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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Rockefeller University

&#x5404;&#x79CD;&#x53CC;&#x57DF; AAA + &#x4E09;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x6BD4;&#x8F83;&#x663E;&#x793A;&#x886C;&#x780C;&#x7684; D1 &#x57DF;&#x4E2D;&#x592E;&#x6BDB;&#x5B54;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4E2D;&#x6709;&#x7740;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x533A;&#x522B;&#x3002;&#x7EC6;&#x83CC;&#x4E2D;&#x7535;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x548C;&#x53E4;&#x83CC;&#x589E;&#x503C;&#x7A0E;&#x86CB;&#x767D;&#x86CB;&#x767D; unfoldases &#x5728;&#x4E2D;&#x592E; D1 &#x5B54;&#x9699;&#x4E2D;&#x6709;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E00;&#x4E2A;&#x82B3;&#x9999;&#x6B8B;&#x7559;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x771F;&#x6838; p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09;/&#x6B21;&#x4E8E;&#x86CB;&#x767D;&#x5BB6;&#x65CF;&#x7684;&#x6210;&#x5458;&#x6CA1;&#x6709;&#x82B3;&#x9999;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x5728; D1 &#x5B54;&#x9699;&#x4E2D;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5C55;&#x5F00;&#x6D3B;&#x52A8;&#x7684;&#x589E;&#x503C;&#x7A0E;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6; AAA + &#x4E09;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x5BF9;&#x6B64;&#x4E2D;&#x592E;&#x5B54;&#x9699;&#x4E2D;&#x7684;&#x82B3;&#x9999;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;P97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09;/&#x6B21;&#x4E8E;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x4F53;&#x5916;&#x4E0D;&#x8868;&#x660E; Unfoldase &#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4EA4;&#x6362;&#x4E86;&#x4E24;&#x4E2A;&#x8102;&#x80AA;&#x6B8B;&#x7559;&#x4EAE;&#x6C28;&#x9178;&#x548C;&#x4E19;&#x6C28;&#x9178;&#x82B3;&#x9999;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x5728;&#x5168;&#x957F; p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09; &#x548C; p97DeltaN&#xFF0C;&#x4E00;&#x79CD;&#x622A;&#x65AD; p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09; &#x7684;&#x5F62;&#x5F0F;&#x7F3A;&#x4E4F; N &#x57DF; D1 &#x6BDB;&#x5B54;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5355;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6216; D1 &#x7684;&#x4E2D;&#x592E;&#x6BDB;&#x5B54;&#x5185;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x57FA;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; p97DeltaN &#x53D8;&#x91CF;&#x5C55;&#x5F00;&#x7684;&#x4E2D;&#x7535;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x548C;&#x589E;&#x503C;&#x7A0E;&#x6A21;&#x578B;&#x57FA;&#x677F; YFP-ssrA&#xFF0C;&#x800C;&#x5168;&#x957F; p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09; &#x4E0E;&#x82B3;&#x9999;&#x5B54;&#x9699;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x548C;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09; &#x6216; p97DeltaN &#x4E0D;&#x8FD9;&#x6837;&#x505A;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;p97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09; &#x53EF;&#x4EE5;&#x65BD;&#x52A0; unfoldase &#x4F53;&#x5916;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x53EA;&#x8981;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5355;&#x4E00;&#x7684;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4E2D;&#x5F15;&#x5165; D1 &#x5B54;&#x9699;&#x548C; N &#x57DF;&#x5C06;&#x88AB;&#x5220;&#x9664;&#x3002;

P97 &#x9ED1;&#x8272;&#xFF09;/&#x6B21;&#x4E8E;&#x7A81;&#x53D8;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x5C55;&#x5F00;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;

A comparison of the protein sequences of various two-domain AAA+ ATPases revealed a striking difference in the residues lining the central pore of the D1 domain. The protein unfoldases of the bacterial Clp family and the archaeal VAT protein have at least one aromatic residue in the central D1 pore. In contrast, none of the members of the eukaryotic p97/VCP protein family has an aromatic residue in the D1 pore. The protein unfolding activity of VAT and other AAA+ ATPases is critically dependent on the presence of aromatic residues in this central pore. Unfoldase activity has not been demonstrated for the p97/VCP family in vitro. Thus, we exchanged the two aliphatic residues leucine and alanine of the D1 pore for aromatic tyrosine residues in full length p97 and in p97DeltaN, a truncated form of p97 lacking the N domain. We found that the mutant p97DeltaN variants with a single tyrosine or with two tyrosine residues in the central pore of D1 unfold the Clp family and VAT model substrate YFP-ssrA, whereas full length p97 with aromatic pore residues and wild-type p97 or p97DeltaN do not. Thus, p97 can exert unfoldase activity in vitro, provided that a single tyrosine residue is introduced into the D1 pore and that the N domain is deleted.

Mutations in p97/VCP induce unfolding activity.

Une comparaison des s&eacute;quences prot&eacute;iques de deux domaines diff&eacute;rents AAA + ATPases a r&eacute;v&eacute;l&eacute; une diff&eacute;rence frappante dans les r&eacute;sidus tapissant le pore central du domaine D1. Les unfoldases de prot&eacute;ine de la famille bact&eacute;rienne du Clp et la prot&eacute;ine de TVA archaeal ont au moins un r&eacute;sidus aromatiques dans le pore central de D1. En revanche, aucun des membres de la famille des prot&eacute;ines eucaryotes de p97/VCP a un r&eacute;sidu aromatique dans le pore de D1. L&#39;activit&eacute; se d&eacute;roule de prot&eacute;ine de la TVA et autres AAA + ATPases est gravement d&eacute;pendante de la pr&eacute;sence de r&eacute;sidus aromatiques dans ce pore central. Unfoldase activit&eacute; n&#39;a pas &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute;e pour la famille p97/VCP in vitro. Ainsi, nous avons &eacute;chang&eacute; les deux leucine r&eacute;sidus aliphatiques et alanine du pore D1 pour les r&eacute;sidus de tyrosine aromatiques en pleine longueur p97 et en p97DeltaN, une forme tronqu&eacute;e de p97 manque le domaine N. Nous avons constat&eacute; que les variantes mutantes p97DeltaN avec une tyrosine seule ou avec deux r&eacute;sidus de tyrosine dans le pore central de D1 d&eacute;roulent la famille Clp et substrat de mod&egrave;le TVA YFP-ERPS, p97 pleine longueur avec r&eacute;sidus aromatiques pore et p97 sauvage ou p97DeltaN ne le font pas. Ainsi, p97 peut exercer une activit&eacute; unfoldase in vitro, pourvu qu&#39;un r&eacute;sidu tyrosine unique est introduit dans le pore de D1 et que le domaine N est supprim&eacute;.

Les mutations dans p97/VCP induisent une activit&eacute; qui se d&eacute;roule.

Ein Vergleich der Protein-Sequenzen der verschiedenen zwei Dom&auml;nen AAA + ATPases ergab einen auffallenden Unterschied in den R&uuml;ckst&auml;nden, die Auskleidung der zentralen Pore der D1-Dom&auml;ne. Die Protein-Unfoldases der bakteriellen Clp-Familie und das Archaea VAT Protein haben mindestens eine aromatische R&uuml;ckstand in der zentralen D1-Pore. Im Gegensatz dazu hat keines der Mitglieder der eukaryotischen p97/VCP-Protein-Familie eine aromatische R&uuml;ckstand in der D1-Pore. Die Protein sich entfaltenden Aktivit&auml;t Mehrwertsteuer und andere AAA + ATPases ist kritisch abh&auml;ngig von aromatischen R&uuml;ckst&auml;nde in diesem zentralen Pore. Unfoldase-Aktivit&auml;t ist nicht f&uuml;r die in-vitro-p97/VCP-Familie nachgewiesen. So tauschten wir die beiden aliphatische R&uuml;ckst&auml;nde Leucin und Alanin der D1-Pore f&uuml;r aromatische Tyrosin R&uuml;ckst&auml;nde in voller L&auml;nge p97 und p97DeltaN, eine verk&uuml;rzte Form von p97 fehlt der N-Dom&auml;ne. Wir fanden, dass die mutierten p97DeltaN-Varianten mit einem einzigen Tyrosin oder mit zwei Tyrosin-R&uuml;ckst&auml;nde in der zentralen Pore D1 Clp Familie und VAT Modell Substrat YFP-SsrA, entfalten, w&auml;hrend in voller L&auml;nge p97 mit aromatischen Pore R&uuml;ckst&auml;nde und Wildtyp p97 oder p97DeltaN nicht. So p97 Unfoldase Aktivit&auml;t in vitro aus&uuml;ben kann, vorausgesetzt, dass ein einzelnes Tyrosin-R&uuml;ckstand in der D1-Pore und dass eingef&uuml;hrt wird die N-Dom&auml;ne wird gel&ouml;scht.

