Wir wünschen den Mitgliedern des Brown und Lam-Labors für ihre Teilnahme an der kritischen Beurteilung dieses Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research und Michael Smith Foundation for Health Research unterstützt.

DNA-Extraktion und Probenvorbereitung DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben (kultivierten Zellen, Frischplasma sowie Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Gewebe) kann für MeDIP verwendet werden. Es ist wichtig, hochreine DNA ohne assoziierte Proteine ​​wie Histone verwenden. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich zu entfernen RNA aus der Probe, wie es mit den beiden DNA-Quantifizierung und Antikörperbindung stören können. Die DNA-Menge für MeDIP verwendet werden kann von 200 ng bis 1 ug je nach der Menge der DNA verfügbaren Bereich. Um dies zu demonstrieren Protokoll wird 1 pg DNA verwendet werden. Das folgende Protokoll wird eine hohe Qualität doppelsträngigen DNA aus kultivierten Zellen. Andere Protokolle sollten für die Extraktion von DNA aus anderen Probentypen eingesetzt werden. <ol><li> Add 400 ul der Verdauung Puffer, um sich ein Zellpellet in einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add 100 ug Proteinase K, um das Rohr, beimpft und über Nacht bei 50 ° C. </li><li> Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3 bis 5 einmal. </li><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Add 40 ug RNase A und Inkubation 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 11 bis 13 einmal. </li><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Add 1:10 Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und gut mischen. </li><li> Add 2 Bände (900 ul) von 100% Ethanol, gut mischen und bei -20 ° C für 20 Minuten. </li><li> Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol. </li><li> Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren. </li><li> An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen. </li><li> Resuspendieren DNA in 50 ul sterilisiert dH2O Nacht bei 4 ° C. </li><li> Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer NanoDrop. Ein A ​​260: A 280-Verhältnis von 1,8 ist ideal. </li><li> Bestimmen DNA Qualität und Größenordnung auf einem Agarosegel mit 100 bp Leiter. So wenig wie 10 ng der genomischen DNA kann auf einem 1,7% Agarosegel laufen gelassen werden, gefolgt von Färbung mit einem Farbstoff, der sehr empfindlich auf kleine Mengen an DNA wie SYBR Gold ist. </li><li> In einem silikonisierten Röhrchen pro Probe vorzubereiten 1 ug DNA in einem Gesamtvolumen von 50 ul mit dem Rest der Band machte sich mit einem sterilisierten dH 2 O. </li></ol> DNA Beschallung DNA Beschallung und die MeDIP Protokoll muss in siliconzied Rohren durchgeführt werden, um unspezifische Bindung von Proteinen an Rohrwandungen zu verhindern. Optimale Beschallung Zeiten für die DNA-Proben werden nach dem Grad der DNA-Probe Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) bestimmt wird. Zum Beispiel sollten DNA aus kultivierten Zellen extrahiert von sehr hohem Molekulargewicht, und wird nachträglich verlangen mehr Beschallung als DNA von Archivalien Proben, die oft teilweise abgebaut extrahiert. Wenn Proben gleichmäßig hohem Molekulargewicht sind, ist es an dieser Stelle sinnvoll, mit der Beschallung in diesem Protokoll, ohne zu überprüfen jede Probe einzeln beschrieben vorgehen. Wenn Proben mit archivalischen Proben fragmentiert sind, wird es notwendig sein, um die Beschallung Verfahren wahrscheinlich durch eine Verringerung der Beschallung mal bis 300-100bp Fragmente erhalten anzupassen. Wenn Sie erwarten, dass Proben, die teilweise abgebaut, Optimierung von Ultraschall-Parameter können auf einer repräsentativen Stichprobe von denen Interesse durchgeführt werden, zu verarbeiten. Basierend auf den Grad der DNA-Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) beobachtet, kann der Experimentator im Voraus die optimale Beschallung Zeit für die Probe. Hier beschreiben wir eine Methode, um 300-1000 bp DNA-Fragmente durch Beschallung erhalten eine automatisierte Beschallung Gerät (Bioruptor aus Diagenode, UCD-200 TM) mit hohem Molekulargewicht DNA. <ol><li> Wasser in Biorupter müssen bei 4 ° C. </li><li> Mit Ultraschall für 7 Minuten auf die automatischen Einstellungen (30 sec auf 30 sec off bei maximaler Leistung). </li><li> Entfernen 800 ng (40 ul) beschallt Produkt und in silikonisierten 1,7 ml Zentrifugenröhrchen für die Immunpräzipitation (IP)-Reaktion. </li><li> Beiseite restlichen 200 ng (10 ul), die als Eingabe dienen (IN) Referenz-DNA (lagern bei 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON von methylierter DNA <ol><li> Denaturieren die DNA, die für IP Reaktion (800 ng) bei 95 ° C wird für 10 Minuten in einem Wasserbad verwendet. </li><li> Coole sofort auf Eis. Lassen DNA vollständig abkühlen lassen (ca. 5 min auf Eis), bevor Sie fortfahren mit dem nächsten Schritt. </li><li> Add 5 ug monoklonaler Antikörper. </li><li> Fügen Sie IP-Puffer (verwendet bei Raumtemperatur in diesem Protokoll) auf ein Endvolumen von 500 ul. </li><li> Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C