Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Zusammenfassung

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Zusammenfassung

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen sind bei der Grundlagenforschung in vitro Herz-Kreislauf, weil sie leicht in großen Stückzahlen getrennt werden, in einem einzigen Verfahren. Aufgrund der Fortschritte in der Mikroskoptechnik ist es relativ einfach, Live-Cell-Bilder für die Zwecke der Untersuchung zellulärer Ereignisse in Echtzeit mit minimaler Besorgnis über Phototoxizität zu den Zellen zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Live-Cell-Zeitrafferbilder von primären Ratten-Herzmuskelzellen nehmen Neugeborenen mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgende lentiviralen und adenovirale Transduktion, um die Eigenschaften der Zelle zu modulieren. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Viren macht es einfacher, eine geeignete Übertragungsrate und die Expressionsniveaus für zwei unterschiedliche Gene zu erreichen. Nun konzentriert Lebendzell Bilder können mit Autofokus-System des Mikroskops, die stabile Fokus für lange Zeiträume beibehält, erhalten werden. Gemäss dieser Methode werden die Funktionen von exogen Ingenieured Proteinen in kultivierten primären Zellen exprimiert werden, können analysiert werden. Zusätzlich kann dieses System verwendet, um die Funktionen von Genen durch die Verwendung von siRNAs sowie von chemischen Modulatoren zu untersuchen.

Einleitung

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen haben lange für die Untersuchung von Herzmuskelzellen in vitro Funktion ¹ verwendet. Sie sind leicht zu von Rattenjungen von mehreren etablierten Methoden ^4.2 zu isolieren. Das häufigste Verfahren verwendet Kollagenase oder Trypsin Bindegewebe des Herzens vor der Zellisolierung zu verdauen. Die Forscher haben auch Methoden zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus adulten Nagetieren ^5-8 sowie ^9,10 neugeborenen Mäusen entwickelt.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten-Jungtieren unter Verwendung einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren. Trypsin wird zuerst verwendet, O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Collagenase bei 37 ° C. Inkubation des Herzgewebes mit Trypsin O / N bei 4 ° C reduziert die notwendigen Schritte Ernten der Zellen im Vergleich zu Verfahren mit sequentieller Inkubation in einem warmen Enzymlösung ^2. Zusätzlich kann durch Verwendung von gereinigtem Collagenase anstatt rohe Enzyme können von Los zu Los-Variabilität eliminiert werden, wodurch eine verbesserte Reproduzierbarkeit.

Funktionsstudien eines bestimmten Proteins verwenden oft ein Protein-Expressionssystem unter Verwendung eines Adenovirus, ^11-13 und / oder ein Lentivirus ^14-16. [WARN HINWEIS] Die Virusproduktion und Manipulation sollte nach den NIH-Richtlinien durchgeführt werden.

Das Adenovirus nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Es hat einen sehr hohen Transduktionseffizienz in den meisten Zelltypen, einschließlich teilende Zellen und nicht-teilende Zellen, wie auch primäre Zellen und etablierten Zelllinien. Dies macht das Adenovirus eine zuverlässige Vektor zur Genexpression. Hohe Konzentrationen des Proteins von dem Adenovirus-Vektor codiert entwickeln innerhalb von 48 Stunden nach Transduktion, und sie für ¹⁷ Wochen dauern. Ein Nachteil der Verwendung eines Adenovirus für die Proteinexpression ist jedoch, daß die Entwicklung eines rekombinanten adenovirus ist sowohl kompliziert als auch zeitaufwendig. Dieser Nachteil erklärt zum Teil, warum viele Forscher Lentiviren worden Drehen für rekombinante Genexpression. Im Gegensatz zu adenoviralen Konstrukte, wodurch eine lentiviralen Konstrukt ist schnell und einfach. Obwohl Lentiviren haben geringere Effizienz der Transduktion als Adenoviren, in beiden Teilen und nicht-teilende Zellen, sie in das Wirtsgenom zu integrieren. Folglich ist die Expression des transduzierten Gens für Lentiviren als für Adenoviren stabiler.

Aufgrund technologischer Fortschritte in der Mikroskopie, ist es viel einfacher, lebende Zellbilder von Zellen, die rekombinanten Proteine ​​zu erfassen. Dies gilt auch bei Videorate Geschwindigkeiten des Erwerbs. Dies ermöglicht dem Prüfer, um festzustellen, wie bestimmte Veränderungen in dem Protein von Interesse in funktioneller Einfluss auf die Zelle in Echtzeit. Das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop hat mehrere Eigenschaften, die es eine optimale Technik für liv machenE-Cell-Imaging ^18,19. Die Yokogawa Spinning Disc ermöglicht viel schnellere Bildaufnahme, während zur gleichen Zeit nutzen weit weniger Strom als Laserpunkt konfokalen Mikroskopen. Beide dieser Besonderheiten sind aufgrund der sich drehenden Scheibe, die eine Vielzahl Löcher, durch die konfokale Laser gelangt gleichzeitig an die Proben enthält. Während der Erwerb, die Festplatte selbst dreht sich schnell und kontinuierlich ^18-20. Durch die Verwendung des Autofokus-Systems des Mikroskops wird eine stabile Fokus über lange Zeiträume aufrechterhalten. Diese ermöglicht es Forschern, gut fokussierte Bilder Live Cell nehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei gespielt. Die Bilder werden mit Bildanalyse-Software wie ImageJ ^21,22, FIJI ²³ oder anderen im Handel erhältlichen Software analysiert.

