揭示离体线粒体中的异种生物运输和影响:来自呼吸测定和酶测定的见解

我们的研究小组使用线粒体作为药理学靶点来开发不同的产品，例如化学疗法、杀虫剂等。通过此视频，我们想介绍以更易于访问、更易于理解和可用的方式评估线粒体呼吸酶的方法。在我们的实验室中，我们建立了一个方案来评估外源性物质对大鼠、蚊子和蜱虫线粒体的不同影响，为特定的线粒体反应提供一些见解。

这种方法通过识别对最大限度地减少非靶标毒性至关重要的线粒体生物能量学破坏来支持生物安全的农药配方。我们的差异化优势包括杀虫剂设计方案，从数千个分子的计算机分析开始，然后对符合生物安全标准的分子进行体外验证，最后进行体内测试。这种方法既节省时间和资源，又遵循了农药生产的最佳实践。

从中期来看，我们将选择可以与基因改造相结合的天然来源分子，靶向昆虫线粒体，旨在增强非目标生物体的特异性和生物安全性。首先，准备 250 毫升线粒体分离缓冲液，含或不含 0.2 克 BSA。将 10 mL 缓冲液分装到冰冷的锥形管中。

对大鼠实施安乐死后，将其肝脏完全解剖，并将其放入冰冷的隔离缓冲液中冲洗。洗涤两次后，在含有 10 毫升分离缓冲液的培养皿中用锋利的剪刀将肝组织切碎。将溶液放入 Potter-Elvehjem 组织匀浆管中，以每分钟 390 转的低速将碎组织匀浆至少 10 次。

然后，将匀浆溶液转移到锥形管中，在 4 摄氏度下以 600 G 离心 10 分钟。离心后，小心地将上清液倒入新的锥形管中。在 4 摄氏度下以 7， 000 G 的浓度再次离心上清液 10 分钟，然后弃去所得的上清液。

将分离的线粒体沉淀重悬于两毫升不含 BSA 的分离缓冲液中。检查埃及伊蚊卵是否在实验前一周用过滤的脱氯水在托盘中孵化，并监测幼虫的蜕皮过程。一旦幼虫达到 L3 阶段，最多等待 12 小时后再收集它们。

使用巴斯德移液器，在大约 100 毫升无氯水中收集至少 30 只处于 L3 至 L4 龄的埃及伊蚊幼虫。过滤后，将带有幼虫的溶液转移到 Potter-Elvehjem 组织匀浆管中，并以每分钟约 390 转至少 10 次的速度小心匀浆。通过玻璃棉注射器转移匀浆组织，以过滤掉大的外骨骼残留物。

首先，获得大鼠肝脏线粒体和匀浆的埃及伊蚊 L3、L4 幼虫。对于极谱法测定，请按照制造商的说明，每天在开始任何测定之前校准高分辨率呼吸计。向腔室中加入反应介质，确保比标准实验腔室体积 2 毫升至少高出 0.2 毫升。

在加入反应缓冲液、0.1 毫克蛋白质和底物后，监测耗氧量以测量 NADH 和琥珀酸氧化酶活性。等到氧浓度信号稳定下来并记录下来。向腔室中添加电子传递蛋白抑制剂，以确认观察到的耗氧量是由于线粒体呼吸链引起的。

对于 NADH 脱氢酶活性，首先准备包含所有必需组分的反应系统，并将试剂添加到分光光度计池中。通过在 420 纳米处还原亚铁氰化钾来监测 NADH 脱氢酶活性。使用每厘米毫摩尔 1.04 的摩尔消光系数计算浓度。

最后，将报告的活性除以用于获得特定酶活性的蛋白质浓度。同样，使用适当的反应混合物评估琥珀酸脱氢酶和细胞色素 c 还原酶或复合物 III 活性。为了测量细胞色素 c 氧化酶或复合物 IV 活性，制备反应系统并混合等摩尔量的细胞色素 c 和连二亚硫酸钠，确保完全还原。

使用磷酸盐缓冲液作为流动相，将还原的混合物通过交联的葡聚糖凝胶柱。在分光光度计中定量在 550 纳米处收集的馏分。最后，应用比尔定律，以 19.8 摩尔/每厘米的摩尔消光系数计算浓度。

将报告的活性除以蛋白质浓度以获得特定的酶活性结果。百万分之 9.7 的 Cavacrol 将埃及伊蚊幼虫的 NADH 氧化酶活性降低了约 9.35%，而百万分之 10 的 Cymbopogon flexuosus 精油或 EO 将 NADH 氧化和氧还原降低了约 34%，表明抑制了复合物 I 和复合物 IV 之间的电子传递。 和 Cymbopogon flexuosus EO 将离体大鼠肝脏线粒体中的琥珀酸氧化酶活性降低高达 50%，表明复合物 II 和复合物 IV 之间存在抑制作用.Cavacrol 降低了埃及伊蚊幼虫中细胞色素 c 还原酶活性和复合物 IV 的细胞色素 c 氧化和氧还原，而 Cymbopogon flexuosus EO 将大鼠肝脏线粒体中的细胞色素 c 氧化酶活性降低了约 58%。