Nous tenons à remercier les membres de la Brown et laboratoires Lam pour leur participation à la critique de cette vidéo et de l&#39;article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé et de la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé.

EXTRACTION D&#39;ADN et préparation des échantillons L&#39;ADN d&#39;une variété de différents échantillons (cellules en culture, frais congelé ainsi que des tissus de paraffine fixés au formol intégrés) peut être utilisé pour MeDIP. Il est important d&#39;utiliser l&#39;ADN hautement purifié, sans protéines associées telles que les histones. Il est également important de retirer l&#39;ARN autant que possible de l&#39;échantillon, car il peut interférer avec une quantification ADN et liaison à l&#39;anticorps. La quantité d&#39;ADN utilisée pour MeDIP peut varier de 200 ng à 1 pg en fonction de la quantité d&#39;ADN disponibles. Pour démontrer ce protocole, 1 pg d&#39;ADN sera utilisé. Le protocole suivant permettra de haute qualité d&#39;ADN double brin à partir des cellules cultivées. D&#39;autres protocoles devraient être employées pour l&#39;extraction de l&#39;ADN d&#39;autres types d&#39;échantillons. <ol><li> Ajouter 400 ul de tampon de digestion d&#39;un culot cellulaire dans un tube de 1,7 ml Eppendorf. </li><li> Ajouter 100 ug de la protéinase K dans le tube et incuber une nuit à 50 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 3 à 5 fois. </li><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 40 ug de RNase A et incuber 1 h à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 11 à 13 fois. </li><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter le volume 1/10ème acétate de sodium 3 M (40 pi) et bien mélanger. </li><li> Ajouter 2 volumes (900 pi) d&#39;éthanol à 100%, bien mélanger, et placer à -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol froid à 70% pour se laver. Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol à 70%, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel par pipetage. </li><li> Sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d&#39;éthanol résiduelle. </li><li> Resuspendre l&#39;ADN dans 50 ul de dH2O stérilisés nuit à 4 ° C. </li><li> Quantifier l&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop. Un A 260: Un ratio de 1,8 280 est idéal. </li><li> Déterminer la qualité de l&#39;ADN et gamme de taille sur un gel d&#39;agarose avec 100 pb échelle. Aussi peu que 10 ng d&#39;ADN génomique peut être exécuté sur un gel d&#39;agarose 1,7% suivie d&#39;une coloration à l&#39;aide d&#39;un colorant qui est très sensible à de petites quantités d&#39;ADN tels que SYBR Gold. </li><li> Dans un tube siliconé par échantillon, préparer 1 pg d&#39;ADN dans un volume total de 50 pi avec le reste du volume faite avec stérilisés dH 2 O. </li></ol> L&#39;ADN SONICATION Sonication de l&#39;ADN et le protocole MeDIP doit être effectuée dans des tubes siliconzied pour empêcher la liaison non spécifique des protéines à parois du tube. Fois sonication optimale pour les échantillons d&#39;ADN sont basées sur le degré de fragmentation échantillon d&#39;ADN tel que déterminé par électrophorèse sur gel (étape 27). Par exemple, l&#39;ADN extrait de cellules cultivées devraient être de très haut poids moléculaire, et sera par la suite besoin de plus de sonication que l&#39;ADN extrait d&#39;échantillons d&#39;archives qui sont souvent partiellement dégradés. Si les échantillons sont de poids moléculaire élevé et uniforme, il est raisonnable à ce stade de procéder à la sonication comme décrit dans le présent Protocole sans vérifier chaque échantillon individuellement. Si les échantillons sont fragmentés avec des échantillons d&#39;archives, il sera nécessaire d&#39;adapter la procédure sonication vraisemblablement en diminuant les temps sonication pour obtenir 300 100 points de base de fragments. Si vous envisagez de traiter des échantillons qui sont partiellement dégradés, l&#39;optimisation des paramètres de sonication peut être effectuée sur un échantillon représentatif de ceux qui vous intéressent. Basé sur le degré de fragmentation de l&#39;ADN observée de l&#39;électrophorèse sur gel (étape 27), l&#39;expérimentateur peut prédéterminer le temps de sonication optimale pour l&#39;échantillon. Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des fragments d&#39;ADN 300-1000 pb par sonication avec un dispositif automatisé sonication (Bioruptor partir Diagenode, UCD-200 TM) en utilisant l&#39;ADN de haute masse moléculaire. <ol><li> L&#39;eau dans Biorupter doit être à 4 ° C. </li><li> Soniquer pour 7 minutes sur les réglages automatiques (30 sec 30 sec sur le descendre à puissance maximale). </li><li> Retirer 800 ng (40 pi) de produit et le placer dans soniqué siliconé 1,7 ml tube de centrifugeuse pour l&#39;immunoprécipitation (IP) de réaction. </li><li> Mettez de côté restante de 200 ng (10 pi) pour servir d&#39;entrée (IN) d&#39;ADN de référence (conserver à 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON D&#39;ADN méthylé <ol><li> Dénaturer l&#39;ADN qui sera utilisé pour la réaction de propriété intellectuelle (800 ng) à 95 ° C pendant 10 min dans un bain d&#39;eau. </li><li> Refroidir immédiatement sur la glace. Laissez refroidir complètement l&#39;ADN (environ 5 minutes sur la glace) avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter 5 g d&#39;anticorps monoclonaux. </li><li> Ajouter tampon IP (utilisé à la température ambiante au long de ce protocole) pour un volume final de 500 pl. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 4 ° C en rotation porte-tube. </li><li> Juste avant l&#39;étape 5 est terminée, préparer Dynabeads par lavage (étapes 6-11). Tout d&#39;abord, remettre en suspension les perles à fond dans le flacon au vortex. </li><li> Transfert 30 pl (~ 2 x 10 7) du Dynabeads resuspendu par réaction plus 1, dans un nouveau tube siliconé (par exemple, si, ce faisant 8 réactions, enlever assez de billes pour le 9, soit 270 pl). </li><li> Placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Pipeter le surnageant. Lors du retrait de surnageant, évitez de toucher les billes de l&#39;intérieur contre le mur (où les perles attirent l&#39;aimant) avec la pointe de la pipette. </li><li> Enlevez le tube de l&#39;aimant, et remettre en suspension les perles dans un volume de plus de mémoire tampon IP (750 ul ul-1000). Placer le tube de retour sur la grille magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Répétez le laver une fois de plus, puis remettre en suspension les billes lavées dans un tampon de propriété intellectuelle dans le premier volume retiré à l&#39;étape 7. </li><li> Ajouter 30 ul de Dynabeads lavés à chaque réaction IP </li><li> Incuber dans un porte-tube en rotation pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Après incubation est terminée, placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Pipeter le surnageant. Evitez de toucher le mur à l&#39;intérieur du tube (où les perles attirent l&#39;aimant) avec la pointe de la pipette. Ajouter 500 pi de tampon de propriété intellectuelle. Mélanger le contenu du tube et de le remettre sur la grille magnétique pour 2 mn. Répétez laver avec tampon de 500 ul IP en même temps. </li><li> Après avoir retiré le surnageant du dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 400 ul de tampon de digestion. </li><li> Traiter la réaction avec 100 ug de protéinase K et incuber une nuit à 50 ° C. </li></ol> Purification de l&#39;ADN immunoprécipité <ol><li> Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme et vortex 7 à fond. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes 1 à 3 si l&#39;interphase entre les phases aqueuse et organique semble brouillée. </li><li> Ajouter 1 / 10 ème de volume d&#39;acétate de sodium 3 M (40 pi) et de vortex. </li><li> Ajouter 1 l de glycogène (20 pg / pl) et vortex. </li><li> Ajouter 2 volumes (1000 pi) de l&#39;éthanol à 100%, vortex, et au lieu de -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol froid à 70% pour se laver. Brièvement au vortex et spin à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Enlever l&#39;éthanol à 70%, le spin d&#39;impulsion, et éliminer l&#39;éthanol résiduel par pipetage. </li><li> Sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d&#39;éthanol résiduelle. </li><li> Resuspendre culot d&#39;ADN dans 10 ul stérilisés dH 2 0. </li></ol> VALIDATION PAR PCR <ol><li> Vous pouvez tester afin de s&#39;assurer que votre procédure MeDIP travaille en effectuant le protocole MeDIP aide normale de l&#39;ADN humain (homme ou femme), et ensuite doser une région connue pour être enrichi pour la méthylation. </li><li> Retirer 30% du produit MeDIP au tube de PCR, et un autre 30% du produit MeDIP à un autre tube de PCR. </li><li> Mettez 10 ng de l&#39;ADN EN dans un tube PCR, et 10 ng de l&#39;ADN EN dans un autre tube de PCR. Vous devriez maintenant avoir quatre réactions PCR séparées de mettre en place. </li><li> Effectuer PCR en utilisant H19 et CTRL amorces comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Préparer deux mastermixes (un pour chaque ensemble d&#39;amorces) pour les réactions PCR avec 12,5 ul volume total comme indiqué dans le tableau 2. </li><li> Thermocycle la PCR en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 3. </li><li> Exécuter 5 pl de produits de PCR sur un gel agarose à 2% pour la visualisation. </li><li> Les résultats attendus pour MeDIP succès sont présentés dans le Tableau 4. </li></ol> Tableaux Tableau 1: H19 et CTRL amorces pour la validation de la PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Ensemble d&#39;amorces </td><td> Amorce sens </td><td> Amorce antisens </td><td> Taille du produit anticipé </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 pb </td></tr><tr><td> CTRL (contrôle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 pb </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Mastermixes pour les réactions PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (par Rxn) </td><td> CTRL Mix (par Rxn) </td></tr><tr><td&gt; ddH 2 O </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> Tampon 10X </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> mélange de dNTP (10 mM chacun) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Amorces (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 uM de chaque F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. PCR conditions thermocyling. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Résultats attendus PCR pour MeDIP succès. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> Matrice d&#39;ADN </td></tr><tr><td> Amorce utilisée </td><td> EN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positive </td><td> Positive </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positive </td><td> Négative </td></tr></tbody></table>