Mutationen im p97/VCP bewegen sich entfaltenden Aktivit&auml;t.

Un confronto delle sequenze della proteina di due domini diversi AAA + ATPases ha rivelato una differenza enorme nei residui fodera il poro centrale del dominio D1. La proteina unfoldases della famiglia Clp batterica e la proteina IVA archaeal hanno almeno un residuo aromatico nel poro centrale D1. Al contrario, nessuno dei membri della famiglia proteina p97/VCP eucariotica ha un residuo aromatico nel poro D1. L&#39;attivit&agrave; di dispiegarsi della proteina di IVA e di altre ATPases AAA + dipende criticamente sulla presenza di residui aromatici in questo poro centrale. Attivit&agrave; di Unfoldase non &egrave; stata dimostrata per la famiglia p97/VCP in vitro. Cos&igrave;, ci siamo scambiati i due residui alifatici leucina e alanina del poro D1 per residui aromatici tirosina in piena lunghezza p97 e in p97DeltaN, una forma troncata di p97 manca il dominio N. Abbiamo trovato che le varianti p97DeltaN mutante con una tirosina singolo o con due residui di tirosina nel poro centrale di D1 svolgersi la famiglia Clp e IVA modello substrato YFP-ssrA, considerando che non p97 full length con poro aromatico residui e p97 wild-type o p97DeltaN. Cos&igrave;, p97 pu&ograve; esercitare attivit&agrave; unfoldase in vitro, a condizione che un residuo di tirosina unico &egrave; stato introdotto nel poro D1 e che il dominio N viene eliminato.

Mutazioni in p97/VCP inducono attivit&agrave; dispiegarsi.

&#x69D8;&#x3005; &#x306A; 2 &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; AAA + Atpase &#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x6BD4;&#x8F03;&#x306F; D1 &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x4E2D;&#x592E;&#x5B54;&#x30E9;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3067;&#x306F;&#x9855;&#x8457;&#x306A;&#x9055;&#x3044;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E; Clp &#x5BB6;&#x65CF;&#x3068;&#x53E4;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E; VAT &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA; unfoldases &#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082; 1 &#x3064;&#x306E;&#x82B3;&#x9999;&#x65CF;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3067;&#x4E2D;&#x592E;&#x306E; D1 &#x5B54;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269; p97/VCP &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x30E1;&#x30F3;&#x30D0;&#x30FC;&#x306E;&#x3069;&#x308C;&#x3082; D1 &#x7D30;&#x5B54;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x82B3;&#x9999;&#x65CF;&#x6B8B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x4ED8;&#x52A0;&#x4FA1;&#x5024;&#x7A0E;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E; AAA + Atpase &#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30A2;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30EB;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306B;&#x6279;&#x5224;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x4E2D;&#x592E;&#x5B54;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x82B3;&#x9999;&#x65CF;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Unfoldase &#x6D3B;&#x52D5;&#x306F; in vitro p97/VCP &#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F; 2 &#x3064;&#x306E;&#x8102;&#x80AA;&#x65CF;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x30ED;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x3068;&#x30A2;&#x30E9;&#x30CB;&#x30F3; D1 &#x7D30;&#x5B54;&#x82B3;&#x9999;&#x65CF;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x5168;&#x9577; p97 &#x3068; p97DeltaN&#x3001;N &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7701;&#x7565;&#x5F62; p97 &#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4EA4;&#x63DB;&#x3002;&#x5168;&#x9577; p97 &#x306B;&#x82B3;&#x9999;&#x65CF;&#x7D30;&#x5B54;&#x6B8B;&#x57FA;&#x3068;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; p97 &#x307E;&#x305F;&#x306F; p97DeltaN &#x306F;&#x4ED8;&#x304D;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x5358;&#x4E00;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x307E;&#x305F;&#x306F; D1 &#x306E;&#x4E2D;&#x592E;&#x5B54;&#x3067;&#x306E; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5909;&#x7570; p97DeltaN &#x4E9C;&#x7A2E; Clp &#x5BB6;&#x65CF;&#x3068;&#x4ED8;&#x52A0;&#x4FA1;&#x5024;&#x7A0E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x57FA;&#x677F; YFP &#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x5C55;&#x958B;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;p97 &#x306F; unfoldase &#x6D3B;&#x6027;&#x306E; in vitro &#x3067;&#x51FA;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C; D1 &#x5B54;&#x3068;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x5C0E;&#x5165;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3068; N &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x524A;&#x9664;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

P97/VCP &#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x5C55;&#x958B;&#x3002;

&#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; 2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; AAA + Atpases&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xBE44;&#xAD50; D1 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xC911;&#xC559; &#xAE30; &#xACF5; &#xC548; &#xAC10; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB208;&#xC5D0; &#xB744;&#xB294; &#xCC28;&#xC774; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC138;&#xADE0;&#xC131; Clp &#xAC00;&#xC871;&#xACFC; archaeal &#xBD80;&#xAC00; &#xAC00;&#xCE58;&#xC138; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; unfoldases &#xC911;&#xC559; D1 &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xD5A5;&#xAE30;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0;. &#xBC18;&#xBA74; &#xC9C4; &#xD575; p97/VCP &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC00;&#xC871;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131;&#xC6D0; &#xC911; &#xB204;&#xAD6C;&#xB3C4; D1 &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xD5A5;&#xAE30;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xB294;. &#xBD80;&#xAC00; &#xAC00;&#xCE58;&#xC138; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; AAA + Atpases&#xC758; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC804;&#xAC1C; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; &#xBE44;&#xD310;&#xC801;&#xC774; &#xC911;&#xC559; &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xD5A5;&#xAE30;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Unfoldase &#xD65C;&#xB3D9; &#xCCB4; &#xC678; p97/VCP &#xAC00;&#xC871;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC99D;&#xBA85; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB450; &#xC9C0;&#xBC29; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC2E0; &#xBC0F; &#xC544;&#xB85C;&#xB9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC804;&#xCCB4; &#xAE38;&#xC774; p97 &#xBC0F; p97DeltaN, N &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBD80;&#xC871; p97&#xC758; &#xC798;&#xB9B0;&#xB41C; &#xD615;&#xD0DC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; d 1 &#xAE30; &#xACF5; &#xC54C;&#xB77C;&#xB2CC;&#xC744; &#xAD50;&#xD658;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC804;&#xCCB4; &#xAE38;&#xC774; p97 &#xC544;&#xB85C;&#xB9C8; &#xAE30; &#xACF5; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; p97 &#xB610;&#xB294; p97DeltaN &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC18;&#xBA74; d1&#xC758; &#xC911;&#xC559; &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xB450; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xB610;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0;&#xC73C;&#xB85C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; p97DeltaN &#xBCC0;&#xC885; &#xD3BC;&#xCCD0; Clp &#xAC00;&#xC871; &#xBC0F; &#xBD80;&#xAC00; &#xAC00;&#xCE58;&#xC138; &#xBAA8;&#xB378; &#xAE30;&#xD310; YFP ssrA &#xBC1C;&#xACAC;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, p97 unfoldase &#xD65C;&#xB3D9; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD589;&#xC0AC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294;, N &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC0AD;&#xC81C;&#xB294; &#xB2E8;&#xC77C; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; D1 &#xAE30; &#xACF5;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xC785;.

P97/VCP&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC720;&#xB3C4; &#xC804;&#xAC1C; &#xD65C;&#xB3D9;.