in Drehrohr Inhaber. </li><li> Kurz vor Schritt 5 abgeschlossen ist, bereiten Dynabeads durch Waschen (Schritte 6-11). Zunächst resuspendieren die Perlen gründlich in die Flasche durch Vortexen. </li><li> Transfer-30 pl (~ 2 x 10 7) des resuspendierten Dynabeads pro Reaktion plus 1, in eine neue silikonisierten Röhrchen (zum Beispiel, wenn dabei 8 Reaktionen, entfernen Sie genug Kugeln für 9, als 270 ul). </li><li> Das Röhrchen wird auf die magnetische Ablage für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette aus dem Überstand. Beim Entfernen Überstand, berühren Sie die Perlen gegen Innenwand (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten und resuspendieren die Perlen in einem Überschuss Volumen von IP-Puffer (750 ul-1000 ul). Das Röhrchen wieder auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal, und dann resuspendieren gewaschenen Beads in IP-Puffer in das ursprüngliche Volumen in Step 7 entfernt. </li><li> Add 30 ul gewaschen Dynabeads jedem IP Reaktion </li><li> Inkubieren in einem Drehrohr Halter für 2 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation abgeschlossen ist, setzen Sie den Schlauch auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette aus dem Überstand. Berühren Sie nicht die Innenwand des Rohres (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze. Add 500 ul von IP-Puffer. Mix der Inhalt des Röhrchens und legte sie zurück auf die magnetische Ablage für 2 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche mit 500 ul IP-Puffer einmal. </li><li> Nach dem Entfernen der Überstand aus der letzten Waschung resuspendieren die Perlen in 400 ul der Verdauung Puffer. </li><li> Behandeln Sie die Reaktion mit 100 ug Proteinase K und Inkubation über Nacht bei 50 ° C. </li></ol> REINIGUNG VON immunpräzipitiert DNA <ol><li> Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und gründlich vortexen. </li><li> Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, wenn die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Schichten trüb erscheint. </li><li> Add 1 / 10 th Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und Wirbel. </li><li> Add 1 ul Glykogen (20 ug / ul) und Wirbel. </li><li> Add 2 Bände (1000 ul) von 100% Ethanol, vortexen und bei -20 ° C für 20 Minuten. </li><li> Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol. </li><li> Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Vortex kurz und drehen sich mit 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren. </li><li> An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen. </li><li> Resuspendieren DNA-Pellet in 10 ul sterilisiert dH 2 0. </li></ol> VALIDIERUNG VON PCR <ol><li> Sie können testen, um sicherzustellen, dass Ihre MeDIP Verfahren wird durch Ausführen der MeDIP Protokoll mit normalen menschlichen DNA (männlich oder weiblich) arbeiten, und anschließend Testen einer Region bekannt für Methylierung angereichert werden. </li><li> Nehmen Sie 30% der MeDIP Produkt PCR-Röhrchen, und weitere 30% der MeDIP Produkt auf ein anderes PCR-Röhrchen. </li><li> Setzen Sie 10 ng IN DNA in ein PCR-Röhrchen und 10 ng IN DNA in eine andere PCR-Röhrchen. Sie sollten nun vier separate PCR-Reaktionen einzurichten. </li><li> Führen Sie die PCR mit H19 und STRG-Primer wie in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Bereiten Sie zwei Mastermix (eine für jedes Primer-Set) für PCR-Reaktionen mit 12,5 ul Gesamtvolumen wie in Tabelle 2 dargestellt. </li><li> Thermocycle der PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 dargestellt. </li><li> Run 5 ul der PCR-Produkte auf einem 2% Agarosegel für die Visualisierung. </li><li> Die erwarteten Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP sind in Tabelle 4 dargestellt. </li></ol> Tabellen Tabelle 1: H19 und STRG-Primer für PCR-Validierung. <table border="1"><tbody><tr><td> Primer Set </td><td> Vorwärts-Primer </td><td> Reverse-Primer </td><td> Erwartete Produkt-Größe </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (Kontrolle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Mastermix für die PCR-Reaktionen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (pro Rxn) </td><td> CTRL Mix (pro Rxn) </td></tr><tr><td&gt; ddH 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> 10x Buffer </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP-Mix (10 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Grundierungen (H19_F / R oder CTRL_F / R) (10 uM jedes F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. PCR thermocyling Bedingungen. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05.00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00.30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00.30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00.15 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Erwartete PCR-Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Template DNA </td></tr><tr><td> Primer verwendet </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positiv </td><td> Positiv </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positiv </td><td> Negativ </td></tr></tbody></table>