<ol>
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Il ya une conscience croissante de la joue rôle important dans la maladie de méthylation de l&#39;ADN, donc le développement de tests pour mesurer cette modification sont de plus en plus important 3, 12, 13. La technique est un outil MeDIP prête pour le dépistage à la fois l&#39;ensemble du génome et spécifiques de locus niveau 6, 7. Cette technique offre une vue rapide des niveaux de méthylation de l&#39;ADN en utilisant des quantités limitées de démarrage de l&#39;ADN et permet des co...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biorupter sonicator</td>
<td>Tool</td>
<td>Diagenode</td>
<td>UCD-200 TM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Sorenson BioScience</td>
<td>11510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ND 3300 Spectrophotometer</td>
<td>Tool</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibody: Anti-5'-methylcytosine mouse mAb</td>
<td>Reagent</td>
<td>CalBiochem</td>
<td>162 33 D3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>112-01D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Tube Rack</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>CS15000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini LabRoller</td>
<td>Tool</td>
<td>Labnet International</td>
<td>H5500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IP Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>Digestion Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methylated dna immunoprecipitation

L&#39;identification de modèles de méthylation d&#39;ADN est une procédure commune à l&#39;étude de l&#39;épigénétique, la méthylation est connu pour avoir des effets significatifs sur l&#39;expression des gènes, et est impliqué dans le développement normal ainsi que les maladies<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Ainsi, la capacité à discriminer entre l&#39;ADN méthylé et non méthylés d&#39;ADN est essentielle pour générer des profils de méthylation pour de telles études. Méthylés d&#39;ADN immunoprécipitation (MeDIP) est une technique efficace pour l&#39;extraction de l&#39;ADN méthylé à partir d&#39;un échantillon d&#39;intérêt<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Un échantillon d&#39;aussi peu que 200 ng d&#39;ADN est suffisante pour l&#39;anticorps, ou immunoprécipitation (IP), la réaction. L&#39;ADN est traité par ultrasons en fragments d&#39;une taille allant 300-1000 pb, et est divisé en immunoprécipité (IP) et d&#39;entrée (IN) portions. L&#39;ADN IP est ensuite dénaturé à la chaleur et ensuite incubées avec des anti-5&#39;mC, permettant à l&#39;anticorps monoclonal de lier l&#39;ADN méthylé. Après cela, les billes magnétiques contenant un anticorps secondaire ayant une affinité pour l&#39;anticorps primaire sont ajoutés et incubés. Ces anticorps perles liés liera l&#39;anticorps monoclonal utilisé dans la première étape. ADN lié au complexe anticorps (ADN méthylé) est séparé du reste de l&#39;ADN en utilisant un aimant pour tirer les complexes de la solution. Plusieurs lavages à l&#39;aide du tampon IP sont ensuite effectuées pour enlever le non consolidées, non méthylés d&#39;ADN. L&#39;ADN méthylé / anticorps sont ensuite digérés par la protéinase K pour digérer les anticorps ne laissant que l&#39;ADN méthylé intacte. L&#39;ADN est purifié enrichi par le phénol: l&#39;extraction du chloroforme pour éliminer la matière protéique et ensuite précipité et resuspendu dans de l&#39;eau pour une utilisation ultérieure. Les techniques de PCR peut être utilisée pour valider l&#39;efficacité de la procédure MeDIP par l&#39;analyse des produits d&#39;amplification de l&#39;ADN IP et IN pour les régions connues pour manque et connu pour contenir des séquences méthylées. L&#39;ADN purifié méthylées peuvent alors être utilisées pour les locus spécifiques (PCR) ou l&#39;ensemble du génome (biopuces et séquençage) des études de méthylation, et est particulièrement utile lorsqu&#39;il est appliqué en conjonction avec d&#39;autres outils de recherche tels que le profilage d&#39;expression génique et d&#39;hybridation génomique comparative sur microréseau ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Une enquête plus approfondie méthylation de l&#39;ADN va conduire à la découverte de nouvelles cibles épigénétiques, qui à leur tour, peuvent être utiles au développement de nouveaux outils de recherche thérapeutique ou pronostique pour les maladies comme le cancer qui sont caractérisées par l&#39;ADN méthylé aberrante<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

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Methylated DNA Immunoprecipitation

Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d&#39;ADN méthylé à partir d&#39;un échantillon d&#39;ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Research

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Biology

23.2K vues.  BC Cancer Research Centre. Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

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Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

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Biologie

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

L&#39;ADN des isotopes stables de palpage (ADN-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l&#39;aide Drosophila Tissus

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Gravité réduite manifestations Environnement matérielles d&#39;un cytomètre de flux et Compagnon microfluidique technologie de mélange prototype miniaturisé

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...