Колорадский жук – один из самых серьезных вредителей картофеля в умеренном поясе. Исследования иммунитета и патогенеза этого вредителя в основном проводятся на активной стадии. Однако в умеренном поясе этот вредитель большую часть своего жизненного цикла проводит в состоянии спячки.
В данном исследовании мы представляем способ зимней спячки колорадского жука и методику сбора жуков зимой. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получить любое количество зимующих особей для анализа вируса в любой период зимовки. Используют клетки из жесткого деревянного каркаса размером 25 на 25 на 40 сантиметров.
Чтобы соорудить каркас для клетки, используйте деревянные рейки толщиной не менее двух сантиметров и шириной четыре сантиметра. Накройте внутреннюю часть клетки сеткой из нержавеющей стали размером не более пяти на три миллиметра. Зафиксируйте сетку степлером по дереву.
Выстелите внутреннюю часть клетки черным синтетическим геотекстилем плотностью 60 грамм на квадратный метр. Плотно прикрепите к верхней части клетки трубку из синтетической полупрозрачной дышащей ткани, высотой примерно 60 сантиметров. Скрестите и закрепите две прочные веревки на дне клетки, чтобы при необходимости вытащить ее из почвы.
Выкопайте в почве яму глубиной 40 сантиметров. На лунку постелите сухую траву или сено. Поместите клетку внутрь так, чтобы сено или сухая трава оказались между стенками клетки и почвой.
Засыпьте клетки грунтом с того же картофельного поля, где собраны насекомые. Установите водонепроницаемые регистраторы данных температуры и влажности в клетках на необходимой глубине. Высадите рассаду картофеля в клетку за три-четыре недели до появления жука и умеренно полейте.
Закрепите трубку из синтетической ткани вертикально к палке из любого материала, установленной с внешней стороны клетки. Вручную собирайте взрослых жуков на картофельных полях, свободных от пестицидов, ближе к концу вегетации картофеля. Собранных жуков перед помещением в клетки хранят в 20-литровых пластиковых ведрах с картофельной ботвой для кормления насекомых.
Накройте ведра дышащей тканью. Разместите не более 200 особей жуков на растениях картофеля, покрытые синтетической тканевой сеткой. Когда картофельная ботва будет съедена, добавьте свежую, помещенную в пластиковую банку с водой, и после этого ежедневно меняйте картофельную ботву.
Как только все жуки зарылись в почву для зимовки, отвяжите трубку из синтетической ткани от палки и уложите ткань вниз. Уберите снег над поверхностью клетки. Разрыхлите клетку с каждой стороны сильной лопатой.
Вытащите клетку из почвы с помощью веревок. Принесите клетку в лабораторию. Снимайте грунт с клетки небольшими порциями, аккуратно разбивайте крупные куски почвы и изолируйте жуков с помощью пинцета.
Отделите живых жуков от трупов. Живые, здоровые жуки уплотняют почву вокруг себя, образуя воздушную полость, так называемую колыбель, и поэтому легко отделяются от почвы. Жуки, убитые грибами, мумифицируются или имеют видимый мицелий на поверхности.
Бактерионно разлагающиеся насекомые имеют темный цвет. Просейте почву через сито, чтобы убедиться, что все жуки изолированы и не повреждены. Трупы с симптомами грибковой инфекции или бактериального разложения помещают в индивидуальную стерильную пробирку Falcon для последующей идентификации.
Хранят живых жуков в холодильнике при температуре 2 градуса Цельсия до анализа в закрытых вентилируемых емкостях, содержащих влажный ватный тампон. Для сбора гемолимфы сделайте прокол в боковой части живота под аортой инсулиновой иглой. Чтобы изолировать кишечник, отрежьте головную капсулу, все содержимое выдавите в чашку Петри с фосфатным буфером.
Отделите кишечник и очистите его от жира и мальпигиевых сосудов. Отделите желаемый отдел кишечника, например, переднюю, среднюю или заднюю кишку. Чтобы изолировать жировое тело, отделите его от других тканей после изоляции кишечника.
Чтобы изолировать энтомопатогенные грибы от трупов, поместите мумифицированные трупы в стерильную камеру влажности. Используйте воздушные конидии или склероции из внутреннего содержимого жуков для покрытия на декстрозном агаре Сабуро с 0,4%-ной молочной кислотой. Изолируйте бактерии от трупов с симптомами бактериального разложения.
Отрежьте голову жука, отожмите внутреннее содержимое и соберите в пробирки для последующего нанесения на носители для бактерий. Минусовые температуры в клетках на глубине 30 сантиметров, регистрировались с конца ноября до начала апреля. Средняя температура в этот период составила 3,3-0,1 градуса по Цельсию.
Самая низкая зарегистрированная температура составила 7,9 градуса по Цельсию в середине февраля. Смертность насекомых увеличивалась во время зимней спячки и достигала максимума весной перед всходами. Первоначальное количество жуков составляло 2 000, из которых выжило 1 470 особей.
Таким образом, выживаемость жуков во время спячки составила 61%Анализ 530 трупов показал, что в период спячки 53% из них характеризовались симптомами бактериального разложения, а 25% — симптомами грибковой инфекции. Среди выделенных культур энтомопатогенных грибов преобладала боверия. Метаризиум, кордицепс и леканициллиум встречались гораздо реже.
Среди бактерий, выделенных из трупов с симптомами бактериального разложения, были идентифицированы виды, принадлежащие к родам Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella и Glutamicibacter. С помощью этого метода можно решить проблему получения колорадских жуков с поля зимой. Это позволяет получить столько особей, сколько нужно, при низкой смертности насекомых.
Изучение различных аспектов зимней спячки жуков важно как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения для совершенствования подхода к борьбе с этим вредителем. И конечно, этот прием можно адаптировать и для других видов насекомых, зимующих в почве.