Protokoll

1. Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten

1. Verwenden Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Minimum Essential Medium (MEM) mit fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (P / S) als Kulturmedium ergänzt. Hinzufügen Bromdesoxyuridin (BrdU) in das Medium, um das Wachstum von Fibroblasten für die ersten 2 Tage nach der Isolation zu verhindern.

	Basismedium	FBS	BrdU (mM)	P / S (U / ml)
Auswahl	DMEM	10%	0	20
Der erste Tag	DMEM	10%	0,1	10
Am nächsten Tag	DMEM / MEM	5%	0,1	10
Weitere Kultur	DMEM / MEM	5%	0	10

Tabelle 1:. Medium für neonatale Rattenherzmuskelzellen Verwenden Sie diese Medien für die Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen. DMEM / MEM 1:1 Mischung von DMEM und MEM-Medium.

1. Cardiomyocyte Isolation, Tag 1 (Geschätzte benötigte Zeit, ca. 1 Std.)
   HINWEIS: Für die Arbeit mit Neugeborenen Nagetiere, beziehen sich auf lokale Universität Richtlinien und Regeln von Tierpflege-Programme eingestellt, und sich an institutionell genehmigten Tier Protokolle. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Yale Tier Resource Center genehmigt worden.
   1. Bereiten Reagenzien und Werkzeuge: Calcium-und Magnesium-freie Hank-Salzlösung (CMF HBSS), 30 x 2 ml, 10 ml x 2, auf Eis; 1 mg Trypsin, mit 2 ml CMF-HBSS, auf Eis rekonstituiert; autoklaviert Werkzeuge; 70% Ethanol (EtOH) in 250 ml-Becher; vier sterilisiert 10 cm Kunststoffschalen, drei für die Isolierung der Herzen und eine für Trypsinierung.
   2. Bestellen 1 litter von 1-zu-2-Tage alten Rattenjungen (ca. 10 Jungtiere) mit ihren Damm von einem Versuchstier Verteiler.
   3. 1. Tag, Transfer Welpen zu kleinen Käfig und einschläfern Damm mit einer Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin und Xylazin 200ml/10g 20ml/10g) Überdosis.
   4. Nehmen Sie einen Welpen und zu sterilisieren seinen ganzen Körper mit 70% EtOH. Enthaupten Welpen mit gepflegten scharfen chirurgischen Schere auf einem sterilisierten 10 cm Kunststoffschale an einer von anderen Welpen isoliert.
      HINWEIS: Um so schnell wie möglich die Proben zu sammeln, ist es am besten, um die schnellste und effiziente Verfahren für die Beendigung des Lebens der Nager zu verwenden. Enthauptung, wenn sie richtig durch qualifizierte Fachkräfte mit gut gewartete Geräte verwendet werden, können in weniger Furcht und Angst für das Tier führen und sein schneller und praktischer als andere Formen der Euthanasie. Er steht im Einklang mit den Empfehlungen der American Veterinary Medical Association Richtlinien für die Euthanasie von Tieren.
   5. Er schlug entfernenKunst mit sterilisierten Instrumente und legte Herz in 30 ml Eis gekühlt CMF HBSS in 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: so schnell wie möglich entfernen, die Herzen und legte sie sofort auf Eis. Nach dem Entfernen der Herzen aus dem Körper, sollten alle Verfahren auf Eis durchgeführt werden.
   6. Sammle 5 Herzen in 30 ml Eis gekühlt CMF HBSS und die restlichen 5 Herzen in weiteren 30 ml Eis gekühlt CMF HBSS. Schwenken Sie die Röhre, um die Herzen zu spülen. HINWEIS: Nach diesem Schritt führen Sie alle Verfahren in einer Steril.
   7. Überstand verwerfen und übertragen die Herzen zu einem neuen sterilisiert 10 cm Kunststoffschale auf Eis. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Herzen mit der Wasserstrahlpumpe absaugen.
   8. Entfernen Sie den großen Schiffen und / oder unerwünschte Gewebe. 10 ml Eis gekühlt CMF HBSS in die Schale, um die Herzen zu spülen.
   9. Übertragen Sie alle Herzen zu einem neuen sterilisiert 10 cm Kunststoffschale auf Eis. Mince die Herzen mit einer Schere auf weniger als 1 mm ³ auf Eis.
   10. In 9 ml CMF HBSS gekühlt. 1 ml der gekühlten Trypsin Rekonstitutionmit CMF-HBSS (final 50 ug / ml) tuierten.
   11. Verschließen Sie die Schüssel mit Parafilm und bedecken Sie es mit Aluminiumfolie, dann legen Sie sie in kaltem (4 ˚ C) über Nacht.
2. Cardiomyocyte Isolation, Tag 2 (Geschätzte benötigte Zeit, ca. 4 Stunden)
   1. Bereiten Reagenzien und Instrumente: 50 ml konischen Röhrchen x 2; 2 mg Trypsin-Inhibitor, mit 1 ml CMF-HBSS, auf Eis rekonstituiert; 1500 Einheiten Kollagenase, mit 5 ml Leibovitz L-15, bei Raumtemperatur (RT) rekonstituiert; Leibovitz L-15, mit 1 Liter sterilisiertes Wasser rekonstituiert und durch ein 0,22-Mikron-Filter, 8 ml bei RT; 10 mg / ml (32,6 mM) BrdU in Wasser; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; zwei 10 cm Zellkulturschalen; 3,5 cm Glasboden Gerichte.
   2. Tag 2, Vorbereitung Gelatine beschichteten Schalen. 1 ml der 0,1% igen Gelatinelösung zu beschichten, eine Bodenschale 3.5 cm Glas für ein Imaging-Experiments. Gerichte bei 37 ˚ C für mehrere Stunden, dann absaugen und entsorgen Gelatine-Lösung vor dem Gebrauch.
      NOTE: Ein 3,5 cm Glasbodenschale ist geeignet für ein bildgebendes Experiment mit einem Fluoreszenzmikroskop. Zur Extraktion von Proteinen aus primären Kardiomyozyten zur Proteinexpression durch Western-Blot (WB) zu erkennen, werden 0,1% Gelatine beschichtete Zellkulturschalen verwendet werden.
   3. Übertragen Sie alle Herzgewebe durch Trypsin über Nacht mit Puffer auf 50 ml konischen Röhrchen auf Eis in der sterilisierten Kapuze verdaut. 1 ml der Trypsin-Inhibitor in CMF-HBSS (final 182 ug / ml). Schließen Sie den Deckel von 50 ml konischen Röhrchen fest, um eine Kontamination zu verhindern.
   4. Das Röhrchen für ca. 30 min in einem 37 ˚ C Inkubator, um Gewebe erwärmen und Puffer zu 30-37 ˚ C. 5 ml Kollagenase in Leibovitz L-15 (final 94 Einheiten / ml). Bei 37 ˚ C für 45 min unter leichtem Schütteln (170-200 rpm Schüttler in 37 ˚ C Inkubator).
      HINWEIS: Dieser Schritt kann außerhalb der Sterilbank durchgeführt werden. Alle nachfolgenden Schritte bei RT durchgeführt werden.
   5. Desinfektion der Außenseite einer 50 ml konischen Röhrchen mit 70% EtOH und legtees in der sterilisierten Kapuze.
   6. Verreibung Gewebe mit Auto Pipette mit Pipettieren mit 3 ml / sec Geschwindigkeit 20 mal. Lassen Gewebereste für 3 min mit einer 70 um Zellsieb begleichen und filtern den Überstand.
      HINWEIS: Eine regelmäßige Größe 10 ml Pipette kann für das Verreiben verwendet werden.
   7. 5 ml des Leibovitz L-15 auf die verbleibenden Gewebeklumpen und verreiben und Filtern der Überstand wieder. Waschzelle Sieb mit 2 ml der Leibovitz L-15.
   8. Zeigen gefiltert Zell-Lösung in einer Haube für 20 bis 60 min, damit Kollagenase, die teilweise abgebauten Kollagen zu verdauen.
   9. Sediment-Zellen bei 100 x g für 5 min. Resuspendieren Zellen in 20 ml DMEM mit 10% FBS und hoher Konzentration P / s (20 U / ml).
   10. Pre-Platte Zellen auf zwei 10 cm Zellkulturschalen für 1 h in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C für Kardiomyozyten Auswahl. HINWEIS: Die Fibroblasten befestigen leichter an der Unterseite der Schale als Kardiomyozyten.
   11. While Warte, bereiten DMEM mit 10% FBS, P / S (10 U / ml) und 0,1 mM BrdU. 1 ml 10 mg / ml BrdU bis 325 ml DMEM mit 10% FBS und P / S.
   12. Swirl Gerichte schonend und sammeln die Kardiomyozyten enthaltende Überstand von zwei 10-cm-Schalen.
       HINWEIS: Die meisten Kardiomyozyten wird immer noch im Überstand nach 1 h Inkubation schwimm werden. Um eine Kontamination mit Fibroblasten, die leicht an der Schale befestigt sind zu vermeiden, den Überstand nicht durch Pipettieren sammeln.
   13. Optional> Zählen von Zellen im Überstand mit und ohne 0,2% Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.
   14. Sediment-Zellen bei 100 x g für 5 min. Resuspendieren Zellen in DMEM mit 10% FBS, P / S (10 U / ml) und 0,1 mM BrdU. Platten Zellen bei 2 × 10 ⁵ Zellen / Schale in gelatinebeschichteten 3,5 cm Glasbodenschalen für die Beobachtung mit dem Mikroskop. HINWEIS: Bitte nicht stören-Zellen nach der Beschichtung mindestens 24 Stunden im CO _2-Inkubator bei 37 ˚ C.
   15. Tag 3, Change Medium 24 Stunden nach dem Plattieren auf DMEM / MEM, enthaltend 5% FBS, P / S und 0,1 mM BrdU.
   16. Tag 4, Änderungsmedium 48 Stunden nach dem Plattieren auf DMEM / MEM, enthaltend 5% FBS und P / S.
       HINWEIS: Ändern Medium alle 2-3 Tage mit DMEM / MEM, enthaltend 5% FBS und P / S.