<ol>
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Es gibt ein wachsendes Bewusstsein für die wichtige Rolle der DNA-Methylierung spielt in Krankheit, sind daher die Entwicklung von Assays, um diese Änderung zu messen zunehmend an Bedeutung 3, 12, 13. Die MeDIP Technik ist ein Werkzeug für das Screening zugänglich sowohl den gesamten Genoms und Locus-spezifische Level 6, 7. Diese Technik bietet eine schnelle Ansicht von DNA-Methylierungs-Ebenen mit begrenzten Mengen an Ausgangs-DNA und ermöglicht eine einfache Vergleiche zwischen verschiedenen...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biorupter sonicator</td>
<td>Tool</td>
<td>Diagenode</td>
<td>UCD-200 TM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Sorenson BioScience</td>
<td>11510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ND 3300 Spectrophotometer</td>
<td>Tool</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibody: Anti-5'-methylcytosine mouse mAb</td>
<td>Reagent</td>
<td>CalBiochem</td>
<td>162 33 D3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>112-01D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Tube Rack</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>CS15000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini LabRoller</td>
<td>Tool</td>
<td>Labnet International</td>
<td>H5500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IP Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>Digestion Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methylated dna immunoprecipitation

Die Identifizierung von DNA-Methylierungs-Muster ist ein übliches Verfahren in der Studie der Epigenetik, wie Methylierung ist bekannt, dass mit erheblichen Auswirkungen auf die Genexpression haben, und ist mit der normalen Entwicklung sowie Krankheit beteiligt<sup&gt; 1-4</sup&gt;. So ist die Fähigkeit, zwischen methylierter DNA und nicht methylierter DNA zu unterscheiden wesentlichen für die Erzeugung Methylierung Profile für solche Studien. Methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) ist eine hocheffiziente Technik zur Gewinnung von methylierter DNA aus einer Probe von Interesse<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Eine Probe von weniger als 200 ng der DNA ist ausreichend für den Antikörper oder Immunpräzipitation (IP), Reaktion. DNA in Fragmente mit einer Größe von 300-1000 bp beschallt, und ist in immunpräzipitiert (IP) und Eingang (IN) Abschnitte unterteilt. IP DNA wird anschließend Hitze denaturiert und dann mit anti-5&#39;mC inkubiert, so dass der monoklonale Antikörper an methylierte DNA binden. Danach werden magnetische Kügelchen mit einem sekundären Antikörper mit einer Affinität für den primären Antikörper zugegeben und inkubiert. Diese Wulst-linked Antikörper binden die monoklonalen Antikörper in der ersten Stufe eingesetzt. DNA gebunden an die Antikörper-Komplex (methylierte DNA) wird aus dem Rest der DNA mit Hilfe eines Magneten, um die Komplexe zu ziehen aus der Lösung getrennt. Mehrmaligem Waschen mit IP-Puffer werden dann durchgeführt, um die ungebundenen, nicht-methylierte DNA zu entfernen. Das methylierte DNA / Antikörper-Komplexe werden dann mit Proteinase K verdaut, um die Antikörper so dass nur die methylierte DNA intakt zu verdauen. Die angereicherte DNA wird durch Phenol gereinigt: Chloroform-Extraktion an das Protein Stoffe zu entfernen und dann gefällt und in Wasser resuspendiert