Una comparaci&oacute;n de las secuencias de prote&iacute;nas de dos dominios distintos AAA + ATPases revel&oacute; una notable diferencia en los residuos de revestimiento el poro central del dominio D1. Los unfoldases de la prote&iacute;na de la familia de Clp bacteriana y la prote&iacute;na de IVA archaeal tienen al menos un residuo arom&aacute;tico en el poro central de D1. En cambio, ninguno de los miembros de la familia de la prote&iacute;na p97/VCP eucariotas tiene un residuo arom&aacute;tico en el poro de la D1. La actividad de la prote&iacute;na despliegue de IVA y otros AAA + ATPases es cr&iacute;ticamente dependiente de la presencia de residuos arom&aacute;ticos en este poro central. Unfoldase actividad no ha sido demostrada para la familia p97/VCP in vitro. As&iacute;, intercambiamos los dos residuos alif&aacute;ticos leucina y alanina del poro para residuos arom&aacute;ticos tirosina p97 completas y el p97DeltaN, una forma truncada del p97 que carece del dominio N D1. Encontramos que las variantes p97DeltaN mutante con una tirosina sola o con dos residuos de tirosina en el poro central de D1 revelan la familia Clp e IVA modelo sustrato YFP-ssrA, mientras que p97 completas con residuos arom&aacute;ticos poro y salvaje-tipo p97 o p97DeltaN, no. As&iacute;, p97 puede ejercer actividad unfoldase in vitro, siempre que un residuo de tirosina solo se introduce en el poro de D1 y se elimina el dominio N.

Las mutaciones en p97/VCP inducen la actividad de despliegue.

&#x89C4;&#x7BA1;&#x7684;&#x52A8;&#x7269;&#x548C;&#x690D;&#x7269;&#x901A;&#x8FC7;&#x7C73;&#x5C14;&#x5305;&#x542B; mRNAs &#x8868;&#x8FBE;&#x7684; Microrna (Mirna) &#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x9897;&#x7C92; &#xFF08;RNPs&#xFF09;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7C73;&#x5C14;&#x7684;&#x6838;&#x5FC3;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x6548;&#x5E94;&#x6C89;&#x9ED8;&#x662F;&#x963F;&#x8033;&#x6208;&#x82F1;&#x96C4; (AGO) &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x7ED1;&#x5B9A; Mirna &#x548C;&#x8C03;&#x89E3;&#x76EE;&#x6807; mRNA &#x8BC6;&#x522B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x751F;&#x6210;&#x7A33;&#x5B9A;&#x8868;&#x8FBE;&#x6297;&#x539F;&#x8868;&#x4F4D;&#x6807;&#x8BB0;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4EE5;&#x524D;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6; RNA &#x6C89;&#x9ED8;&#x76F8;&#x5173;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80CE;&#x80BE; 293 &#x7EC6;&#x80DE;&#x7CFB;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7528;&#x4E8E;&#x51C0;&#x5316;&#x7C73;&#x5C14;&#x542B; RNPs.&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x7684;&#x4E0D;&#x540C; AGO &#x86CB;&#x767D;&#x4E0E;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x8D28;&#x8C31;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x4E00;&#x5957;&#x5171;&#x540C;&#x7684; helicases &#x548C; mRNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E09;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x91CD;&#x590D;&#x542B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; 6 (TNRC6A&#xFF0C;-B-C)&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x82AF;&#x7247;&#x5206;&#x6790;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5173;&#x8054;&#x7C73;&#x5C14; RNPs &#x900F;&#x9732;&#x6208;&#x548C; TNRC6 &#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5957;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7684;&#x8A8A;&#x672C;&#x6D53;&#x7F29;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x8868;&#x793A;&#x5185;&#x6E90;&#x6027; Mirna&#xFF0C;&#x6307;&#x793A; TNRC6 &#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x590D;&#x6742;&#x7684; mRNA &#x9488;&#x5BF9;&#x7C73;&#x5C14;&#x6C89;&#x9ED8;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x3002;&#x4E0E;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x4EE5;&#x524D;&#x590D;&#x6742;&#x975E;&#x5E38;&#x76F8;&#x4F3C;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x6210;&#x5206;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4EE5;&#x524D;&#x548C; TNRC6 &#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x5185;&#x7684;&#x5927;&#x91CF;&#x529F;&#x80FD;&#x5197;&#x4F59;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x8BC1;&#x660E;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E86;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x9014;&#x5F84;&#x6765;&#x5BFB;&#x627E;&#x751F;&#x7406;&#x6709;&#x5173;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7C73;&#x5C14;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;

&#x4EBA;&#x7C7B;&#x963F;&#x8033;&#x6208;&#x82F1;&#x96C4;&#x542B;&#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#x548C;&#x5176;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x7279;&#x5F81;&#x3002;

microRNAs (miRNAs) regulate the expression of mRNAs in animals and plants through miRNA-containing ribonucleoprotein particles (RNPs). At the core of these miRNA silencing effector complexes are the Argonaute (AGO) proteins that bind miRNAs and mediate target mRNA recognition. We generated HEK293 cell lines stably expressing epitope-tagged human AGO proteins and other RNA silencing-related proteins and used these cells to purify miRNA-containing RNPs. Mass spectrometric analyses of the proteins associated with different AGO proteins revealed a common set of helicases and mRNA-binding proteins, among them the three trinucleotide repeat containing proteins 6 (TNRC6A,-B,-C). mRNA microarray analyses of these miRNA-associated RNPs revealed that AGO and TNRC6 proteins bind highly similar sets of transcripts enriched in binding sites for highly expressed endogenous miRNAs, indicating that the TNRC6 proteins are a component of the mRNA-targeting miRNA silencing complex. Together with the very similar proteomic composition of each AGO complex, this result suggests substantial functional redundancy within families of human AGO and TNRC6 proteins. Our results further demonstrate that we have developed an effective biochemical approach to identify physiologically relevant human miRNA targets.

Molecular characterization of human Argonaute-containing ribonucleoprotein complexes and their bound target mRNAs.

microARN (miARN) r&#xE9;gulent l&#x26;#39;expression des ARNm chez les animaux et les plantes par le biais miRNA contenant des particules ribonucl&#xE9;oprot&#xE9;iques (RNP). Au c&#x153;ur de ces miARN taire complexes effecteurs sont l&#x26;#39;Argonaute (AGO) prot&#xE9;ines qui se lient miARN et de m&#xE9;diation de reconnaissance ARNm cible. Nous avons g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9; des lign&#xE9;es de cellules HEK293 exprimant de fa&#xE7;on stable &#xE9;pitope &#xE9;tiquet&#xE9; humaine AGO prot&#xE9;ines et d&#x26;#39;autres RNA silencing li&#xE9;s prot&#xE9;ines et utilis&#xE9; ces cellules pour purifier miRNA contenant RNP. Mass analyses spectrom&#xE9;triques des prot&#xE9;ines associ&#xE9;es &#xE0; diff&#xE9;rentes prot&#xE9;ines AGO a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; un ensemble commun de h&#xE9;licases et ARNm des prot&#xE9;ines liant, parmi eux le r&#xE9;p&#xE9;ter trois trinucl&#xE9;otide contenant des prot&#xE9;ines (6 TNRC6A,-B,-C). ARNm analyses de micror&#xE9;seaux de ces miARN RNP-associ&#xE9;s a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; que AGO et TNRC6 prot&#xE9;ines se lient ensembles tr&#xE8;s similaires de transcriptions enrichies en sites de liaison pour fortement exprim&#xE9;s miARN endog&#xE8;nes, ce qui indique que les prot&#xE9;ines TNRC6 sont une composante du complexe miARN-ARNm cible au silence. En collaboration avec la composition tr&#xE8;s semblable prot&#xE9;omique de chaque AGO complexe, ce r&#xE9;sultat sugg&#xE8;re importante redondance fonctionnelle au sein des familles de l&#x26;#39;homme et AGO TNRC6 prot&#xE9;ines. Nos r&#xE9;sultats d&#xE9;montrent en outre que nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une approche biochimique efficace pour identifier des cibles physiologiquement pertinents miRNA humains.