2. Lentivirale Transduktion

1. Die Verpackung der lentiviralen Plasmide
   Hinweis: Bitte beziehen Sie sich auf andere Quellen für weitere ausführliche Informationen zu diesem Thema ^24-26. Es wird über 3 Tage, um den lentiviralen Lösung herzustellen. Es ist am besten an die frische lentiviralen Lösung verwenden, um höhere Übertragungseffizienz zu erreichen. Starten Sie die Verpackung der lentiviralen Plasmide und Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten parallel. Anstelle der Verwendung von Polyethylenimin (PEI) ²⁷ zum Verpacken von lentiviralen Plasmide, kann ein handelsüblicher Transfektionsreagenz verwendet werden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
   1. Bereiten Reagenzien und Instrumente; HEK293T-Zellen, 10 cm Zellkulturschalen, lentiviralen Plasmid Lösungen (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviralen Transfervektor, 1,0 mg / ml), 1 g / l PEI, serumfreies Medium, 20 mM Chloroquin in Wasser, 10% Bleichmittel, 1% SDS in 70% EtOH
   2. Tag 0, Platten 2-2,5 x 10 ⁶ HEK 293T-Zellen pro 10 cm Schale am Tag vor der Transfektion.
      HINWEIS: 30-60% Konfluenz bei der Transfektion ist optimal.
   3. Tag 1, Vorbereitung PEI Transfektionslösung. In 30 ul von 1 g / l PEI zu 960 ul Serum-freien Medium in einem 1,5-ml-Tube. In vier Plasmide in der PEI-Transfektion Lösung in 1,5-ml-Röhrchen und mit Anzapfung mischen.

   Name des Plasmid	Anmerkung	Größe (kb)	Volumen aufgenommen (ml)	Endbetrag in 10-cm-Spiegel (mg)	Endgültige Konzentration in 10-cm-Spiegel (PM)
   Lentiviralen Transfervektor	Gen kodiert zu verpackenden	9-13	3,6-5,2	3,6-5,2	60
   pMDLg / pRRE	drückt HIV-1 gag / pol	8.8	1,76	1,76	30
   pRSV-Rev	drückt HIV-1-rev	4.1	0,82	0,82	30
   pMD2.G	drückt VSV-G	5.8	1,16	1,16	30

   Tabelle 2:. Die Höhe der Plasmide für die lentiviralen Verpackungs Verwenden Sie diese Plasmid beträgt HEK293 Transfektion von Zellen in 10 cm-Schalen. Endgültige Höhe der lentiviralen Transfervektor pro Schale kann je nach seiner Größe unterscheiden, pflegen Endkonzentration pro Gericht bei 60 pM. Mittleres Molekulargewicht von einem Basenpaar einer doppelsträngigen DNA ist 660 Dalton.

   2. Entsorgen Sie alte Mediumvon 10 cm Schale von HEK 293T-Zellen, und sanft hinzufügen 9 ml neues Medium (DMEM + 10% FBS, ohne P / S).
   3. In PEI-DNA-Gemisch vorsichtig tropfenweise auf die Platte und schwenken mit Medium mischen. In 10 ul 20 mM Chloroquin (letzten 20 uM) bis 10 ml Medium. HINWEIS: Chloroquin wird angenommen, dass die Zersetzung von Plasmid-enthaltenden Transfektionskomplexen durch teilweise Neutralisation der pH-Wert im lysosomalen Kompartimenten ²⁸ zu reduzieren.
   4. Inkubation in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C für 6 Stunden. Dann entfernen Medium, das die PEI-DNA-Gemisch und 10 ml neues Medium (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4 + P / S) . HINWEIS: Nach der Inkubation Virus wird im Medium hergestellt werden. Ansaugrauchmelder Pasteur Pipetten und / oder Tipps um 10% Bleichmittel dekontaminiert werden. Immer dekontaminieren biologischen Sicherheitsschrank Oberfläche und potenziell kontaminierten Geräten mit 70% EtOH unabhängig davon, ob Überstand wurde verschüttetoder nicht. Wenn Verschütten stattgefunden hat, ist eine gründliche Dekontamination mit 1% SDS in 70% EtOH erforderlich.
   5. Tag 2-3, Inkubation in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C für 48-72 Stunden. 4. Tag, sammeln lentiviralen-Lösung (weiter Abschnitt 2.2).
      HINWEIS: Medium kann zu 48 Stunden nach der Transfektion geändert werden. Sammeln Virusüberstand zu 48 Stunden und 72 Stunden zweimal kann erreichen, um höheren Titer Virus-Lösungen zu erhalten.
2. Sammlung von lentiviralen Lösung und Transduktion
   1. Bereiten Reagenz und Werkzeuge: 15 ml konische Röhrchen, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 um gefiltert)
   2. Tag 4, Sammeln Überstand, Lentivirus-Partikel (lentiviralen Lösung) mit 10 ml sterilisiertem Luer-Lok-Spritze, dann auswählen, den Überstand durch ein 0,45 &mgr; m in einem 15 ml konischen Röhrchen filtern. 1/100 Volumen 1 M HEPES, pH 7,4, zu filter lentiviralen Lösung (10 mM final).
      HINWEIS: Zum Filtern, verwenden Sie nur Zellulose-Asstate oder Polyethersulfon (PES) (niedrige Proteinbindung)-Filter. Verwenden Sie keine Nitrocellulosefilter. Nitrocellulose bindet Oberflächenproteine ​​auf der lentiviralen Hülle zerstört und das Virus.
   3. Entfernen Medium von 3,5 cm Gerichte der Ratte neonatalen Kardiomyozyten, im letzten Schritt von Abschnitt 1.2 erhalten, 1 ml der gefilterten lentiviralen Lösung des 3,5-cm-Spiegel.
   4. In Hexadimethrinbromid (Endkonzentration 4-6 ug / ml).
      HINWEIS: Hexadimethrinbromid kann lentiviralen Transduktionseffizienz zu verbessern. Konzentration von Hexadimethrinbromid optimiert werden.
   5. Inkubieren Gericht für 6 Stunden in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C für lentivirale Transduktion, dann ändern, um neue Medium DMEM / MEM mit 5% FBS und P / S. Inkubieren Schale in CO _2-Inkubator bei 37 ˚ C für 3 Tage.
      HINWEIS: Die Integration des exogenen Gens in das Wirtsgenom durch Lentivirus ist als von 72 Stunden abgeschlossen werden.
   7. Tag 7 Zellen aus Schritt 2.2.5 für den nächsten Schritt. HINWEIS: Die Protein-Expression von der lentiviralen Plasmid kann von WB oder Immunzytochemie (ICH) nach 48-72 Stunden der Transduktion, um die relative Expressionsniveau bestimmen, bestätigt werden (Abbildung 1a und 1b).
3. Die Konzentration der Lösung lentiviralen
   HINWEIS: Es ist am besten, frischen lentiviralen Lösung, um höchste Übertragungswirkungsgrade zu verwenden, wenn die Lösung lentiviralen Titer nicht hoch genug ist, die lentiviralen Lösung kann durch Polyethylenglykol (PEG)-Niederschlag ²⁹ konzentriert werden.
   1. Herstellung von 4x PEG-Lösung (32% PEG 6000, 400 mM Natriumchlorid (NaCl), 40 mM HEPES pH 7,4)
      1. Für 4x 125 ml PEG-Lösung, wiegen 40 g PEG 6000, dann löst ihn in 60 ml Wasser.
         HINWEIS: HINWEIS: (. Dh Durchschnittsmolekulargewicht von PEG 6000 ist 6000) Die Zahl nach PEG ist das mittlere Molekulargewicht
         HINWEIS: 2.3.1.2) langsam 10 ml5 M NaCl. Langsam 5 ml 1 M HEPES pH 7,4. PH-Wert auf 7,4 mit 2 M Natriumhydroxid.
         HINWEIS: 2.3.1.3) Wasser hinzu, bis 125 ml. Sterilisieren 4x PEG-Lösung durch Membranfiltration mit einem 0,22 um Filter und speichern sie bei 4 ˚ C.
   2. Lentiviren Konzentration
      1. Filter lentiviralen Transduktion Überstand in neue 50-ml-Tube mit einem 0,45 um-Filter.
         HINWEIS: 2.3.2.2) hinzufügen 4x PEG-Lösung im Verhältnis 1:3 (PEG-Lösung: Überstand = 1,3). Lagern bei 4 ˚ C für 16-48 Stunden.
         HINWEIS: 2.3.2.3) Zentrifuge bei 2.600 x g bei 4 ˚ C für 30 min. Überstand verwerfen und die Zentrifuge bei 2.600 x g bei 4 ˚ C für 5 min.
         HINWEIS: 2.3.2.4) Überstand verwerfen vorsichtig, damit das Pellet aufzurühren. Resuspendieren Pellet in serumfreiem Medium unter Verwendung von 1/2 bis 1/25 Volumen des ursprünglichen Überstandvolumen.
         HINWEIS: 2.3.2.5) direkt verwenden oder einfrieren mit flüssigem Stickstoff bei -80 ˚ C lagern

