最有效的靶向癌症治疗之一是基于抗体，例如抗 HER2 抗体曲妥珠单抗。曲妥珠单抗的抗癌作用涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 ADCC，通过自然杀伤细胞或 NK 细胞。了解调节癌细胞对抗生长因子受体抗体治疗敏感性的机制，特别是ADCC，对于开发新的、更有效的治疗方式可能至关重要。
癌细胞球体等3D模型在预测肿瘤对各种抗癌疗法的免疫反应方面被证明具有优越性。因此，我们使用 NK92 自然杀伤细胞系、表达 GFP 的 JIMT-1 乳腺癌细胞和曲妥珠单抗建立了 ADCC 球状体模型。我们通过诱导抗 HER2 阳性 JIMT-1 乳腺癌细胞形成称为球状体的三维簇来建立 ADCC 检测系统。
实验中使用的JIMT-1细胞系稳定表达绿色荧光蛋白。我们通过准备用于球状体形成的 96 孔板来开始实验。为了形成U形和细胞排斥的底部，用0.5%琼脂糖的PBS溶液涂覆96孔板。
将板在室温下孵育约 30 至 45 分钟。同时，胰蛋白酶消化和计数 JIMT-1 细胞用于细胞接种。用两毫升无菌PBS洗涤细胞。
向烧瓶中加入2毫升胰蛋白酶-EDTA，然后将烧瓶放回CO 2培养箱中10分钟。孵育后，点击烧瓶以检查 JIMT-1 细胞是否已分离。用2毫升JIMT-1培养基停止消化，并将细胞悬液收集到50毫升管中。
在Burker室中用台盼蓝计数细胞，并将细胞数调整为每ml20,000个细胞。通过将 100 μL 细胞悬液移液到每个孔中以形成球状体，将细胞接种到 96 孔板中。在 CO2 培养箱中以 37 度的三天孵育时间让细胞聚集在一起。
定期用倒置显微镜检查球体的大小和形状。在球状体诱导后的第三天，用 DMSO 中的 Pluronic F-127 溶液涂覆 96 孔高内涵筛选板。涂层对于防止JIMT-1 EGFP球体附着在玻璃表面或板上至关重要。
在室温下孵育45分钟后，吸出包衣溶液，并用DMEM F12无血清培养基洗涤孔两次。使用一毫升移液管将球状体分三份转移到96孔高内涵筛选板中。将舒尼替尼以40微摩尔浓度（每孔10微升）加入孔中，并将新鲜的JIMT-1培养基移液到对照孔中以增加体积。
将板在 37 度的 CO 2 培养箱中孵育一小时。在预处理球体的孵育过程中，将 NK92 细胞从烧瓶中收集到 15 毫升管中。在Burker室中用台盼蓝计数细胞，并调整细胞数量以达到20：1的效应器与靶标比率。
用 10 微摩尔的 CellTracker Blue 溶液染色 NK 细胞，然后将它们放入 37 度的 CO2 培养箱中一小时。为了洗涤多余的染料，在室温下以150RCF离心NK细胞两次三分钟。然后将细胞重悬于新鲜的JIMT-1培养基中。
通过每孔移液 55 μL 以及抗 HER2 抗体曲妥珠单抗，将染色的 NK 细胞添加到靶标 JIMT-1 EGFP 球体中。在JIMT-1培养基中稀释曲妥珠单抗，达到每ml10微克的浓度。将 110 μL 新鲜 JIMT-1 培养基加入对照孔中，并将板在 37 度的 CO 2 培养箱中孵育 24 小时。
结果，ADCC添加的治疗总体积为110微升，最终舒尼替尼浓度为每升20微摩尔。为了检测和测量处理后的凋亡细胞死亡，在 JIMT-1 培养基中用 Annexin V Alexa Fluor 647 偶联物染色球状体一小时。实验步骤完成后，将板转移到高内涵分析装置中。
在将 NK 因子添加到靶细胞后 24 小时对板进行成像。对于成像，我们使用高内涵分析仪和图像分析软件。使用“孔板类型”选项从孔板列表中选择微孔板的类型。
使用 96 孔高内涵筛选板。选择两个峰值自动对焦，作为在具有 10 倍物镜和 0.3 数值孔径的板中进行的分析，分别使用自动对焦和物镜选项。使用 OptiMode 选项选择共聚焦模式，然后使用像素合并选项将像素合并 2 应用到使用像素合并选项。
对于成像球体，请使用“通道选择”选项选择适当的通道。要检测 EGFP 输注的 JIMT-1 细胞，请选择具有 200 毫秒积分时间、50% 激光功率、2 微米堆叠高度、488 纳米激发和 500、550 纳米发射波长的 EGFP。要检测凋亡细胞，请使用 Alexa 647，积分时间为 100 毫秒，激光功率为 50%，堆叠高度为 10 微米，激发为 640 纳米，发射波长为 650、760 纳米。
要可视化球状体内的 NK 细胞，请选择以下通道，即具有 100 毫秒积分时间、50% 激光功率、2 微米堆叠高度、405 纳米激发和 435、418 纳米发射波长的 DAPI。在“布局选择”选项中，选择“Z”堆栈，因为球体中的细胞往往位于显微镜的不同焦平面上。10个距离为10微米的平面足以覆盖整个椭球体区域。
将第一个平面和最后一个平面的值分别设置为 0 微米和 90 微米。在开始测量之前，可以使用快照功能拍摄样本图像，以检查正确的设置。使用“定义布局”（Defined Layout） 选项设置成像的孔数和场数。
使用“精细纹理区域”选项通过 EGFP 荧光或 JIMT-1 细胞识别球状体，并按大小过滤掉它们。使用“选择人口”模块删除边框对象。由于膜联蛋白阳性细胞出现在外周球体上，因此测量凋亡环中的膜联蛋白强度。
在“选择区域”模块中，将外部边框设置为负 90。将膜联蛋白强度值表示为平均强度。如膜联蛋白V染色所示，向JIMT-1细胞中加入NK细胞和曲妥珠单抗会导致肿瘤球体细胞死亡。
膜联蛋白阳性凋亡细胞出现在球状体的外围区域。然而，在没有曲妥珠单抗的情况下，NK细胞不会触发肿瘤细胞凋亡。为了区分曲妥珠单抗的直接作用或ADCC介导的作用，本研究使用缺乏FC区域结合能力的曲妥珠单抗-Fab2作为阴性对照。
由于曲妥珠单抗-Fab2在该模型中无效，因此肿瘤细胞死亡可能通过ADCC介导。此外，舒尼替尼预处理减少了球状体中的膜联蛋白V染色，证实了舒尼替尼诱导的ADCC耐药性，并揭示了与NK细胞和曲妥珠单抗共孵育的JIMT-1球体中凋亡细胞死亡的预防作用。该数据证实了舒尼替尼在ADCC模型中的细胞保护作用，并敦促谨慎对待基于ADCC的免疫疗法和舒尼替尼的潜在组合。
总之，我们的HCS检测可能适用于鉴定ADCC促进化合物。
