가장 효과적인 표적 암 치료법 중 하나는 항-HER2 항체 트라스투주맙과 같은 항체를 기반으로 합니다. 트라스투주맙의 항암 작용은 자연살해 또는 NK 세포에 의한 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 수반합니다. ADCC와 관련하여 항성장 인자 수용체 항체 요법에 대한 암세포의 민감도를 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 새롭고 보다 효율적인 치료 방식을 개발하는 데 중요할 수 있습니다.
암세포 스페로이드와 같은 3D 모델은 다양한 항암 치료에 대한 종양의 면역 반응을 예측하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다. 따라서 NK92 자연살해 세포주, GFP 발현 JIMT-1 유방암 세포, 트라스투주맙을 이용한 ADCC 스페로이드 모델을 구축하였습니다. 항HER2 양성 JIMT-1 유방암 세포를 유도하여 스페로이드라는 3차원 클러스터를 형성하여 ADCC 분석 시스템을 구축했습니다.
실험에 사용된 JIMT-1 세포주는 녹색 형광 단백질을 안정적으로 발현합니다. 스페로이드 형성을 위해 96웰 플레이트를 준비하는 것으로 실험을 시작합니다. U자형 및 세포 발수성 바닥을 만들려면 PBS에서 0.5% 아가로스 용액으로 96웰 플레이트를 코팅합니다.
플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 배양합니다. 그 동안 트립신화하고 세포 파종을 위해 JIMT-1 세포를 계수합니다. 멸균 PBS 2밀리리터로 세포를 세척합니다.
플라스크에 트립신-EDTA 2밀리리터를 넣고 플라스크를 CO2 인큐베이터에 다시 넣고 10분 동안 넣습니다. 배양 후 플라스크를 두드려 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다. 2밀리리터의 JIMT-1 배지로 분해를 멈추고 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브에 모읍니다.
Burker 약실에 있는 Trypan 파랑을 가진 세포를 세고, 20에 세포 수를 조정하십시오, ml 당 000의 세포. 스페로이드 형성을 위해 각 웰에 100마이크로리터 세포 현탁액을 피펫팅하여 세포를 96웰 플레이트에 파종합니다. CO2 인큐베이터에서 37도에서 3일간의 배양 기간 동안 세포가 뭉치도록 합니다.
도립 현미경으로 스페로이드의 크기와 모양을 정기적으로 확인하십시오. 스페로이드 유도 후 3일째에 DMSO에 Pluronic F-127 용액으로 96웰 고함량 스크리닝 플레이트를 코팅합니다. 코팅은 JIMT-1 EGFP 스페로이드가 유리 표면이나 플레이트에 부착되는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다.
실온에서 45분의 배양 기간을 거친 후 코팅 용액을 흡인하고 DMEM F12 무혈청 배지로 웰을 두 번 세척합니다. 스페로이드를 1밀리리터 피펫을 사용하여 3회에 걸쳐 96웰 고함량 스크리닝 플레이트로 옮깁니다. 웰당 10마이크로리터의 40마이크로몰 농도로 웰에 수니티닙을 추가하고 부피를 높이기 위해 신선한 JIMT-1 배지를 대조군 웰에 피펫팅합니다.
37도의 CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 전처리된 스페로이드의 배양이 진행되는 동안 플라스크에서 NK92 세포를 15밀리리터 튜브로 수집합니다. Burker 챔버에서 Trypan Blue로 세포를 계수하고 세포 수를 조정하여 20:1의 effector-target 비율에 도달합니다.
NK 세포를 CellTracker Blue의 10마이크로몰 용액으로 염색하고 37도에서 1시간 동안 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 과잉의 염료를 세척하려면 NK 세포를 실온에서 3분 동안 150 RCF에서 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 세포를 새로운 JIMT-1 배지에 재현탁시킵니다.
항-HER2 항체 트라스투주맙과 함께 웰당 55마이크로리터를 피펫팅하여 염색된 NK 세포를 표적 JIMT-1 EGFP 스페로이드에 추가합니다. 트라스투주맙을 JIMT-1 배지에 희석하여 ml당 10마이크로그램의 농도에 도달합니다. 110마이크로리터의 신선한 JIMT-1 배지를 대조 웰에 추가하고 37도의 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
그 결과, ADCC에 첨가된 처리의 총량은 110마이크로리터이고, 최종 수니티닙 농도는 리터당 20마이크로몰이다. 처리 후 자가사멸 세포 사멸을 검출하고 측정하려면 JIMT-1 배지에서 Annexin V Alexa Fluor 647 conjugate로 스페로이드를 1시간 동안 염색합니다. 실험 단계가 완료되면 플레이트를 high-content 분석 장치로 옮깁니다.