3. Adenovirale Übertragung

Hinweis: Bitte beziehen Sie sich auf andere Quellen für Methoden zur Konstruktion und Vermehrung von adenoviralen Konstrukte ^13. Ansaugrauchmelder Pasteur Pipetten und / oder Tipps um 10% Bleichmittel dekontaminiert werden. Immer dekontaminieren biologischen Sicherheitsschrank Oberfläche und potenziell kontaminierten Geräten mit 70% EtOH unabhängig davon, ob Überstand wurde verschüttet. Wenn Verschütten stattgefunden hat, ist eine gründliche Dekontamination mit 1% SDS in 70% EtOH erforderlich.

1. Adenovirale Titration um 50% Gewebekulturinfektionsdosis (TCID ₅₀₎
   HINWEIS: Bevor Übertragung, ist es notwendig, den Adenovirus-Stammlösung titriert. KID ₅₀ ist eine der besten Methoden, um die virale Lösung titriert. Da die Methode wertet einen Titer durch einen infektiösen Fähigkeit, HEK 293T-Zellen, berechnet TCID ₅₀ gibt den tatsächlichen Infizierbarkeit des Adenovirus Lager. Die PFU (Plaque-bildenden units) ist proportional zu der TCID ₅₀ mit einem Faktor von etwa 0,56 ^30.
   1. Vorbereitung der Zellen und Werkzeuge: HEK 293T-Zellen, 10 cm Zellkulturschalen, 96-Loch-Flachboden-Zellkulturplatte, 8-Kanal-Pipette mehr
   2. Bereiten 70-90% konfluente HEK 293T-Zellen in einer 10 cm Schüssel.
   3. Führen Sie eine Pre-Verdünnung von 1/10 ⁴ des Virus Lager. Dann werden 50 ul DMEM + 10% FBS zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Flachboden-Zellkulturplatte. In 25 ul der Pre-verdünnten Virus-Stock in die erste Reihe, von A bis H.
   4. Gut mischen und übertragen 25 ul aus der ersten Reihe von Brunnen in die zweite Reihe mit einem 8-Kanal-Multipipette. Wiederholen Sie den 1/3 Verdünnung der Viruslösung in jede Reihe von Brunnen bis einschließlich der 11. Reihe und entsorgen letzten 25 Ul.
   5. Verreibung HEK 293T-Zellen in 10 ml DMEM + 10% FBS. In 50 ul Zelllösung in jede Vertiefung aus den Zeilen 1 bis 12.
   6. Zellen bei 37 ˚ C im CO2-Brutschrank für 11 bis 13 Tage. In 50 ul DMEM + 10% FBS nach 4-5 Tagen und 7-8 Tage Beschichtung.
   7. Messen Sie die zytopathischen Effekte in jeder Vertiefung bei 11 bis 13 Tage nach der Infektion.

   Spur

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Reihe A

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe B

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   d

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   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe C

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Row D

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe E

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe F

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe G

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Reihe H

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   die Anzahl der positiven Vertiefungen pro Zeile

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   6

   5

   2

   2

   0

   das Verhältnis von positiven Vertiefungen pro Zeile

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   0,75

   0,63

   0,25

   0,25

   0

   d	Angezeigte über 50% zytopathischen Effekte
   	Angezeigte unter 50% oder keine zytopathischen Effekte

   Spur 1, 3 Verdünnung ¹ x10 ^4; Spur 2, Verdünnung 3 ² x10 ^4; ...; Bahn 11, Verdünnung 3 ² x10 ^11; Spur 12, Kontrolle.
   S = die Summe der Verhältnisse von positiven Vertiefungen pro Zeile
   = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
   TCID ₅₀ = 3 x 10 x ⁴ x 3 (8,875 bis 0,5) = 2,97 x 10 ⁸
   KID ₅₀ / ml = 5,94 x 10 ⁹

   Tabelle 3: Beispiel einer infizierten 96-Well-Platte nach 10 Tagen Inkubation Messen Sie die zytopathischen Effekte in jede Vertiefung und summieren die Verhältnisse der positiven Vertiefungen pro Zeile..

   8. Berechnen Sie den Titer nach Kaerber-Formel ^31.
   9. KID ₅₀ = (Verdünnung der ersten Spur) x (Verdünnung) ^(S-0.5)
   10. S = die Summe der Verhältnisse von positiven Vertiefungen pro Zeile
       HINWEIS: Bei diesem Protokoll TCID ₅₀ = (30000) x (3) ^(S-0.5). Weil 50 ul Viruslösung wird in diesem Protokoll verwendet, teilen TCID ₅₀ von 0,05 bis KID ₅₀ / ml zu berechnen.
2. Adenovirus-Transduktion
   1. Berechnung erforderliche Menge an Adenovirus-Lösung von ihrer Titer (PFU / ml Viruspartikel / ml oder TCID ₅₀ / ml). Verwenden Sie die Formel, um MOI (Multiplizität der Infektion) zu berechnen.
   2. em> [Tabelle 4 Platz hier]
   3. Hinzufügen des berechneten Menge der Viruslösung in serumfreies Medium (siehe Tabelle 5). Gut mischen und Inkubation für 20 min bei RT.
   4. em> [Tabelle 5 Platz hier]
   5. Tag 7, Take Gericht im letzten Schritt von Abschnitt 2.2 erhalten wird, und ersetzen Medium mit 750 ul neue DMEM / MEM mit 5% FBS und P / S.
      HINWEIS: Reduktion der mittleren Volumenbei Transduktion bis etwa 50% des ursprünglichen Volumens ist für hohe Transduktionseffizienz.
   6. In verdünnter Virus-Lösung zu Gericht. Inkubieren Gericht für 4-8 Stunden in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C. Ersetzen Sie dann mit frischem Medium.
   7. Inkubieren Gericht für 24-48 Stunden in CO _{2-Brutschrank} bei 37 ˚ C. Am Tag 8-9, Verwenden Zellen für die Live-Cell-Imaging Experiment. HINWEIS: Die Protein-Expression von adenoviralen Plasmid kann durch WB oder ICH nach 24-48 Stunden der Transduktion, um die relativen Proteinexpressionsniveau (Fig. 1c und 1d) zu bestimmen, bestätigt werden.

4. Live-Cell-Imaging

1. Bildaufnahme mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einer temperaturgesteuerten Kammer und eine CO _{2-Umwelt-System} (optional)
   1. Drehen des Temperatursteuersystems auf mindestens 1 Stunde vor der Übernahme, so dass alle Geräte äquilibrieren bis 37 ˚ C vor dem Beginn der Erfassung. Schalten Sie confocal Spinning-Disk-Mikroskop-System (PC für den Betrieb, Mikroskop, Spinning-Disk-Einheit, CCD-Kamera, Laser, Fluoreszenzlichtquelle, normale Lichtquelle, Motortisch und automatische Rollläden).
      HINWEIS: Mehr als 1 Stunde ist notwendig, um die komplette Temperaturausgleich aller Geräte zu erreichen.
   2. Ändern Medium in 3,5 cm Glasboden Gerichte gewünschte Medium für den Erwerb, wenn nötig. Die Schale auf der Bühne des konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop in einem temperaturgeregelten Kammer.
      HINWEIS: Aufgrund der sphärischen Aberration für eine optimale Beobachtung durch Mikroskopie Verwendung einer Bodenschale 3,5 cm Glas mit Nr. 1.5 Deckglas (etwa 0,16 bis 0,19 mm Dicke) ist ideal. Wenn das Ziel, die verwendet wird, hat eine Korrektur Kragen, können Bilder mit Deckgläser dicker als 0,17 mm erhalten korrigiert werden. Auch hat Phenolrot eine leichte Fluoreszenz. Manchmal ist es bevorzugt, ein Phenolrot-freiem Medium, wie z. B. DMEM ohne Phenolrot verwenden. Wenn kein Gerät an CO steuern _{2-Konzentration auf dem Mikroskoptisch ist es besser, sich für eine CO 2 unabhängige Medium oder Medium durch HEPES für langfristige Zeitraffer-Imaging gepuffert.}
   3. Wählen Sie den Lichtweg zu den Okularen.
   4. Drehen Sie den Verschluss der Hellfeldlichtquelle auf. Stellen Sie den Fokus auf Zellen unter dem Mikroskop durch die Okulare. Drehen Sie den Auslöser für die Hellfeldlichtquelle aus.
   5. Drehen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlichtquelle auf. Finden Zellen, die fluoreszierende Proteine ​​unter dem Mikroskop durch die Okulare. Drehen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlichtquelle aus.
   6. Optional> Drücken Sie die Aktivierungstaste für die perfekte Fokussystem vor dem Mikroskop, um die perfekte Fokussystem auf, um den Fokus während der Zeitraffer-Akquisition stabil zu halten machen.
   7. Ändern Sie die Lichtstrecke zum Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop. Passen Sie die Einstellungen für den Erwerb entsprechend mit der Bediensoftware, die Überprüfung Bilder displayEd auf dem Bildschirm. (Z. B. Fokus, Laserleistung, Belichtungszeit, Gain und CCD-Kamera off-set)
   8. Set-Einstellungen für die Fluoreszenzbildaufnahme mit der Betriebssoftware. Beispiel: Wählen Sie "Kanäle ändern mit Lichtwege" und "Kanal 1: EGFP", um Fluoreszenzsignal von EGFP für Kanal eins zu erwerben.
   9. Stellen Sie die Frequenz zwischen den Zeitpunkten durch die Konfiguration Zeitraffer-Einstellungen, um Zeitraffer-Bilder nehmen mit der Bediensoftware. Beispiel: Um ein Zeit-Punkt erwerben alle 5 Minuten, wählen Sie "Minuten pro Zeit-Punkt" aus dem Dropdown-Menü und geben Sie 5 in das Textfeld ein.
      HINWEIS: Wählen Sie "Maximum Speed", um einen Film zu Ist-Geschwindigkeit zu machen. Wenn die Expression des fluoreszierenden Proteins gering ist, kann die Fluoreszenz schnell während Zeitraffer-Erwerb zu bleichen. In diesem Fall ist es besser, die Anzahl der Erfassungszeitpunkte zu reduzieren.
   10. Starten Sie die Zeitraffer-Übernahme durch Klick auf den "start "-Taste, um eine Bildsequenz zu erwerben.
       HINWEIS: Es ist besser, nicht zu den Mehrpunkte Nahme-Funktion verwenden. Es kann zum Verlust des Fokus oder Bewegung des Bildfeldes während Zeitraffer-Bildgebung verursachen.
2. Die Analyse der aufgenommenen Bilder
   HINWEIS: Erworbene Bilder können wieder als Filmdatei abgespielt und mit der Analyse-Software analysiert.
   1. Wählen Sie die aufgenommenen Bilder in einem Film enthalten sein. Wenn nötig, schneiden Regionen von Interesse von Bilder und wählen Sie interessante Zeit-Punkte, um die Dateigröße des Films mit der Bediensoftware zu reduzieren.
   2. Export Bilder als Filmdatei im AVI-oder MOV-Format. Wählen Sie einen Film-Format von "Format" im Dropdown-Menü und der für den fertigen Film benötigt Timing, klicken Sie dann auf "Export". HINWEIS: Zeitraffer-Bilder auf einmal Punkt alle 5 Minuten kann wieder als Film mit 10 Bildern pro Sekunde, die 3000-mal schneller als die aktuelle Geschwindigkeit gespielt werden erworben.

