Organspender und ihre Familien werden für ihre unschätzbaren Spenden geschätzt, und das International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) und der National Disease Research Exchange (NDRI) werden für ihre Partnerschaft bei der Zugänglichmachung von menschlichem Bauchspeicheldrüsengewebe für die Forschung gewürdigt. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), dem Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 und DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), dem Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, dem U.S. Department of Veterans Affairs (BX000666), das NIGMS der National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 und das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).

Intrazelluläre Signalereignisse und Hormonsekretion in menschlichen Pseudoinseln

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Integration eines Mikroperifusionssystems, biosensorexprimierender Pseudoinseln und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie ermöglicht die synchrone Beurteilung intrazellulärer Signalereignisse und dynamischer Hormonsekretionsprofile. Das dynamische Mikroperifusionssystem kann eine Reihe von genau definierten Stimuli an die Pseudoinseln abgeben und ermöglicht die Sammlung des Abwassers, in dem die Insulin- und Glukagonkonzentrationen mit einem kommerziell erhältlichen ELISA gemessen werden können. Gleichzeitig erf...

Die Langerhans-Inseln sind Mini-Organe, die über die gesamte Bauchspeicheldrüse verstreut sind und deren Funktion für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase entscheidend ist. Insulin wird aus Betazellen nach dem Metabolismus von Glukose, einem Anstieg des ATP/ADP-Verhältnisses, dem Verschluss von ATP-empfindlichen Kaliumkanälen, der Depolarisation der Plasmamembran und dem Einstrom von extrazellulärem Kalzium1 sezerniert. Die Glucagon-Sekretion aus Alpha-Zellen ist weniger verstanden, aber es wurde postuliert, dass intrazelluläre und parakrine Signalwege zur Exozytose des Glucagon-Granula-Granulats beitragen 2,3,4. Sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes sind mit einer Inselzelldysfunktion assoziiert 5,6,7. Daher ist die Aufklärung der intrazellulären Signalwege, die die Hormonsekretion von Inselzellen vermitteln, für das Verständnis physiologischer und pathologischer Mechanismen in Pankreasinseln unerlässlich.
Die kugelförmige Architektur von Inselchen stellt gewisse Hindernisse für Experimente dar. Zu diesen Herausforderungen gehören die Variation der Inselgröße und die 3D-Natur der Inseln, die die virale Transduktion innerhalb des Inselkerns reduziert 8,9. Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde ein Pseudoinselsystem entwickelt, in dem primäre menschliche Inseln in einzelne Zellen zerstreut, adenoviral mit Konstrukten transduziert werden, die für Ziele von Interesse kodieren, und reaggregiert werden, um größenkontrollierte, inselartige Strukturen zu bilden, die als Pseudoinseln bezeichnet werden7. Im Vergleich zu nativen Inseln desselben Spenders, die parallel kultiviert wurden, ähneln sich diese Pseudoinseln in Morphologie, endokriner Zellzusammensetzung und Hormonsekretion7. Diese Methode ermöglicht die Expression von Konstrukten in der gesamten Pseudoinsel, was bedeutet, dass sie eine frühere Barriere für die einheitliche genetische Manipulation primärer menschlicher Inseln überwindet 7,8,9.
In diesem Protokoll ist das Pseudoinselsystem mit einem mikrofluidischen Gerät integriert, um Biosensoren in primären menschlichen Inselzellen zu exprimieren und eine zeitliche Auflösung der Pseudoislet-Hormonsekretion während der dynamischen Perifusion zu erreichen10,11,12. Die Pseudoinseln werden in einen Mikrochip gelegt und über eine Peristaltikpumpe12 einem stetigen Strom verschiedener Sekretagogen ausgesetzt. Der Mikrochip hat einen transparenten Glasboden und ist auf einem konfokalen Mikroskop montiert, um die intrazelluläre Signaldynamik über Änderungen der Fluoreszenzintensität des Biosensors aufzuzeichnen. Die Biosensor-Bildgebung wird mit der Entnahme von Mikroperifusionsabwässern für die anschließende Analyse der Insulin- und Glukagonsekretion synchronisiert7. Im Vergleich zur Makroperifusion ermöglicht dieser Mikroperifusionsansatz aufgrund des geringeren Volumens der mikrofluidischen Vorrichtung im Vergleich zur Makroperifusionskammer7 die Verwendung von weniger Pseudoinseln.