Caract&#xE9;risation mol&#xE9;culaire de l&#x26;#39;homme complexes ribonucl&#xE9;oprot&#xE9;iques Argonaute contenant et leurs ARNm cible li&#xE9;

MicroRNAs (MiRNAs) regulieren den Ausdruck mRNAs in Tieren und Pflanzen durch MiRNA-haltige Ribonucleoprotein Partikel (RNPs). Im Mittelpunkt dieser MiRNA sind silencing Effektor-komplexe der Argonaut (her)-Proteine, die MiRNAs zu binden und Zielerfassung mRNA zu vermitteln. Wir HEK293-Zelllinien, die stabil Ausdruck Epitop-Tags her-Peptidase und anderen RNA silencing-bezogenen Proteinen generiert und verwendet diese Zellen MiRNA-haltige RNPs. Masse zu reinigen, spektrometrische Analysen der Zusammenhang mit anderen her-Proteine Proteine ergab ein gemeinsamen Satz von Helikasen und mRNA-bindenen Proteine, darunter die drei Trinucleotide Wiederholung enthaltenden Proteine 6 (TNRC6A, - B, - C). mRNA-Microarray Analysen der diese MiRNA-assoziierte RNPs ergab, dass her und TNRC6 Proteine binden sehr &auml;hnliche S&auml;tze von Abschriften, die verbindliche Aufstellungsorte f&uuml;r hoch angereichertes ausgedr&uuml;ckt endogene MiRNAs, die darauf hinweist, dass die TNRC6-Proteine ein Bestandteil der mRNA-Zielgruppenadressierung MiRNA Unterdr&uuml;ckender komplexe sind. Zusammen mit der sehr &auml;hnlich Proteomic Zusammensetzung der einzelnen her-Komplex schl&auml;gt dieses Ergebnis erhebliche funktionelle Redundanz innerhalb der Familie der menschlichen her und TNRC6 Proteine. Unsere Ergebnisse weiter zeigen, dass wir, einen effektiven biochemischen Ansatz entwickelt haben um physiologisch relevanten menschlichen MiRNA Ziele zu identifizieren.

Molekulare Charakterisierung von menschlichen Argonaute-haltigen-Gebiets-komplexe und ihre gebundenen Target-mRNAs.

microRNA (miRNAs) regola l&#39;espressione dei mRNAs in animali e piante attraverso miRNA-contenenti particelle della ribonucleoproteina (RNPs). Alla base di questi miRNA silenziamento effettrici complessi sono le proteine Argonaute (fa) che legano i miRNAs e mediano riconoscimento mRNA bersaglio. Abbiamo generato HEK293 linee cellulari che esprimono stabilmente epitopo-etichettato proteine fa umane e altre proteine RNA silencing-correlati e utilizzato queste cellule per purificare contenenti miRNA RNPs. massa analisi spettrometrica delle proteine associate diverse proteine fa ha rivelato che un comune set di elicasi e mRNA-binding proteins, fra loro le tre trinucleotide repeat contenenti proteine 6 (TNRC6A, - B, - C). mRNA microarray, analisi di questi miRNA-associated RNPs ha rivelato che si fa e TNRC6 proteine legano set altamente simili di trascrizioni arricchite in siti per leganti altamente espresso miRNAs endogena, indicando che le proteine TNRC6 sono un componente del mRNA-targeting quieto silenzio complesse. Insieme con la composizione di proteomic molto simili di ogni complesso fa, questo risultato suggerisce notevole ridondanza funzionale all&#39;interno delle famiglie di proteine umane fa e TNRC6. Ulteriormente i nostri risultati dimostrano che abbiamo sviluppato un efficace approccio biochimico per identificare gli obiettivi fisiologicamente rilevanti miRNA umana.

Caratterizzazione molecolare di umane Argonaute-contenenti ribonucleoproteina complessi e loro mRNA bersaglio associato.

&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;RNA&#xFF08;miRNA&#xFF09;&#x306E;miRNA&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30EA;&#x30DC;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x7C92;&#x5B50;&#xFF08;RNP&#x306F;&#xFF09;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x52D5;&#x7269;&#x3084;&#x690D;&#x7269;&#x306E;mRNA&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30A8;&#x30D5;&#x30A7;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;miRNA&#x306E;&#x4E2D;&#x6838;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B4;&#x30CE;&#x30FC;&#x30C8;&#xFF08;AGO&#xFF09;&#x306E;miRNA&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;mRNA&#x306E;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3084;&#x4ED6;&#x306E;RNA&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x95A2;&#x9023;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;AGO&#x4EBA;&#x9593;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x30BF;&#x30B0;&#x3068;miRNA&#x3092;&#x542B;&#x3080;RNP&#x306F;&#x3092;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;HEK293&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5225;&#x306E;AGO&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30D8;&#x30EA;&#x30AB;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;mRNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x5171;&#x901A;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;6&#xFF08;TNRC6A&#x3001;-B&#x3001;-C&#xFF09;&#x3092;&#x542B;&#x3080;3&#x30C8;&#x30EA;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x30EA;&#x30D4;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;miRNA&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x305F;RNP&#x306E;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x89E3;&#x6790;&#x3092;mRNA&#x306F;&#x3001;&#x524D;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x3068;TNRC6&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;TNRC6&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;mRNA&#x306E;&#x6A19;&#x7684;miRNA&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x6210;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3001;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;miRNA&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x7269;&#x306E;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x985E;&#x4F3C;&#x3057;&#x305F;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x5404;AGO&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x3088;&#x304F;&#x4F3C;&#x305F;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x7D44;&#x6210;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x524D;&#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x3068;TNRC6&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5185;&#x3067;&#x5B9F;&#x8CEA;&#x7684;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306E;&#x5197;&#x9577;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30D2;&#x30C8;miRNA&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30B4;&#x30CE;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30EA;&#x30DC;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x6A19;&#x7684;mRNA&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x30AD;&#x30E3;&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;

microRNAs (miRNAs) &#xC870;&#xC808; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBBF8;&#xB974;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xB3D9;&#xC2DD;&#xBB3C;&#xC5D0; Mrnas&#xC758; &#xC2DD; ribonucleoprotein &#xC785;&#xC790; (RNPs). &#xC774; &#xBBF8;&#xB974;&#xC758; &#xD575;&#xC2EC; silencing &#xC774;&#xD399;&#xD130; &#xB2E8;&#xC9C0;&#xB294; miRNAs &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0; &#xB300;&#xC0C1; mRNA &#xC778;&#xC2DD;&#xC744; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; Argonaute (&#xC804;) &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;. &#xC6B0;&#xB9AC; HEK293 &#xC138;&#xD3EC; &#xC120;&#xC744; &#xC548;&#xC815;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC804; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD53C;&#xD1A0; &#xD504; &#xD0DC;&#xADF8;&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; RNA &#xCE68;&#xBB35; &#xAD00;&#xB828; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC138;&#xD3EC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xC815;&#xD654; miRNA &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; RNPs. &#xC9C8;&#xB7C9; spectrometric &#xBD84;&#xC11D; &#xB2E4;&#xB978; &#xC804; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC5F0;&#xAD00; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACF5;&#xD1B5; &#xC9D1;&#xD569;&#xC744; helicases&#xACFC; &#xADF8;&#xB4E4; &#xAC00;&#xC6B4;&#xB370; mRNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 3 trinucleotide &#xBC18;&#xBCF5; &#xD3EC;&#xD568; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; 6 (TNRC6A,-B-C) &#xACF5;&#xAC1C;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; miRNA &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; Rnps&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC740; &#xACF5;&#xAC1C; &#xC804; &#xBC0F; TNRC6 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB192;&#xC740; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB18D;&#xCD95; &#xD558;&#xB294; &#xB179;&#xCDE8; &#xB85D;&#xC758; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xC138;&#xD2B8;&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; mRNA microarray &#xC0DD; miRNAs, TNRC6 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; Mrna&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; miRNA &#xCE68;&#xBB35;&#xC758; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC694;&#xC18C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xD45C;&#xD604;. &#xAC01; &#xC804; &#xB2E8;&#xC9C0; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; proteomic &#xAD6C;&#xC131;, &#xD568;&#xAED8;&#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC804; &#xBC0F; TNRC6 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xAC00;&#xC871; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5; &#xC911;&#xBCF5;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB354; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC21C;&#xC218; &#xAD00;&#xB828; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; miRNA &#xB300;&#xC0C1;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xC0DD; &#xD654; &#xD655; &#xC801;&#xC778; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC778;&#xAC04;&#xC758; Argonaute &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; ribonucleoprotein &#xB2E8;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xB300;&#xC0C1; Mrnas&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xD2B9;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D;.

