<td>006BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier ULA&#160;96-well Microplates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v3.1</td>
			<td>Software used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL 1066</td>
			<td>MediaTech&#160;</td>
			<td>15-110-CV</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>P-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>okolab</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinepherine (Epi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4250</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1281-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon Kit HTRF</td>
			<td>Cisbio</td>
			<td>62CGLPEH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (12N)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7523</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cell Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex Derlin nut &#38; ferrule 1/4-24</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-00414-LW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylonine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip (University of Miami, FP-3W)</td>
			<td>University of Miami</td>
			<td>FP-3W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip holder&#160;</td>
			<td>Micronit Microfluidics</td>
			<td>FC_PRO_CH4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10, P200, and P1000 pipets and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>P720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>depends on dish diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td>&#160;DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filter all buffers twice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pseudoislet system for synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and hormone secretory profiles

Le isole pancreatiche di Langerhans, che sono piccole raccolte 3D di cellule endocrine e di supporto specializzate sparse in tutto il pancreas, hanno un ruolo centrale nel controllo dell'omeostasi del glucosio attraverso la secrezione di insulina da parte delle cellule beta, che abbassa la glicemia, e glucagone da parte delle cellule alfa, che aumenta la glicemia. Le vie di segnalazione intracellulare, comprese quelle mediate dal cAMP, sono fondamentali per la secrezione ormonale delle cellule alfa e beta regolata. La struttura delle isole 3D, sebbene essenziale per la funzione coordinata delle isole, presenta sfide sperimentali per gli studi meccanicistici delle vie di segnalazione intracellulare nelle cellule insulari umane primarie. Per superare queste sfide e limitazioni, questo protocollo descrive una piattaforma integrata di imaging per cellule vive e microfluidica che utilizza pseudoisole umane primarie generate da donatori senza diabete che assomigliano alle isole native nella loro morfologia, composizione e funzione. Queste pseudoisole sono di dimensioni controllate attraverso il processo di dispersione e riaggregazione delle cellule insulari umane primarie. Allo stato disperso, l'espressione genica delle cellule insulari può essere manipolata; ad esempio, possono essere introdotti biosensori come il biosensore cAMP geneticamente codificato, cADDis. Una volta formate, le pseudoisole che esprimono un biosensore geneticamente codificato, in combinazione con la microscopia confocale e una piattaforma di microperifusione, consentono la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali delle cellule alfa e beta per fornire maggiori informazioni sui processi e sulla funzione cellulare.

The islets of Langerhans are mini organs scattered throughout the pancreas whose function is crucial for the maintenance of glucose homeostasis. Insulin is secreted from beta cells following the metabolism of glucose, an increase in the ATP/ADP ratio, the closure of ATP-sensitive potassium channels, depolarization of the plasma membrane, and the influx of extracellular calcium1. Glucagon secretion from alpha cells is less understood, but it has been postulated that intracellular and paracrine pathways contribute to glucagon granule exocytosis2,3,4. Both type 1 and type 2 diabetes are associated with islet cell dysfunction5,6,7. Therefore, elucidating the intracellular signaling pathways mediating islet hormone secretion is essential for understanding physiologic and pathologic mechanisms in pancreatic islets.
The spherical architecture of islets presents certain obstacles to experimentation. These challenges include islet size variation and the 3D nature of islets, which reduces viral transduction within the islet core8,9. To overcome these challenges, a pseudoislet system was developed, in which primary human islets are dispersed into single cells, adenovirally transduced with constructs encoding targets of interest, and reaggregated to form size-controlled, islet-like structures termed pseudoislets7. Compared to native islets from the same donor that have been cultured in parallel, these pseudoislets are similar in morphology, endocrine cell composition, and hormone secretion7. This method allows for the expression of constructs throughout the pseudoislet, meaning it overcomes a previous barrier to the uniform genetic manipulation of primary human islets7,8,9.
In this protocol, the pseudoislet system is integrated with a microfluidic device to express biosensors in primary human islet cells and gain temporal resolution of&#160;pseudoislet hormone secretion during dynamic perifusion10,11,12. The pseudoislets are placed in a microchip and exposed to a steady flow of different secretagogues via a peristaltic pump12. The microchip has a transparent glass bottom and is mounted on a confocal microscope to record the intracellular signaling dynamics via changes in the biosensor fluorescence intensity. Biosensor imaging is synchronized with the collection of microperifusion effluent for the subsequent analysis of insulin and glucagon secretion7. Compared to macroperifusion, this microperifusion approach allows for fewer pseudoislets to be used due to the smaller volume of the microfluidic device compared to the macroperifusion chamber7.
To harness the utility of this system, the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) difference detector in situ (cADDis) biosensor was expressed in human pseudoislets to assess cAMP dynamics and hormone secretion. The cADDis biosensor is composed of a circularly permuted green fluorescent protein (cpGFP) positioned in the hinge region of an exchange protein activated by cAMP 2 (EPAC2), connecting its regulatory and catalytic regions. The binding of cAMP to the regulatory region of EPAC2 elicits a conformational change in the hinge region that increases fluorescence from the cpGFP13. Intracellular messengers such as cAMP elicit insulin and glucagon secretion after the upstream activation of G-protein coupled receptors14. Live-cell imaging coupled with microperifusion helps to connect the intracellular cAMP dynamics with islet hormone secretion. Specifically, in this protocol, cADDis-expressing pseudoislets are generated to monitor cAMP responses in alpha and beta cells to various stimuli: low glucose (2 mM glucose; G 2), high glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 &#181;M IBMX; G 20 + IBMX), and low glucose plus epinephrine (Epi; 2 mM glucose + 1 &#181;M Epi; G 2 + Epi). This treatment workflow allows for the assessment of the intracellular cAMP dynamics directly via 1) IBMX-mediated phosphodiesterase inhibition, which enhances intracellular cAMP levels by preventing its degradation, and 2) epinephrine, a known cAMP-dependent stimulator of alpha cell glucagon secretion mediated by &#946;-adrenergic receptor activation. The steps for setting up the microperifusion apparatus for live-cell imaging experiments, the loading of the pseudoislets into the microchip, synchronous live-cell imaging and microperifusion, and the analysis of the biosensor traces and hormone secretion by microplate-based hormone assays are detailed below.