플레이트는 표적 세포에 NK 인자를 첨가한 후 24시간 후에 촬영됩니다. 이미징을 위해 High-Content Analyzer와 이미지 분석 소프트웨어를 사용하고 있습니다. 플레이트 유형(Plate Type) 옵션을 사용하여 플레이트 목록에서 마이크로플레이트 유형을 선택합니다.
96웰 High-Content 스크리닝 플레이트를 사용하십시오. 각각 자동 초점 및 대물렌즈 옵션을 사용하여 0.3개의 개구수를 가진 10x 대물렌즈가 있는 플레이트에서 수행된 분석으로 두 개의 피크 자동 초점을 선택합니다. OptiMode 옵션으로 공초점 모드를 선택하고 Binning 옵션을 사용하여 Binning 2를 적용합니다.
스페로이드를 이미징하려면 Channel Selection 옵션을 사용하여 적절한 채널을 선택합니다. EGFP 형질 주입된 JIMT-1 세포를 검출하려면 200밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 2마이크로미터 스택 높이, 488나노미터 여기, 500, 550나노미터 방출 파장을 가진 EGFP를 선택하십시오. 또한 세포사멸 세포를 검출하기 위해 100밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 10마이크로미터 스택 높이, 640나노미터 여기, 650, 760나노미터 방출 파장을 가진 Alexa 647을 사용하십시오.
스페로이드 내에서 NK 세포를 시각화하려면 100밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 2마이크로미터 스택 높이, 405나노미터 여기, 435, 418나노미터 방출 파장을 가진 DAPI 채널을 선택합니다. Layout Selection 옵션에서 Z 스택을 선택하면 스페로이드의 셀이 현미경의 다른 초점면에 있는 경향이 있기 때문입니다. 10마이크로미터 거리의 평면 10개는 전체 스페로이드 영역을 덮기에 충분합니다.
첫 번째 평면과 마지막 평면의 값을 각각 0마이크로미터와 90마이크로미터로 설정합니다. 측정을 시작하기 전에 올바른 설정을 확인하기 위해 스냅샷 기능으로 샘플 이미지를 촬영할 수 있습니다. 정의된 레이아웃(Defined Layout) 옵션을 사용하여 이미징할 웰과 필드의 개수를 설정합니다.
Fine Texture Region 옵션을 사용하여 EGFP 형광 또는 JIMT-1 세포로 스페로이드를 식별하고 크기별로 필터링합니다. Select Population 모듈을 사용하여 경계 객체를 제거합니다. Annexin 양성 세포는 말초 스페로이드에 나타나기 때문에 apoptotic ring에서 Annexin 강도를 측정합니다.
영역 선택 모듈에서 외부 경계를 빼기 90으로 설정합니다. Annexin 강도 값을 평균 강도로 표현합니다. Annexin V 염색에서 알 수 있듯이 NK 세포와 트라스투주맙을 JIMT-1 세포에 추가하면 종양 스페로이드에서 세포 사멸이 발생했습니다.
아넥신 양성 세포자멸 세포는 스페로이드의 주변 영역에서 나타났습니다. 그러나 트라스투주맙이 없는 경우, NK 세포는 종양세포 사멸을 유발하지 않았다. 트라스투주맙의 직접적 또는 ADCC 매개 효과를 구별하기 위해 본 연구에서는 FC 영역 결합 능력이 결여된 트라스투주맙-Fab2를 음성 대조군으로 사용하였다.
트라스투주맙-팹2는 이 모델에서 효과가 없었기 때문에 종양세포 사멸은 ADCC를 통해 매개될 가능성이 높다. 또한, 수니티닙을 사용한 전처리는 스페로이드에서 Annexin V 염색을 감소시켜 수니티닙 유도 ADCC 내성을 확인했으며 NK 세포 및 트라스투주맙과 함께 배양한 JIMT-1 스페로이드에서 자가사멸 세포 사멸을 예방하는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 ADCC 모델에서 수니티닙의 세포 보호 효과를 확인했으며 ADCC 기반 면역 요법과 수니티닙의 잠재적 조합에 대한 주의를 촉구합니다.
요약하면, 당사의 HCS 분석은 ADCC 부스팅 화합물의 식별에 적합할 수 있습니다.