microARN (miRNA) regulan la expresi&#xF3;n de ARNm de los animales y las plantas a trav&#xE9;s de miRNA que contienen part&#xED;culas de ribonucleoprote&#xED;na (RNP). En el n&#xFA;cleo de estos miARN complejos efectores de silenciamiento son el Argonauta (AGO) prote&#xED;nas que se unen los miRNAs y mediar en el reconocimiento objetivo de ARNm. Hemos generado HEK293 l&#xED;neas celulares que expresan establemente ep&#xED;topo de etiquetado humana HACE prote&#xED;nas y otras prote&#xED;nas relacionadas con el silenciamiento de ARN-y se utiliza para purificar estas c&#xE9;lulas que contienen RNPs miARN. An&#xE1;lisis de espectrometr&#xED;a de masa de las prote&#xED;nas asociadas con diferentes prote&#xED;nas atr&#xE1;s revel&#xF3; un conjunto com&#xFA;n de helicasas y prote&#xED;nas de uni&#xF3;n a ARNm, entre ellas la repetici&#xF3;n de trinucle&#xF3;tidos tres prote&#xED;nas que contienen 6 (TNRC6A,-B,-C). ARNm an&#xE1;lisis de microarrays de estas RNPs asociados miRNA-revel&#xF3; que HACE y TNRC6 prote&#xED;nas se unen conjuntos muy similares de las transcripciones enriquecido en los sitios de uni&#xF3;n para la altamente expresado miRNAs end&#xF3;genos, lo que indica que los TNRC6 prote&#xED;nas son un componente del complejo de miARN ARNm de metas de silenciar. Junto con la composici&#xF3;n muy similar prote&#xF3;mico de cada HACE complejo, este resultado sugiere redundancia funcional sustancial dentro de las familias de los humanos y las prote&#xED;nas TNRC6 AGO. Nuestros resultados demuestran que hemos desarrollado un enfoque eficaz bioqu&#xED;micas para identificar blancos humanos fisiol&#xF3;gicamente relevantes miARN.

Caracterizaci&#xF3;n molecular de los humanos ribonucleoprotein complejos Argonaute que contienen y sus mRNAs diana enlazados

RNA &#x8A8A;&#x672C;&#x662F;&#x8F6C;&#x5F55;&#x540E;&#x57FA;&#x56E0;&#x76D1;&#x7BA1;&#x6D89;&#x53CA;&#x6570;&#x4EE5;&#x767E;&#x8BA1;&#x7684; RNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D; (&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;) &#x548C;&#x542B;&#x6709; microRNA &#x7684;&#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269; (miRNPs) &#x8868;&#x793A;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x4F9D;&#x8D56;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x53D1;&#x7684;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x4EA4;&#x8054;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x5728;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x548C;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7EC4;&#x5168;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;&#x548C; miRNPs &#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x70B9;&#x3002;&#x4EA4;&#x8054;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E2D;&#x7F16;&#x5199;&#x4ECE; immunopurified RNPs 4 thiouridine &#x6CBB;&#x7597;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6269;&#x589E;&#x80DE;&#x82F7;&#x8FC7;&#x6E21;&#x5230;&#x80F8;&#x82F7;&#x6240;&#x53D1;&#x73B0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x51E0;&#x4E2A;&#x7684;&#x5BC6;&#x96C6;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5546;&#x4E1A;&#x60EF;&#x4F8B;&#x548C; miRNPs&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; PUM2&#x3001; QKI&#x3001; IGF2BP1 3&#x3001; &#x6208;/EIF2C1-4 &#x548C; TNRC6A C.&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x548C;&#x89C4;&#x7BA1;&#x7684;&#x540E;&#x679C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x663E;&#x793A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x56E0;&#x7D20;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6210;&#x5343;&#x4E0A;&#x4E07;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#x5305;&#x542B;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x56FE;&#x6848;&#x4E3A; exonic &#x4E0E;&#x5185;&#x542B;&#x5B50;&#x6216;&#x7F16;&#x7801;&#x4E0E;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C;&#x559C;&#x597D;&#x8C08;&#x8BDD;&#x5185;&#x5BB9;&#x533A;&#x57DF;&#x3002;&#x8DE8;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F4D;&#x70B9;&#x7684;&#x7CBE;&#x786E;&#x6620;&#x5C04;&#x5C06;&#x8FC5;&#x901F;&#x65B0;&#x5174;&#x6570;&#x636E;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x548C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x53D8;&#x5316;&#x5982;&#x4F55;&#x8D21;&#x732E;&#x590D;&#x6742;&#x9057;&#x4F20;&#x75BE;&#x75C5;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x53D8;&#x5F02;&#x7684;&#x89E3;&#x91CA;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x3002;

&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5168;&#x7531; PAR &#x526A;&#x8F91; RNA &#x7ED3;&#x5408;&#x86CB;&#x767D;&#x548C; microRNA &#x76EE;&#x6807;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;

RNA transcripts are subject to posttranscriptional gene regulation involving hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) expressed in a cell-type dependent fashion. We developed a cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs. The crosslinked sites are revealed by thymidine to cytidine transitions in the cDNAs prepared from immunopurified RNPs of 4-thiouridine-treated cells. We determined the binding sites and regulatory consequences for several intensely studied RBPs and miRNPs, including PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 and TNRC6A-C. Our study revealed that these factors bind thousands of sites containing defined sequence motifs and have distinct preferences for exonic versus intronic or coding versus untranslated transcript regions. The precise mapping of binding sites across the transcriptome will be critical to the interpretation of the rapidly emerging data on genetic variation between individuals and how these variations contribute to complex genetic diseases.

Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.

Transcrits d&#x26;#39;ARN sont soumis &#xE0; la r&#xE9;gulation des g&#xE8;nes post-transcriptionnelle impliquant des centaines de prot&#xE9;ines liant l&#x26;#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) et des complexes ribonucl&#xE9;oprot&#xE9;iques microARN contenant (miRNPs) exprim&#xE9;es de fa&#xE7;on d&#xE9;pendante du type cellulaire. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une approche de r&#xE9;ticulation &#xE0; base de cellules pour d&#xE9;terminer &#xE0; haute r&#xE9;solution et du transcriptome &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle des sites de liaison des pratiques commerciales restrictives cellulaires et miRNPs. Les sites r&#xE9;ticul&#xE9;s sont r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9;es par la thymidine &#xE0; des transitions cytidine dans les ADNc pr&#xE9;par&#xE9;s &#xE0; partir de immunopurifi&#xE9; RNP de la 4-thiouridine cellules trait&#xE9;es. Nous avons d&#xE9;termin&#xE9; les sites de liaison et les cons&#xE9;quences r&#xE9;glementaires de plusieurs pratiques commerciales restrictives intens&#xE9;ment &#xE9;tudi&#xE9;es et miRNPs, y compris PUM2, QKI, IGF2BP1-3, AGO/EIF2C1-4 et TNRC6A-C. Notre &#xE9;tude a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; que ces facteurs se lient des milliers de sites contenant des motifs de s&#xE9;quence d&#xE9;finis et ont des pr&#xE9;f&#xE9;rences distinctes pour exonique contre intronique ou de codage par rapport &#xE0; des r&#xE9;gions non traduites transcription. La cartographie pr&#xE9;cise des sites de liaison &#xE0; travers le transcriptome sera cruciale pour l&#x26;#39;interpr&#xE9;tation des donn&#xE9;es se font jour rapidement sur la variation g&#xE9;n&#xE9;tique entre les individus et la fa&#xE7;on dont ces variations contribuent &#xE0; des maladies g&#xE9;n&#xE9;tiques complexes.

