体外研究 使用人诱导多能干细胞对唐氏综合症神经发生进行建模

长期研究重点是寻找唐氏综合征神经系统疾病的潜在治疗方法。我们目前的重点是唐氏综合症受损的神经发生，这是导致智力障碍的主要原因。我们发现唐氏综合征神经发生受损是由双相细胞周期缺陷引起的，这与普遍认为它只是由于唐氏综合征神经祖细胞衰老相反。

使用本手稿中描述的基于人类 IPSC 的方案鉴定双相细胞周期缺陷将推动开发潜力治疗策略，同时考虑到早期增殖减少的细胞周期状态和晚期未能退出细胞周期。首先，将 10 微摩尔的岩石抑制剂添加到完整的人 iPCS 培养基、DPBS、细胞分离溶液和补充有 25 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子的饲养层条件培养基中。将所有试剂加热至 37 摄氏度。

在饲养层上取 iPSC 的六孔板。吸出分化的菌落，并加入新鲜的完全人 iPSC 培养基。将板置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 2 小时。

孵育后，用不含钙和镁的 DPBS 洗涤孔一次。然后，向每个孔中加入 1 毫升细胞分离溶液。将板置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 12 至 14 分钟。

在倒置显微镜下观察细胞。如果大多数细胞脱落，但有些细胞仍然粘附，请从侧面轻轻敲击板。向每个孔中加入 3 毫升补充有钙和镁的 DPBS，以稀释细胞分离溶液。

使用 5 mL 移液器，轻柔移液 2 至 3 次，以打碎结块，同时避免气泡。将细胞通过 40 微米过滤器放入 50 毫升离心机 2.在室温下以 200 G 离心悬浮液 5 分钟，使用真空吸液系统轻轻吸出培养基。

现在，将细胞重悬于 10 mL 人 iPSC 培养基中。将所有悬浮细胞转移到涂有 0.1% 明胶的 15 厘米培养皿上，并在二氧化碳培养箱中孵育。将含有细胞的培养基收集到离心机 2 中。

在室温下以 200 G 离心 5 分钟，然后用真空吸液系统轻轻吸出培养基。将细胞重悬于 1 毫升饲养层条件培养基中，补充每毫升 25 纳克 BFGF 和 10 微摩尔岩石抑制剂。细胞计数后，制备每毫升 30， 000 至 50， 000 个细胞的悬浮液。

将悬浮液接种到孔板中。两天后，用神经祖细胞或 NPC 培养基替换饲养层条件培养基。根据给定，在第 2 天和第 18 天更换培养基。

在第 28 天，用补充有 10 微摩尔岩石抑制剂的 NPC 培养基替换板中的培养基。然后将板在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育 2 小时。孵育后，吸出上清液，并用不含钙和镁的 DPBS 洗涤孔一次。

向每个孔中加入 1 毫升细胞分离溶液。然后在倒置显微镜下以 4 倍放大倍率观察细胞。接下来，将 3 毫升补充钙和镁的 DPBS 移液到板的每个孔中。

使用 5 ml 移液器，轻轻移液悬浮液，并打碎任何团块。通过放置在 50 mL离心机上的 40 微米过滤器过滤细胞悬液 2.如前所述离心并吸出，然后将沉淀重悬于一毫升补充有维生素 B 27 的确定分化培养基中。

然后将 50， 000 个细胞接种到合格的基质包被的 48 孔板的每个孔中。在第 33 天，用神经分化培养基替换培养孔中的培养基。与同基因整倍体细胞相比，在唐氏综合征培养物中观察到 TUBB3 阳性神经元显著减少，在第 85 天明显减少约两倍。

与同基因整倍体细胞相比，在早期神经源性阶段在唐氏综合征培养物中观察到 KI67 阳性细胞的比例显著降低，显示大约减少了四倍。在神经源性晚期，大多数同基因整倍体细胞以最小的 KI67 染色退出细胞周期，而大多数唐氏综合征细胞保持 KI67 阳性，显示出 5 倍的增长。第二对 Sown 综合征和同基因整倍体人 iPSC 证实，在神经分化结束时，唐氏综合征培养物中 TUBB3 阳性神经元水平降低，PAX6 阳性神经祖细胞升高，TUBB3 阳性神经元减少两倍，PAX6 阳性细胞增加两倍多。