für die spätere Verwendung. PCR-Techniken können verwendet werden, um die Effizienz der MeDIP Verfahren durch eine Analyse der Amplifikationsprodukte von IP und IN DNA für Regionen bekannt, Mangel und bekannte methylierte Sequenzen enthalten validieren. Das gereinigte methylierte DNA kann dann für Locus-spezifischen (PCR) oder genomweite (Microarray-und Sequenzierung) Methylierung Studien verwendet werden, und ist besonders nützlich, wenn sie in Verbindung mit anderen Forschungs-Tools wie Genexpressions-Profiling-und Array-vergleichende Genom-Hybridisierung angewendet ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Weitere Untersuchungen in der DNA-Methylierung wird die Entdeckung von neuen epigenetischen Zielen, was wiederum nützlich sein bei der Entwicklung von neuen therapeutischen oder prognostischen Forschungsinstrumente für Krankheiten wie Krebs, die von methylierter DNA charakterisiert werden kann dazu führen,<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

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Methylated DNA Immunoprecipitation

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Methylated DNA Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Forschung

Biologie

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters within the origin of replication1. Beyond the origin, SeqA is found at the replication forks, where it organizes newly replicated DNA into higher ordered structures2. SeqA associates only weakly with single GATC sequences, but it forms high affinity complexes with DNA duplexes containing multiple GATC sites. The minimal functional and structural unit of SeqA is a dimer, thereby explaining the requirement of at least two GATC sequences to form a high-affinity complex with hemimethylated DNA3. Additionally, the SeqA architecture, with the oligomerization and DNA-binding domains separated by a flexible linker, allows binding to GATC repeats separated by up to three helical turns. Therefore, understanding the function of SeqA at a molecular level requires the structural analysis of SeqA bound to multiple GATC sequences. In protein-DNA crystallization, DNA can have none to an exceptional effect on the packing interactions depending on the relative sizes and architecture of the protein and the DNA. If the protein is larger than the DNA or footprints most of the DNA, the crystal packing is primarily mediated by protein-protein interactions. Conversely, when the protein is the same size or smaller than the DNA or it only covers a fraction of the DNA, DNA-DNA and DNA-protein interactions dominate crystal packing. Therefore, crystallization of protein-DNA complexes requires the systematic screening of DNA length4 and DNA ends (blunt or overhang)5-7. In this report, we describe how to design, optimize, purify and crystallize hemimethylated DNA duplexes containing tandem GATC repeats in complex with a dimeric variant of SeqA (SeqA&Delta;(41-59)-A25R) to obtain crystals suitable for structure determination.

Crystal structure of protein&#x2013;DNA complexes can provide insight into protein function, mechanism, as well as, the nature of the specific interaction. Here, we report how to optimize the length, sequence and ends of duplex DNA for co-crystallization with Escherichia coli SeqA, a negative regulator of replication initiation.

Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...