Transcriptome &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle d&#x26;#39;identification de l&#x26;#39;ARN-binding protein et sites cibles microARN par PAR-CLIP

RNA-Transkripte unterliegen Posttranscriptionale Genregulation bei denen hunderte von RNA-bindende Proteine (RBPs) und MicroRNA-haltigen-Gebiets-komplexe (MiRNPs) in einer Art von Zelle abh&auml;ngigen Weise ausgedr&uuml;ckt. Wir entwickelten einen zellbasierte vernetzender Ansatz um die Bindungsstellen der zellul&auml;ren RBPs und MiRNPs bei hoher Aufl&ouml;sung und Transkriptom-weite zu bestimmen. Die vernetzte Standorte sind durch Thymidin zu Cytidin &Uuml;berg&auml;nge in die cDNAs aus Immunopurified RNPs 4-Thiouridine-behandelte Zellen vorbereitet offenbart. Wir entschlossen die Bindungsstellen und regulatorische Konsequenzen f&uuml;r mehrere intensiv studierte RBPs und MiRNPs, einschlie&szlig;lich PUM2, QKI, IGF2BP1-3, her/EIF2C1-4 und TNRC6A-C. Unsere Studie ergab, dass diese Faktoren binden Tausende von Seiten mit definierten Sequenz Motive und unterschiedliche Vorlieben haben f&uuml;r exonic versus verband intronic oder Codierung gegen&uuml;ber nicht &uuml;bersetzte Abschrift Regionen. Die genaue Zuordnung der Bindung von Websites &uuml;ber das Transkriptom ist entscheidend, um die Interpretation der sich schnell verbreitende Daten auf genetische Variation zwischen Individuen und wie diese Variationen zu komplexen genetischen Erkrankungen beitragen.

Transkriptom-weite Identifikation von RNS-bindene Protein und MicroRNA Ziel-Sites von PAR-CLIP.

Trascrizioni di RNA sono soggetti a regolazione genica posttranscriptional coinvolgendo centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) espressi in modo dipendente dal tipo di cellula. Abbiamo sviluppato un approccio basato sulle celle reticolazione per determinare a livello transcriptome e ad alta risoluzione i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs. I siti di reticolati sono rivelati da timidina a transizioni citidina in cDNAs preparato da immunopurified RNPs di cellule 4-thiouridine-trattati. Abbiamo determinato i siti di legame e conseguenze normative per diversi RBPs intensamente studiato e miRNPs, tra cui PUM2, QKI, IGF2BP1-3, 4-fa/EIF2C1 e TNRC6A-C. Il nostro studio &egrave; emerso che questi fattori legano migliaia di siti che contengono motivi di sequenza definita e hanno preferenze distinte per untranslated esonico versus intronic o codifica versus regioni di trascrizione. La precisa mappatura dei siti di legame attraverso il trascrittoma sar&agrave; fondamentale per l&#39;interpretazione dei dati rapidamente emergenti sulla variazione genetica tra individui e come tali variazioni contribuiscono a malattie genetiche complesse.

Transcriptome identificazione dei siti di RNA-binding protein e microRNA bersaglio da PAR-CLIP.

RNA&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x306F;&#x3001;RNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08;RBP&#xFF09;&#x3068;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;RNA&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x7D30;&#x80DE;&#x578B;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x5F62;&#x3067;&#x8868;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30EA;&#x30DC;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#xFF08;miRNPs&#xFF09;&#x6570;&#x767E;&#x4EBA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x8EE2;&#x5199;&#x5F8C;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x5236;&#x5FA1;&#x306E;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3084;&#x643A;&#x5E2F;RBPs&#x3068;miRNPs&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3067;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x30BB;&#x30EB;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x200B;&#x200B;&#x67B6;&#x6A4B;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x67B6;&#x6A4B;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306F;&#x3001;4  - &#x30C1;&#x30AA;&#x30A6;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;RNP&#x306F;&#x3092;&#x514D;&#x75AB;&#x7CBE;&#x88FD;&#x304B;&#x3089;&#x8ABF;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;cDNA&#x3067;&#x30B7;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x9077;&#x79FB;&#x306B;&#x30C1;&#x30DF;&#x30B8;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;PUM2&#x3001;QKI&#x3001;IGF2BP1-3&#x3001;AGO/EIF2C1-4&#x3068;TNRC6A-C&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x71B1;&#x5FC3;&#x306B;&#x7814;&#x7A76;RBPs&#x3068;miRNPs&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x898F;&#x5236;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8981;&#x56E0;&#x304C;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x914D;&#x5217;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x4F55;&#x5343;&#x3082;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#x5BFE;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30F3;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x975E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x8EE2;&#x5199;&#x9818;&#x57DF;&#x5BFE;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x55DC;&#x597D;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x9593;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x4EBA;&#x3068;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x52D5;&#x306F;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x6027;&#x75BE;&#x60A3;&#x3078;&#x306E;&#x8CA2;&#x732E;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7684;&#x5909;&#x7570;&#x306B;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x65B0;&#x8208;&#x306E;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x89E3;&#x91C8;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;

PAR-CLIP&#x306B;&#x3088;&#x308B;RNA&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;microRNA&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;

RNA &#xC0AC;&#xBCF8;&#xC744; RNA &#xC758;&#xBB34;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (RBPs)&#xC640; microRNA &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xC218;&#xBC31; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; posttranscriptional &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC870;&#xC808; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; ribonucleoprotein &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C; (miRNPs) &#xC140; &#xD0C0;&#xC785; &#xC885;&#xC18D; &#xD328;&#xC158;&#xC5D0; &#xD45C;&#xD604; &#xB41C;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; RBPs &#xBC0F; Mirnps&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xB192;&#xC740; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; transcriptome &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xAC00;&#xAD50; &#xC140; &#xAE30;&#xBC18; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C;. Crosslinked &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xD2F0; &#xBBF8; &#xB518; immunopurified 4 thiouridine &#xCE58;&#xB8CC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; Rnps&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC900;&#xBE44; &#xB41C; Cdnas&#xC5D0; cytidine &#xC804;&#xD658;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xACF5;&#xAC1C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2EC;&#xAC01; &#xD558; &#xAC8C; &#xACF5;&#xBD80;&#xC640; miRNPs, PUM2, QKI, IGF2BP1 3, &#xC804;/EIF2C1-4&#xC640; TNRC6A C&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xC5EC;&#xB7EC; RBPs &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC0F; &#xADDC;&#xC81C; &#xACB0;&#xACFC; &#xACB0;&#xC815; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBC1D;&#xD600; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC694;&#xC18C; &#xC21C;&#xC11C; &#xB300;&#xB85C; &#xBAA8;&#xD2F0;&#xD504;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xC218;&#xCC9C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD558;&#xACE0;, intronic &#xB610;&#xB294; &#xCF54;&#xB529; &#xB300; &#xB300; exonic untranslated&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xD2B9;&#xD61C;&#xAC00; &#xC788;&#xB2E4; &#xB300; &#xBCF8; &#xC601;&#xC5ED;. Transcriptome &#xAC78;&#xCCD0; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xB9E4;&#xD551; &#xAC1C;&#xC778;&#xACFC;&#xC774; &#xBCC0;&#xC774; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC9C8;&#xD658;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC720;&#xC804; &#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xAE09;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xC2E0;&#xD765; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; &#xD574;&#xC11D;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Transcriptome &#xC218;&#xC900; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD30C; &#xD074;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; RNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xACFC; microRNA &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758;.