Ergebnisse

Die Technik, ein Lentivirus-Codierung EGFP (enhanced green fluorescent protein)-markierten Cx43 (Connexin43) oder eine mutierte Cx43 ³² wurde verwendet, um EGFP-markierte Proteine ​​in Zellen zu exprimieren, und ein Adenovirus-Codierung FGFR1DN (Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 dominant negative illustrieren ) wurde verwendet, um in der Zelle ^33-35 heruntergefahren FGF-Signalisierung. Drei Tage nach der Trennung von Kardiomyozyten wurden die isolierten Kardiomyozyten mit Lentiviren, um E...

Diskussion

Primäre Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten isoliert werden seit langem verwendet, um Funktionen Kardiomyozyten in vitro zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von neonatalen Herzmuskelzellen aus Rattenjungen mit einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren wird zunächst Verdau mit Trypsin O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Kollagenase. Ein Vorteil der Verwendung des gereinigten Kollagenase Schritt ist, dass der gleiche Grad von Enzym wird für alle Isolierungen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 scissors for decapitation	WPI	501749	Autoclave before use
1 fine scissors for heart isolation and chopping	WPI	14393	Autoclave before use
2 fine forceps (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave before use
Three sterilized 10 cm plastic dishes	Sigma	CLS430165	for hearts isolation
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C	for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0.17-14-C	for TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70 % (v/v) in water	Sigma	E7148
2% gelatin	Sigma	G1393
One sterilized 10 cm plastic dish	Sigma	CLS430165	for trypsinization
Aluminium foil	any brand
parafilm	Sigma	P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish	Sigma	CLS430165	for selection
Auto pipette	Drummond Scientific	4-000-300	for trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter	nexcelom		to check and count cells
Microscope and Hematocytometer	any brand		to check and count cells
Trypan Blue Solution, 0.4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubator	Sanyo	MCO-19AIC
incubating orbital shaker	Sigma	Z673129	to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution	BD Pharmingen	550891
DMEM, High Glucose	invitrogen	41965039	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM	invitrogen	31095029	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal Bovine Serum	invitrogen	26140079
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	invitrogen	15140-122
Section 2 lentiviral transduction
three packaging plasmids
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (serum-free medium)	invitrogen	31985070
transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)	Polysciences	24765-2	It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substitute for PEI as transfection reagent
chloroquine	Sigma	C6628	dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES	Sigma	H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized	BD	309604
0.45 um filters	Sigma	F8677	use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
polyethylene glicol 6000	Sigma	81260
Sodium chloride	Sigma	S9888
sodium hydroxide	Sigma	S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes	Sigma	CLS430165
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile	BD Falcon	353072	for titration
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel	eppendorf	3122 000.035
Section 4 live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy	PerkinElmer	L7267000
a temperature controlled chamber	any brand		to keep temperature at 37 C
a CO2 environmental system	any brand		optional to maintain CO2 concentration optimal
Medium
CO2 Independent Medium, No Glutamine	invitrogen	18045-054	for long time time-lapse imaging
DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red	invitrogen	21063-029	for long time time-lapse imaging