MEDUSA 用于识别化学遗传学分析数据中的死亡调节基因

我们的研究计划侧重于了解不同形式的细胞死亡是如何被调节的。我们通常在癌症治疗的背景下研究细胞死亡，目的是了解药物如何发挥作用来开启细胞死亡，以及如何使这些反应更好、更具体。越来越明显的是，有许多不同类型的调节性细胞死亡。

该领域目前已确定至少 14 种机制上不同的死亡类型。其中大多数会导致形态学坏死，一般来说，我们对这些途径的工作原理知之甚少。研究细胞死亡调控的一种有效方法是使用功能基因组学。

换句话说，系统地扰动每个基因并确定这些扰动如何影响细胞死亡。当在药物的背景下进行时，这称为化学遗传学分析。化学遗传学筛选通常评估基因敲除如何影响最终群体规模。

然而，种群规模可能会受到增长率、死亡率或两者变化的影响。由于生长速率变化的限制效应，目前的筛选方法无法识别死亡调节基因。Medusa 使用药物反应的模拟来模拟增长率或死亡率的变化如何影响最终种群规模。

这些模拟使我们能够提取筛选中每个基因的药物诱导死亡率并去除其他混杂因素 首先，将细胞接种在黑色、透明底部的 96 孔板中，接种密度在每孔 1500 至 5， 000 个细胞之间。将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和湿度下孵育 16 至 24 小时。在含有先前优化的 Cytotox 浓度的培养基中制备药物稀释液。

使用最佳浓度的 Triton X 对一个板进行 Lyce 处理。然后将板放入读板器中，并使用优化设置在 T0 测量实验板中的细胞毒素荧光，然后在合适的稍后时间点测量。在最后一个时间点后，使用 Triton X 裂解实验板以确定每种条件的最终种群大小。

使用终点数据计算分数活力，并将结果拟合到剂量反应曲线。评估剂量反应曲线以确定诱导约 50% 细胞死亡的药物剂量。优化药物剂量诱导细胞死亡后，将非靶标 SG RNA 随机分配给非靶基因。

根据所选的截断策略修剪低计数的 SG RNA。通过使用 for 循环来评估 NPG 值的范围，模拟对净种群增长率或 NPG 的所有可能扰动。对于每个实验的单个 SG RNA，匹配最接近观察数据的模拟倍数变化，并将相应的相对生长速率分配给 SG RNA。

然后从活细胞计数数据中确定死亡前药物诱导的生长速率。将数据拟合到一个简单的指数方程中，以得出增长率。通过结合活细胞计数数据和药物等级值来计算死亡开始后药物诱导的生长速率。

在等级图上绘制所选药物剂量的等级。使用实验确定的药物诱导生长和死亡率之间的协调，创建一个模型来模拟药物诱导的种群规模随时间的变化。然后开发一个 Medusa 模型，其中包括 NPG、死亡前后药物诱导的生长速率（每小时翻倍）以及药物诱导的死亡率。

将起始时间点设置为零小时，并定义未处理和处理条件的最终时间点。模拟基线模型对生长率和死亡率的所有可能扰动。对于每个组合，计算在测定终点观察到的倍数变化的对数基数 2。

对于每个 SG RNA，对药物诱导的死亡率进行三角测量，这将产生观察到的倍数变化。首先提取预定的相对增长率。确定死亡发作前后药物诱导的生长速率。

应用 NPG 的相对生长速率来计算死亡开始前后药物诱导生长速率的比例生长速率。使用 NPG 的约束，死亡开始前后药物诱导的生长速率，确定最接近每个 SG RNA 观察到的倍数变化的模拟倍数变化。确定文库中每个基因的基因水平生长和死亡率。

计算与每个基因相关的所有 SG RNA 的平均生长率和死亡率，通常范围为 4 到 10 个 SG RNA。要计算经验 P 值，请引导 SG RNA 水平数据并使用 Benjamin Hochberg 程序应用错误发现率校正。U2 OS 细胞的活力分数以剂量依赖性方式降低，96 小时后在 5 微摩尔依托泊苷中观察到约 50% 的致死率。

暴露于 5 微摩尔依托泊苷 4 天后，恢复的群体大小减少了 40%至 50%，证实了药物治疗期间的细胞死亡。等级分析预测，5 微摩尔依托泊苷导致生长速率显着降低，细胞死亡仅在完全生长停滞后开始。美杜莎分析显示，XRCC 5 基因敲除细胞在未经治疗的条件下生长缓慢，在依托泊苷处理下药物诱导的死亡率高。

验证实验证实，XRCC 5 敲除细胞在未处理的条件下生长较慢，依托泊苷下的死亡率升高，这与 Medusa 的预测一致。