Las transcripciones de ARN est&#xE1;n sujetos a la regulaci&#xF3;n de genes postranscripcional que participaron cientos de ARN-prote&#xED;nas de uni&#xF3;n a las pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas () y que contienen complejos de microARN-ribonucleoprote&#xED;na (miRNPs) expresados &#x200B;&#x200B;en forma de c&#xE9;lulas de tipo dependiente. Hemos desarrollado un enfoque reticulaci&#xF3;n a base de c&#xE9;lulas para determinar en alta resoluci&#xF3;n y en todo el transcriptoma de los sitios de uni&#xF3;n de las pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas y miRNPs celulares. Los sitios reticuladas son reveladas por timidina a las transiciones de citidina en los ADNc preparadas a partir de immunopurified RNPs de 4-tiouridina c&#xE9;lulas tratadas. Se determinaron los sitios de uni&#xF3;n y las consecuencias reglamentarias para varias pr&#xE1;cticas comerciales restrictivas intensamente estudiados y miRNPs, incluyendo PUM2, QKI, IGF2BP1 3, AGO/EIF2C1-4 y TNRC6A-C. Nuestro estudio revel&#xF3; que estos factores se unen miles de sitios que contengan la secuencia de motivos definidos y tienen distintas preferencias de exonic contra intr&#xF3;nica o codificaci&#xF3;n en comparaci&#xF3;n con las regiones no traducidas de transcripci&#xF3;n. La asignaci&#xF3;n exacta de los sitios de uni&#xF3;n de todo el transcriptoma ser&#xE1; fundamental para la interpretaci&#xF3;n de los datos que emergen r&#xE1;pidamente sobre la variaci&#xF3;n gen&#xE9;tica entre los individuos y c&#xF3;mo estas variaciones contribuyen a enfermedades gen&#xE9;ticas complejas.

Transcriptoma en toda la identificaci&#xF3;n de la prote&#xED;na de uni&#xF3;n al ARN y los sitios de destino microARN por PAR-CLIP

&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x5185;&#x90E8;&#x6838;&#x819C; (&#x79FB;&#x6C11;) &#x5728;&#x5176;&#x751F;&#x7269;&#x53D1;&#x751F;&#x671F;&#x95F4;&#x63D2;&#x5165;&#x5185;&#x8D28;&#x7F51;&#x819C;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x6307;&#x5411;&#x5176;&#x6700;&#x7EC8;&#x76EE;&#x7684;&#x5730;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4EBA;&#x7C7B; SUN2 &#x6765;&#x63CF;&#x7ED8;&#x529F;&#x80FD;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x79FB;&#x6C11;&#x76EE;&#x6807;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x96C6;&#x4F53;&#x8D21;&#x732E;&#x7684; SUN2 &#x4E8E;&#x6838;&#x4FE1;&#x5C01; (NE) &#x9AD8;&#x6548;&#x7684;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x5143;&#x7D20;&#x3002;&#x8FD9;&#x6837;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x76EE;&#x6807;&#x5143;&#x7D20;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x53E4;&#x5178;&#x7684;&#x6838;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x4FE1;&#x53F7;&#x603B;&#x7406;&#x5E9C; SUN2 N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x3001; nucleoplasmic &#x57DF;&#x4E2D;&#x5B58;&#x5728;&#x3002;&#x8FD1;&#x7AEF; cNLS &#x5411;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x9898;&#x662F;&#x4ECE;&#x9AD8;&#x5C14;&#x57FA;&#x6240;&#x670D;&#x52A1;&#x7684; SUN2 coatomer &#x4ECB;&#x5BFC;&#x68C0;&#x7D22; arginines &#x7684;&#x7FA4;&#x96C6;&#x3002;&#x610F;&#x5916;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;SUN2 C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x3001; &#x80A0;&#x58C1;&#x5B59;&#x57DF;&#x8FD8;&#x652F;&#x6301; NE &#x672C;&#x5730;&#x5316;&#xFF0C;&#x663E;&#x793A;&#x76EE;&#x6807;&#x5143;&#x7D20;&#x4E0D;&#x9650;&#x4E8E;&#x79FB;&#x6C11;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x6216;&#x8DE8;&#x819C;&#x57DF;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;SUN2 &#x8868;&#x793A;&#x4F9D;&#x8D56;&#x529F;&#x80FD; cNLS&#x3001; &#x9AD8;&#x5C14;&#x57FA;&#x68C0;&#x7D22;&#x4FE1;&#x53F7;&#x548C;&#x6838;&#x5468;&#x57DF;&#x6765;&#x8C03;&#x89E3;&#x9776;&#x5411;&#x58A8;&#x897F;&#x54E5;&#x79FB;&#x6C11;&#x534F;&#x4F1A;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B21;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x79FB;&#x6C11;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

&#x53E4;&#x5178; NLS &#x548C;&#x592A;&#x9633;&#x57DF;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x9762;&#x5411;&#x5185;&#x90E8;&#x7684;&#x6838;&#x819C; SUN2&#x3002;

Integral membrane proteins of the inner nuclear membrane (INM) are inserted into the endoplasmic reticulum membrane during their biogenesis and are then targeted to their final destination. We have used human SUN2 to delineate features that are required for INM targeting and have identified multiple elements that collectively contribute to the efficient localization of SUN2 to the nuclear envelope (NE). One such targeting element is a classical nuclear localization signal (cNLS) present in the N-terminal, nucleoplasmic domain of SUN2. A second motif proximal to the cNLS is a cluster of arginines that serves coatomer-mediated retrieval of SUN2 from the Golgi. Unexpectedly, also the C-terminal, lumenal SUN domain of SUN2 supports NE localization, showing that targeting elements are not limited to cytoplasmic or transmembrane domains of INM proteins. Together, SUN2 represents the first mammalian INM protein relying on a functional cNLS, a Golgi retrieval signal and a perinuclear domain to mediate targeting to the INM.

A classical NLS and the SUN domain contribute to the targeting of SUN2 to the inner nuclear membrane.

Les prot&eacute;ines membranaires intrins&egrave;ques de la membrane nucl&eacute;aire interne (INM) sont ins&eacute;r&eacute;es dans la membrane du r&eacute;ticulum endoplasmique durant leur biogen&egrave;se et sont alors cibl&eacute;s vers leur destination finale. Nous avons utilis&eacute; SUN2 humaine pour d&eacute;limiter les fonctions qui sont n&eacute;cessaires pour cibler les INM et que vous ont identifi&eacute; plusieurs &eacute;l&eacute;ments qui contribuent collectivement &agrave; la localisation efficace de SUN2 &agrave; l&#39;enveloppe nucl&eacute;aire (en). Un tel &eacute;l&eacute;ment de ciblage est un signal de localisation nucl&eacute;aire classique (cNLS) pr&eacute;sent dans le domaine N-terminal, nucl&eacute;oplasmique de SUN2. Un second motif proximal &agrave; la cNLS est un amas d&#39;arginines qui sert de m&eacute;diation coatom&egrave;re r&eacute;cup&eacute;ration de SUN2 de l&#39;appareil de Golgi. Le domaine C-terminal, lumi&egrave;re soleil SUN2 soutient &eacute;galement de fa&ccedil;on inattendue, localisation NE montrant que des &eacute;l&eacute;ments de ciblage ne se limitent pas &agrave; des domaines cytoplasmiques ou transmembranaires des prot&eacute;ines de l&#39;INM. Ensemble, SUN2 repr&eacute;sente la premi&egrave;re prot&eacute;ine INM mammif&egrave;res s&#39;appuyant sur un cNLS fonctionnelle, un signal de r&eacute;cup&eacute;ration de Golgi et un domaine &agrave; p&eacute;rinucl&eacute;aires de m&eacute;diation visant &agrave; l&#39;INM.

Un classique NLS et le domaine de soleil contribuent &agrave; cibler un SUN2 &agrave; la membrane nucl&eacute;aire interne.

Integrale Membranproteine &uuml;ber die innere Kernmembrane (INM) werden in der Membran des endoplasmatischen Retikulum eingef&uuml;gt, w&auml;hrend ihre Biogenese und richten sich dann zum Endziel. Wir haben menschliche SUN2 Funktionen beschreiben die erforderlichen INM Targeting und identifiziert haben mehrere Elemente, die zusammen die effiziente Lokalisierung von SUN2, die Kernh&uuml;lle (NE) beitragen. Ein solches Zielgruppenadressierung Element ist ein klassischer nukleare Lokalisierung Signal (cNLS) in der N-terminalen, nucleoplasmic Dom&auml;ne der SUN2 vorhanden. Ein zweites Motiv proximal, die cNLS ist ein Cluster von Arginines, der Coatomer-vermittelte Abruf von SUN2 aus dem Golgi dient. Unerwartet, unterst&uuml;tzt auch die C-terminale, lumenal SUN-Dom&auml;ne des SUN2 NE Lokalisierung, zeigen, dass gezielt Elemente nicht auf zytoplasmatische oder Transmembran-Dom&auml;nen INM Proteine beschr&auml;nkt sind. SUN2 stellt zusammen, die ersten INM S&auml;ugetierprotein unter Berufung auf eine funktionale cNLS, ein Golgi-Abruf-Signal und eine perinukle&auml;re-Dom&auml;ne, die INM-targeting zu vermitteln.