Um den Nutzen dieses Systems zu nutzen, wurde der zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP)-Differenzdetektor (cADDis) in menschlichen Pseudoinseln exprimiert, um die cAMP-Dynamik und die Hormonsekretion zu beurteilen. Der cADDis-Biosensor besteht aus einem zirkulär permutierten grün fluoreszierenden Protein (cpGFP), das in der Scharnierregion eines durch cAMP2 (EPAC2) aktivierten Austauschproteins positioniert ist und dessen regulatorische und katalytische Regionen miteinander verbindet. Die Bindung von cAMP an die regulatorische Region von EPAC2 führt zu einer Konformationsänderung in der Scharnierregion, die die Fluoreszenz des cpGFP13 erhöht. Intrazelluläre Botenstoffe wie cAMP lösen nach der vorgeschalteten Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Insulin- und Glukagonsekretion aus14. Lebendzell-Bildgebung in Verbindung mit Mikroperifusion hilft, die intrazelluläre cAMP-Dynamik mit der Inselhormonsekretion zu verbinden. Konkret werden in diesem Protokoll cADDis-exprimierende Pseudoinseln erzeugt, um die cAMP-Reaktionen in Alpha- und Betazellen auf verschiedene Stimuli zu überwachen: niedrige Glukose (2 mM Glukose; G 2), hohe Glukose plus Isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM Glukose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) und niedrige Glukose plus Epinephrin (Epi; 2 mM Glukose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Dieser Behandlungsablauf ermöglicht die Beurteilung der intrazellulären cAMP-Dynamik direkt über 1) IBMX-vermittelte Phosphodiesterase-Hemmung, die den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht, indem sie deren Abbau verhindert, und 2) Epinephrin, ein bekannter cAMP-abhängiger Stimulator der Alphazell-Glukagonsekretion, der durch β-adrenerge Rezeptoraktivierung vermittelt wird. Die Schritte zum Aufbau des Mikroperifusionsapparates für Lebendzell-Imaging-Experimente, das Laden der Pseudoinseln in den Mikrochip, die synchrone Lebendzell-Bildgebung und Mikroperifusion sowie die Analyse der Biosensorspuren und der Hormonsekretion durch Mikrotiterplatten-basierte Hormon-Assays werden im Folgenden beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ad-CMV-cADDis</td>
			<td>Welgen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.01&#8221; FEP tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1527L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL and conical tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;m PTFE filter</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-21940-41</td>
			<td>Change every 8-10 runs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2816</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7888</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble trap&#160;</td>
			<td>Omnifit</td>
			<td>006BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellCarrier ULA&#160;96-well Microplates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v3.1</td>
			<td>Software used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL 1066</td>
			<td>MediaTech&#160;</td>
			<td>15-110-CV</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical adapter (IDEX, P-794)</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>P-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Glucose Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5030</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>okolab</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinepherine (Epi)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4250</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12306C</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1281-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon Kit HTRF</td>
			<td>Cisbio</td>
			<td>62CGLPEH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (12N)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Acid Ethanol Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7523</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Endothelial Cells Medium Supplement</td>
			<td>Cell Dynamics</td>
			<td>M1019</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Idex Derlin nut &#38; ferrule 1/4-24</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-00414-LW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin ELISA</td>
			<td>Mercodia</td>
			<td>10-1113-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isobutylmethylonine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Stimulation Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip (University of Miami, FP-3W)</td>
			<td>University of Miami</td>
			<td>FP-3W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microchip holder&#160;</td>
			<td>Micronit Microfluidics</td>
			<td>FC_PRO_CH4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 2110 Fraction Collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7318122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10, P200, and P1000 pipets and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Enriched-CMRL Media Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>P720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Wash Islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>depends on dish diameter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td>&#160;DMEM Perifusion Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Filter (0.22 &#956;m)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filter all buffers twice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Cell Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>iEC Media Component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human pseudoislet system for synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and hormone secretory profiles

Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, bei denen es sich um kleine 3D-Ansammlungen spezialisierter endokriner und unterstützender Zellen handelt, die in der gesamten Bauchspeicheldrüse verstreut sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Glukosehomöostase durch die Sekretion von Insulin durch Betazellen, was den Blutzucker senkt, und von Glukagon durch Alphazellen, das den Blutzucker erhöht. Intrazelluläre Signalwege, einschließlich derer, die durch cAMP vermittelt werden, sind der Schlüssel für die regulierte Alpha- und Betazell-Hormonsekretion. Die 3D-Inselstruktur ist zwar essentiell für die koordinierte Inselfunktion, stellt aber experimentelle Herausforderungen für mechanistische Studien der intrazellulären Signalwege in primären menschlichen Inselzellen dar. Um diese Herausforderungen und Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine integrierte Live-Cell-Imaging- und Mikrofluidik-Plattform, die primäre menschliche Pseudoinseln verwendet, die von Spendern ohne Diabetes erzeugt wurden und in ihrer Morphologie, Zusammensetzung und Funktion nativen Inseln ähneln. Diese Pseudoinseln werden durch den Dispersions- und Reaggregationsprozess primärer humaner Inselzellen größengesteuert. Im dispergierten Zustand kann die Genexpression von Inselzellen manipuliert werden; So können beispielsweise Biosensoren wie der genetisch kodierte cAMP-Biosensor, cADDis, eingeführt werden. Nach ihrer Bildung ermöglichen Pseudoinseln, die einen genetisch kodierten Biosensor exprimieren, in Kombination mit konfokaler Mikroskopie und einer Mikroperifusionsplattform die synchrone Bewertung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und der sekretorischen Profile von Alpha- und Betazellhormonen, um einen besseren Einblick in zelluläre Prozesse und Funktionen zu erhalten.

The islets of Langerhans are mini organs scattered throughout the pancreas whose function is crucial for the maintenance of glucose homeostasis. Insulin is secreted from beta cells following the metabolism of glucose, an increase in the ATP/ADP ratio, the closure of ATP-sensitive potassium channels, depolarization of the plasma membrane, and the influx of extracellular calcium1. Glucagon secretion from alpha cells is less understood, but it has been postulated that intracellular and paracrine pathways contribute to glucagon granule exocytosis2,3,4. Both type 1 and type 2 diabetes are associated with islet cell dysfunction5,6,7. Therefore, elucidating the intracellular signaling pathways mediating islet hormone secretion is essential for understanding physiologic and pathologic mechanisms in pancreatic islets.
The spherical architecture of islets presents certain obstacles to experimentation. These challenges include islet size variation and the 3D nature of islets, which reduces viral transduction within the islet core8,9. To overcome these challenges, a pseudoislet system was developed, in which primary human islets are dispersed into single cells, adenovirally transduced with constructs encoding targets of interest, and reaggregated to form size-controlled, islet-like structures termed pseudoislets7. Compared to native islets from the same donor that have been cultured in parallel, these pseudoislets are similar in morphology, endocrine cell composition, and hormone secretion7. This method allows for the expression of constructs throughout the pseudoislet, meaning it overcomes a previous barrier to the uniform genetic manipulation of primary human islets7,8,9.
In this protocol, the pseudoislet system is integrated with a microfluidic device to express biosensors in primary human islet cells and gain temporal resolution of&#160;pseudoislet hormone secretion during dynamic perifusion10,11,12. The pseudoislets are placed in a microchip and exposed to a steady flow of different secretagogues via a peristaltic pump12. The microchip has a transparent glass bottom and is mounted on a confocal microscope to record the intracellular signaling dynamics via changes in the biosensor fluorescence intensity. Biosensor imaging is synchronized with the collection of microperifusion effluent for the subsequent analysis of insulin and glucagon secretion7. Compared to macroperifusion, this microperifusion approach allows for fewer pseudoislets to be used due to the smaller volume of the microfluidic device compared to the macroperifusion chamber7.
To harness the utility of this system, the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) difference detector in situ (cADDis) biosensor was expressed in human pseudoislets to assess cAMP dynamics and hormone secretion. The cADDis biosensor is composed of a circularly permuted green fluorescent protein (cpGFP) positioned in the hinge region of an exchange protein activated by cAMP 2 (EPAC2), connecting its regulatory and catalytic regions. The binding of cAMP to the regulatory region of EPAC2 elicits a conformational change in the hinge region that increases fluorescence from the cpGFP13. Intracellular messengers such as cAMP elicit insulin and glucagon secretion after the upstream activation of G-protein coupled receptors14. Live-cell imaging coupled with microperifusion helps to connect the intracellular cAMP dynamics with islet hormone secretion. Specifically, in this protocol, cADDis-expressing pseudoislets are generated to monitor cAMP responses in alpha and beta cells to various stimuli: low glucose (2 mM glucose; G 2), high glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 &#181;M IBMX; G 20 + IBMX), and low glucose plus epinephrine (Epi; 2 mM glucose + 1 &#181;M Epi; G 2 + Epi). This treatment workflow allows for the assessment of the intracellular cAMP dynamics directly via 1) IBMX-mediated phosphodiesterase inhibition, which enhances intracellular cAMP levels by preventing its degradation, and 2) epinephrine, a known cAMP-dependent stimulator of alpha cell glucagon secretion mediated by &#946;-adrenergic receptor activation. The steps for setting up the microperifusion apparatus for live-cell imaging experiments, the loading of the pseudoislets into the microchip, synchronous live-cell imaging and microperifusion, and the analysis of the biosensor traces and hormone secretion by microplate-based hormone assays are detailed below.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Inselanomalien und -funktionen mit einem Pseudoislet-Protokoll 

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Biosensor-exprimierende humane Pseudoinseln wurden durch die adenovirale Verabreichung von Konstrukten erzeugt, die für die cAMP-Biosensor-cADDis kodieren (Abbildung 1A). Abbildung 1B zeigt die Reaggregation der transduzierten humanen Inselzellen im Laufe der Zeit, wobei nach 6 Tagen Kultur vollständig ausgebildete Pseudoinseln beobachtet wurden. Die Zellen begannen innerhalb von 48 Stunden eine sichtbare cADDis-Fluoreszenz zu zeigen, und am Ende der ...

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Unser Labor arbeitet daran, Betazell-Dysfunktion und andere Augenlidanomalien bei Typ-1- und Typ-2-Diabetes zu verstehen, zu verhindern und umzukehren. Unsere Studien konzentrieren sich auf die Pathogenese des menschlichen Diabetes, indem wir Studien zur Biologie der menschlichen Bauchspeicheldrüse und Augenlider sowie zur Gesundheit und Krankheit integrieren. Menschliche Ösen sind sphärische 3D-Strukturen, und der Zugang zu Zellen über die gesamte Öse hinweg stellt einige experimentelle Herausforderungen dar.Wenn wir beispielsweise versuchen, Biosensoren einzuführen, um die Signalübertragung von Augenzellen zu verstehen, überwindet unser Pseudo-Augenlidprotokoll diese Herausforderung, indem es genetische Manipulationen im Einzelzellzustand durchführt und diese transduzierten menschlichen Augenzellen für nachgelagerte Studien zu Pseudo-Augenlidern aggregiert. Unser Pseudo-Augenlidsystem ermöglicht es uns, Biosensoren in der gesamten Öse und nicht nur in der Augenlidoberfläche zu exprimieren. In Kombination mit unserer Lebendzell-Bildgebung und unserem Mikroperfusionssystem können wir dynamische intrazelluläre Prozesse mit nachgeschalteter Hormonsekretion sowohl messen als auch mitregistrieren.Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um eine Vielzahl wichtiger wissenschaftlicher Fragen zu beantworten. Zum Beispiel könnten Gen-Silencing-Strategien mit diesem Ansatz kombiniert werden, um den Einfluss eines interessierenden Gens auf die Augenlidfunktion und die damit verbundenen Signalwege zu verstehen, entweder global oder auf selbstspezifische Weise.

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

1.4K Aufrufe.  Vanderbilt University School of Medicine. Unser Labor arbeitet daran, Betazell-Dysfunktion und andere Augenlidanomalien bei Typ-1- und Typ-2-Diabetes zu verstehen, zu verhindern und umzukehren. Unsere Studien konzentrieren sich auf die Pathogenese des menschlichen Diabetes, indem wir Studien zur Biologie der menschlichen Bauchspeicheldrüse und Augenlider sowie zur Gesundheit und Krankheit integrieren. Menschliche Ösen sind sphärische 3D-Strukturen, und der Zugang zu Zellen über die gesamte Öse hinweg stellt einige experimentelle...

Serie: Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Inselanomalien und -funktionen mit einem Pseudoislet-Protokoll 

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.