自然条件下科罗拉多马铃薯甲虫冬眠的实验研究

科罗拉多马铃薯甲虫是温带地区最严重的马铃薯害虫之一。该害虫的免疫力和发病机制的研究主要在活动期进行。然而，在温带地区，这种害虫的大部分时间都处于冬眠状态。

在这项研究中，我们提出了一种科罗拉多马铃薯甲虫冬眠的方法和一种冬季收集甲虫的技术。这种方法的主要优点是它允许在任何冬眠期间获得任意数量的越冬个体进行病毒分析。使用由 25 x 25 x 40 厘米的刚性木框架制成的笼子。

要为笼子搭建框架，请使用至少两厘米厚、四厘米宽的木板条。用尺寸不超过 5 x 3 毫米的不锈钢网覆盖笼子内部。用木制订书机固定网眼。

在笼子内侧铺上密度为每平方米 60 克的黑色合成土工布。将一根约 60 厘米高的合成半透明透气织物管紧紧地固定在笼子的顶部。将两根结实的绳索交叉并固定在笼子的底部，以便在需要时将其从土壤中拉出。

在土壤中挖一个 40 厘米深的洞。将干草或干草铺在洞上。将笼子放在里面，使干草或干草位于笼子的墙壁和土壤之间。

用收集昆虫的同一块马铃薯田的土壤填满笼子。将防水温度和湿度数据记录仪安装到笼子中所需的深度。在引入甲虫前三到四个星期，将马铃薯幼苗种植在笼子内，并适度浇水。

将一根合成纤维管垂直固定在安装在笼子外侧的任何材料的棍子上。在马铃薯植被末端的无农药马铃薯田中手动收集成年甲虫。将收集到的甲虫放在装有土豆顶部的 20 升塑料桶中，用于喂食昆虫，然后再放入笼子。

用透气织物盖住水桶。将不超过 200 只甲虫放在合成织物网覆盖的马铃薯植物上。食用马铃薯盖时，加入装有水的塑料罐中的新鲜豆盖，然后每天更换马铃薯盖。

一旦所有的甲虫都钻入土壤中越冬，从棍子上解开合成织物管，然后放下织物。清除笼子表面以上的积雪。用强力铲子松开两侧的笼子。

用绳索将笼子从土壤中拉出。将笼子带到实验室。将土壤从笼子中取出小份，小心地打碎大块土壤，并用镊子隔离甲虫。

将活甲虫与尸体分开。活的、健康的甲虫在它们周围压实土壤，形成一个气腔，即所谓的摇篮，因此很容易与土壤分离。被真菌杀死的甲虫被木乃伊化或表面有可见的菌丝体。

细菌分解的昆虫是深色的。通过筛子筛选土壤，以确保所有甲虫都被隔离且未受损。将有真菌感染或细菌分解症状的尸体放入单个无菌 Falcon 管中，以备将来识别。

将活甲虫储存在温度为2摄氏度的冰箱中，直到分析在装有湿棉球的密闭通风容器中。要收集血淋巴，请用胰岛素针在主动脉下方的腹部外侧部分穿刺。为了分离肠道，切掉头部胶囊，将所有内容物挤出到含有磷酸盐缓冲液的培养皿中。

将肠道分离出来，将其从脂肪和Malpighian血管中清除。分离肠道的所需部分，例如前肠、中肠或后肠。要分离脂肪体，请在肠道分离后将其与其他组织分开。

为了从尸体中分离出昆虫病原真菌，将木乃伊尸体放入无菌的湿度室中。使用甲虫内部内容物中的气生分生孢子或菌核，用0.4%乳酸接种在Sabouraud葡萄糖琼脂上。从有细菌腐烂症状的尸体中分离出细菌。

切下甲虫的头，挤出内部内容物并收集到管中，以便随后在培养基上接种细菌。从11月底到4月初，网箱中30厘米深的温度低于零度。这一时期的平均气温为3.3-0.1摄氏度。

2月中旬录得的最低气温为摄氏7.9度。昆虫死亡率在冬眠期间增加，在出苗前的春季达到最大值。甲虫的初始数量为 2， 000 只，其中 1， 470 只幸存下来。

因此，甲虫在冬眠期间的存活率为61%，对530具尸体的分析表明，在冬眠期间，53%的尸体以细菌分解症状为特征，25%以真菌感染症状为特征。Beauveria 在昆虫病原真菌的分离培养物中占主导地位。根茎、冬虫夏草和鳞虫属则少得多。

在从尸体中分离出的具有细菌分解症状的细菌中，鉴定出属于芽孢杆菌属、鞘杆菌属、周芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、拉氏菌属和谷氨酸杆菌属的物种。使用这种方法可以解决冬季从田间获取科罗拉多马铃薯甲虫的问题。它允许以昆虫的低死亡率获得尽可能多的个体。

从基本和应用的角度来看，对甲虫冬眠各个方面的研究对于改进控制这种害虫的方法都很重要。当然，这种技术可以适用于在土壤中越冬的其他昆虫物种。