Eine klassische NLS und die SUN-Dom&auml;ne dazu beitragen, die Angriffe auf SUN2 um die innere Kernmembrane.

Proteine integrali di membrana della membrana nucleare interna (INM) sono inserite nella membrana del reticolo endoplasmatico durante loro biogenesi e quindi sono mirate alla loro destinazione finale. Abbiamo usato SUN2 umana per delineare le caratteristiche che sono richieste per il targeting INM e hanno identificato pi&ugrave; elementi che contribuiscono collettivamente per la localizzazione efficiente SUN2 alla busta nucleare (NE). Un tale elemento targeting &egrave; un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) presente nel dominio N-terminale, nucleoplasmic di SUN2. Un secondo motivo prossimale per il cNLS &egrave; un ammasso di ARGININE che serve recupero Multicopper-mediato di SUN2 dal Golgi. Inaspettatamente, anche il dominio C-terminale, lumenal di SUN di SUN2 supporta la localizzazione NE, mostrando che gli elementi bersaglio non sono limitati a domini transmembrane o citoplasmatiche delle proteine INM. Insieme, SUN2 rappresenta la prima proteina dei mammiferi INM basandosi su un cNLS funzionale, un segnale di recupero di Golgi e un dominio perinucleare di mediare targeting per l&#39;INM.

Una classica NLS e il dominio del sole contribuiscono per il targeting di SUN2 alla membrana nucleare interna.

&#x7A4D;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x539F;&#x5B50;&#x819C; &#xFF08;&#x30EB;&#x30FC;&#x30DE;&#x30CB;&#x30A2;&#xFF09; &#x306E;&#x5C0F;&#x80DE;&#x4F53;&#x819C;&#x306B;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x4E2D;&#x306B;&#x633F;&#x5165;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306A;&#x5B9B;&#x5148;&#x306B;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x4EBA;&#x9593; SUN2 &#x30EB;&#x30FC;&#x30DE;&#x30CB;&#x30A2;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x7DCF;&#x79F0;&#x3057;&#x3066; SUN2 &#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6838;&#x819C; (NE) &#x306B;&#x8CA2;&#x732E;&#x3059;&#x308B;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x8981;&#x7D20;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E; 1 &#x3064;&#x306E;&#x8981;&#x7D20;&#x306F;&#x3001;SUN2 &#x306E; N &#x672B;&#x7AEF;, &#x6838;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306B;&#x5B58;&#x5728;&#x53E4;&#x5178;&#x7684;&#x6838;&#x5C40;&#x5728;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB; (cNLS) &#x3067;&#x3059;&#x3002;2 &#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x30E2;&#x30C1;&#x30FC;&#x30D5;&#x306B; cNLS &#x8FD1;&#x4F4D;&#x308C;&#x307E;&#x3059; coatomer &#x3067;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x691C;&#x7D22; SUN2 &#x306E;&#x30B4;&#x30EB;&#x30B8;&#x4F53;&#x304B;&#x3089;&#x6A5F;&#x80FD;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30FC; &#x30A2;&#x30EB;&#x30AE;&#x30CB;&#x30F3;&#x306E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4E88;&#x671F;&#x305B;&#x305A;&#x3001;&#x307E;&#x305F; C &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB;&#x3001;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x5185;&#x8154;&#x5074;&#x306E;&#x592A;&#x967D;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; SUN2 &#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x8981;&#x7D20;&#x304C;&#x30EB;&#x30FC;&#x30DE;&#x30CB;&#x30A2;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5236;&#x9650;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;NE &#x306E;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EA;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;SUN2 &#x6A5F;&#x80FD; cNLS&#x3001;&#x30B4;&#x30EB;&#x30B8;&#x60F3;&#x8D77;&#x4FE1;&#x53F7;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6838;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x30EB;&#x30FC;&#x30DE;&#x30CB;&#x30A2;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x983C;&#x308B;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x30EB;&#x30FC;&#x30DE;&#x30CB;&#x30A2; &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x53E4;&#x5178;&#x7684;&#x306A; NLS &#x592A;&#x967D;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; SUN2 &#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x539F;&#x5B50;&#x819C;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x8CA2;&#x732E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xB0B4;&#xBD80; &#xD575; &#xB9C9; (INM)&#xC758; &#xD1B5;&#xD569; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB4E4; &#xC18D; &#xC911; endoplasmic &#xADF8;&#xBB3C; &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0BD;&#xC785; &#xB418; &#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xCD5C;&#xC885; &#xBAA9;&#xC801;&#xC9C0;&#xB97C; &#xB2E4;&#xC74C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; SUN2 INM &#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC724;&#xACFD;&#xC744; &#xADF8;&#xB9AC; &#xB2E4; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xC9D1;&#xB2E8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD575; &#xBD09;&#xD22C; (NE) SUN2 &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC694;&#xC18C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4;. &#xAC19;&#xC740; &#xB300;&#xC0C1; &#xC694;&#xC18C; SUN2 N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110;, nucleoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD074;&#xB798;&#xC2DD; &#xD575; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xC2E0;&#xD638; (cNLS)&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC8FC;&#xC81C;&#xB294; cNLS &#xADFC; &#xC704;&#xB294; Golgi&#xC5D0;&#xC11C; SUN2 &#xAC80;&#xC0C9; coatomer &#xC911;&#xC7AC;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; arginines &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xAC8C;, &#xB610;&#xD55C; sun2&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110;, lumenal SUN &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB300;&#xC0C1; &#xC694;&#xC18C; INM &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xB610;&#xB294; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xAD6D;&#xD55C; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD398;&#xC774;&#xC9C0; &#xB3D9;&#xBD81;&#xB3D9; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;&#xB97C; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD568;&#xAED8; SUN2 &#xCCAB; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; INM &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xACE0; INM&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC911;&#xC7AC; &#xAE30;&#xB2A5; cNLS, Golgi &#xAC80;&#xC0C9; &#xC2E0;&#xD638; &#xBC0F; perinuclear &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD074;&#xB798;&#xC2DD; NLS&#xC640; &#xD0DC;&#xC591; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB0B4;&#xBD80; &#xD575; &#xB9C9;&#xC5D0; sun2&#xB97C; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC5EC;.

Prote&iacute;nas de membrana integral de la membrana nuclear interna (INM) se insertan en la membrana del ret&iacute;culo endopl&aacute;smico durante su biog&eacute;nesis y luego se dirigen a su destino final. Hemos utilizado humano N2 para delinear las caracter&iacute;sticas que se requieren para apuntar el INM y han identificado varios elementos que contribuyen colectivamente a la localizaci&oacute;n eficiente de N2 a la envoltura nuclear (NE). Un tal elemento apuntado es una se&ntilde;al de localizaci&oacute;n nuclear cl&aacute;sica (LNC) presente en el dominio N-terminal, nucleoplasm&aacute;tica de N2. Un segundo motivo proximal a la LNC es un grupo de arginines que sirve COAT&Oacute;MERO mediada por recuperaci&oacute;n de N2 del Golgi. Inesperadamente, el dominio c-terminal, lumenal de SUN de N2 admite tambi&eacute;n localizaci&oacute;n NE, mostrando que los elementos objetivos no se limitan a dominios citoplasm&aacute;ticos o transmembrana de prote&iacute;nas INM. En su conjunto, N2 representa la primera prote&iacute;na INM mam&iacute;fera depende un LNC funcional, una se&ntilde;al de recuperaci&oacute;n de Golgi y un dominio perinuclear mediar dirigidos a que el INM.

Andrea Rothballer

Howard Hughes Medical Institute,
Laboratory of RNA Molecular Biology,
Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology

Rockefeller University

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Andrea Rothballer

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Rockefeller University

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Howard Hughes Medical Institute,
Laboratory of RNA Molecular Biology,
Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology