En etkili hedefe yönelik kanser tedavilerinden biri, anti-HER2 antikoru trastuzumab gibi antikorlara dayanmaktadır. Trastuzumab'ın anti-kanser etkisi, doğal öldürücü veya NK hücreleri tarafından antikora bağımlı hücre aracılı sitotoksisiteyi, ADCC'yi içerir. Kanser hücrelerinin anti-büyüme faktörü reseptör antikor tedavisine duyarlılığını düzenleyen mekanizmaların ADCC ile özel olarak anlaşılması, yeni ve daha etkili tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için çok önemli olabilir.
Kanser hücresi sferoidleri gibi 3D modeller, tümörlerin çeşitli anti-kanser tedavilerine karşı bağışıklık tepkilerini tahmin etmede üstün olduğunu kanıtladı. Bu nedenle, NK92 doğal öldürücü hücre hattını, GFP eksprese eden JIMT-1 meme karsinomu hücrelerini ve trastuzumab'ı kullanarak bir ADCC sferoid modeli oluşturduk. ADCC test sistemini, anti-HER2-pozitif JIMT-1 meme karsinomu hücrelerini, sferoid adı verilen üç boyutlu kümeler oluşturmak üzere indükleyerek kurduk.
Deneylerde kullanılan JIMT-1 hücre hattı, yeşil floresan proteini kararlı bir şekilde ifade eder. Deneye 96 oyuklu plakayı sferoid oluşumu için hazırlayarak başlıyoruz. U şeklinde ve hücre itici bir taban oluşturmak için, 96 oyuklu plakayı PBS'de% 0.5 agaroz çözeltisi ile kaplayın.
Plakayı oda sıcaklığında yaklaşık 30 ila 45 dakika inkübe edin. Bu arada, hücre tohumlaması için tripsinizasyon ve JIMT-1 hücrelerini sayın. Hücreleri iki mililitre steril PBS ile yıkayın.
Şişeye iki mililitre tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi 10 dakika boyunca bir CO2 inkübatörüne geri koyun. İnkübasyondan sonra, JIMT-1 hücrelerinin ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için şişeye dokunun. İki mililitre JIMT-1 ortamı ile sindirimi durdurun ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Bir Burker odasında Trypan Blue ile hücreleri sayın ve hücre sayısını ml başına 20.000 hücreye ayarlayın. Küre oluşumu için her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyerek hücreleri 96 oyuklu plakaya tohumlayın. Bir CO2 inkübatörde 37 derecede üç günlük inkübasyon süresi boyunca hücrelerin bir araya toplanmasına izin verin.
Ters çevrilmiş bir mikroskopla sferoidlerin boyutunu ve şeklini düzenli olarak kontrol edin. Sferoid indüksiyonundan sonraki üçüncü günde, 96 oyuklu yüksek içerikli eleme plakasını DMSO'da bir Pluronic F-127 çözeltisi ile kaplayın. JIMT-1 EGFP sferoidlerinin cam yüzeye veya plakaya yapışmasını önlemek için kaplama çok önemlidir.
Oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, kaplama solüsyonunu aspire edin ve kuyucukları DMEM F12 serumsuz medya ile iki kez yıkayın. Sferoidleri, bir mililitrelik bir pipet kullanarak üç kopya halinde 96 oyuklu yüksek içerikli eleme plakasına aktarın. Kuyucuk başına 10 mikrolitrede 40 mikromolar konsantrasyonda kuyucuklara sunitinib ekleyin ve hacmi yükseltmek için taze JIMT-1 ortamını kontrol kuyularına pipetleyin.
Plakayı 37 derecede bir CO2 inkübatörde bir saat inkübe edin. Ön işleme tabi tutulmuş sferoidlerin inkübasyonu devam ederken, NK92 hücrelerini şişeden 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Bir Burker odasında Tripan Mavisi ile hücreleri sayın ve hücre sayısını 20'ye 1'lik bir efektör-hedef oranına ulaşacak şekilde ayarlayın.
NK hücrelerini 10 mikromolar CellTracker Blue çözeltisiyle boyayın ve 37 derecede bir saat boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. Boyanın fazlalığını yıkamak için, NK hücrelerini oda sıcaklığında üç dakika boyunca 150 RCF'de iki kez santrifüjleyin. Ardından hücreleri taze JIMT-1 ortamında yeniden süspanse edin.
Anti-HER2 antikoru trastuzumab ile birlikte oyuk başına 55 mikrolitre pipetleyerek boyanmış NK hücrelerini hedef JIMT-1 EGFP kürelerine ekleyin. Trastuzumab'ı ml başına 10 mikrogramlık bir konsantrasyona ulaşmak için JIMT-1 ortamında seyreltin. 110 mikrolitre taze JIMT-1 ortamını kontrol kuyucuklarına ekleyin ve plakayı 37 derecede bir CO2 inkübatöründe 24 saat inkübe edin.
Sonuç olarak, ADCC için eklenen toplam tedavi hacmi 110 mikrolitredir ve nihai sunitinib konsantrasyonu litre başına 20 mikromoldür. Tedavileri takiben apoptotik hücre ölümünü tespit etmek ve ölçmek için, sferoidleri JIMT-1 ortamında bir saat boyunca bir Annexin V Alexa Fluor 647 konjugatı ile boyayın. Deneysel adımlar bittikten sonra, plakayı yüksek içerikli analiz cihazına aktarın.
Plaka, NK faktörlerinin hedef hücrelere eklenmesinden 24 saat sonra görüntülenir. Görüntüleme için yüksek içerikli analizör ve bir görüntü analiz yazılımı kullanıyoruz. Plaka Tipi seçeneğini kullanarak plaka listesinden mikroplaka tipini seçin.
96 oyuklu yüksek içerikli eleme plakası kullanın. Sırasıyla otofokus ve objektif seçeneklerini kullanarak 0,3 sayısal açıklığa sahip 10x objektifli plakalarda gerçekleştirilen tahliller olarak iki tepe otofokus seçin. OptiMode seçeneğiyle Odak modu'nu seçin ve Gruplama seçeneğini kullanarak Gruplama 2'yi uygulayın.
Görüntüleme sferoidleri için, Kanal Seçimi seçeneğini kullanarak uygun kanalları seçin. EGFP ile transfüzyon yapılan JIMT-1 hücrelerini tespit etmek için, 200 milisaniye entegrasyon süresi, %50 lazer gücü, iki mikrometre yığın yüksekliği, 488 nanometre uyarma ve 500, 550 nanometre emisyon dalga boylarına sahip EGFP'yi seçin. Apoptotik hücreleri tespit etmek için 100 milisaniye entegrasyon süresi, %50 lazer gücü, 10 mikrometre yığın yüksekliği, 640 nanometre uyarma, 650, 760 nanometre emisyon dalga boylarına sahip Alexa 647'yi kullanın.
Küreler içindeki NK hücrelerini görselleştirmek için aşağıdaki kanalı seçin, 100 milisaniye entegrasyon süresi, %50 lazer gücü, iki mikrometre yığın yüksekliği, 405 nanometre uyarma ve 435, 418 nanometre emisyon dalga boyuna sahip DAPI. Düzen Seçimi seçeneğinde, sferoidlerdeki hücreler mikroskobun farklı odak düzlemlerinde olma eğiliminde olduğundan Z yığınlarını seçin. Tüm küresel bölgeyi kaplamak için 10 mikrometre mesafeli 10 düzlem yeterlidir.
İlk düzlemin ve son düzlemin değerlerini sırasıyla 0 mikrometre ve 90 mikrometre olarak ayarlayın. Ölçüme başlamadan önce, doğru ayarları kontrol etmek için Anlık Görüntü işleviyle örnek görüntüler çekilebilir. Tanımlı Düzen seçeneğini kullanarak görüntüleme için kuyu ve alan sayısını ayarlayın.
İnce Doku Bölgesi seçeneğini kullanarak sferoidleri EGFP floresan veya JIMT-1 hücrelerine göre tanımlayın ve boyuta göre filtreleyin. Nüfus Seç modülünü kullanarak kenarlık nesnelerini kaldırın. Annexin pozitif hücreler periferik sferoidlerde göründüğünden, apoptotik halkadaki Annexin yoğunluğunu ölçün.
Bölge Seç modülünde dış kenarlığı eksi 90 olarak ayarlayın. Annexin yoğunluk değerlerini ortalama yoğunluk olarak ifade edin. Annexin V boyaması ile belirtildiği gibi, JIMT-1 hücrelerine NK hücrelerinin ve trastuzumab eklenmesi, tümör sferoidlerinde hücre ölümüne neden oldu.
Annexin pozitif apoptotik hücreler sferoidlerin periferik zonunda ortaya çıktı. Bununla birlikte, trastuzumab yokluğunda, NK hücreleri tümör hücresi apoptozunu tetiklemedi. Trastuzumab'ın doğrudan veya ADCC aracılı etkilerini ayırt etmek için, bu çalışmada FC bölgesi bağlanma kabiliyeti olmayan trastuzumab-Fab2 negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
Trastuzumab-Fab2 bu modelde etkisiz olduğundan, tümör hücresi ölümüne ADCC aracılık etmesi muhtemeldir. Ayrıca, sunitinib ile ön tedavi, sferoidlerde Annexin V boyamasını azalttı, sunitinib kaynaklı ADCC direncini doğruladı ve NK hücreleri ve trastuzumab ile birlikte inkübe edilen JIMT-1 sferoidlerinde apoptotik hücre ölümünün önlenmesini ortaya çıkardı. Bu veriler, ADCC modelinde sunitinib'in sitoprotektif etkisini doğruladı ve ADCC tabanlı immünoterapiler ile sunitinib'in potansiyel kombinasyonları konusunda dikkatli olunmasını istedi.
Özetle, HCS testimiz ADCC artırıcı bileşiklerin tanımlanması için uygun olabilir.