Autore in primo piano: Indagine sulle anomalie e sulla funzione delle isole con un protocollo Pseudoislet 

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Le pseudoisole umane che esprimono biosensori sono state create tramite la somministrazione adenovirale di costrutti che codificano per il biosensore cAMP cADDis (Figura 1A). La Figura 1B mostra la riaggregazione delle cellule insulari umane trasdotte nel tempo, con pseudoisole completamente formate osservate dopo 6 giorni di coltura. Le cellule hanno iniziato a mostrare una fluorescenza visibile di cADDis entro 48 ore e c'era un'elevata espressione del...

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Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Il nostro laboratorio sta lavorando per comprendere, prevenire e invertire la disfunzione delle cellule beta e altre anomalie palpebrali nel diabete di tipo uno e di tipo due. I nostri studi si concentrano sulla patogenesi del diabete umano integrando studi sulla biologia del pancreas e delle palpebre umane e sulla salute e malattia. Gli occhielli umani sono strutture sferiche 3D e l'accesso alle cellule attraverso l'intero occhiello presenta alcune sfide sperimentali.Ad esempio, quando si cerca di introdurre biosensori per comprendere la segnalazione delle cellule oculari, il nostro protocollo per le pseudo palpebre supera questa sfida eseguendo manipolazioni genetiche nello stato di singola cellula e aggregando queste cellule oculari umane trasdotte in pseudo palpebre per gli studi a valle. Il nostro sistema di pseudo palpebre ci consente di esprimere i biosensori in tutto l'occhiello, piuttosto che solo sulla superficie palpebrale. In combinazione con il nostro sistema di imaging di cellule vive e microperfusione, siamo in grado di misurare e co-registrare i processi intracellulari dinamici con la secrezione ormonale a valle.Questo protocollo potrebbe essere applicato per rispondere a una serie di importanti domande scientifiche. Ad esempio, le strategie di silenziamento genico potrebbero essere combinate con questo approccio per comprendere l'impatto di un gene di interesse sulla funzione palpebrale e sulle vie di segnalazione associate, sia a livello globale che in modo autospecifico.

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

1.4K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. Il nostro laboratorio sta lavorando per comprendere, prevenire e invertire la disfunzione delle cellule beta e altre anomalie palpebrali nel diabete di tipo uno e di tipo due. I nostri studi si concentrano sulla patogenesi del diabete umano integrando studi sulla biologia del pancreas e delle palpebre umane e sulla salute e malattia. Gli occhielli umani sono strutture sferiche 3D e l'accesso alle cellule attraverso l'intero occhiello presenta alcune sfide sperimentali.Ad esempio, quand...

Video: Autore in primo piano: Indagine sulle anomalie e sulla funzione delle isole con un protocollo Pseudoislet 

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.