İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Özet

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Özet

Kolayca tek bir işlem içinde çok sayıda izole edilebilir, çünkü Birincil sıçan neonatal kardiyomiyositlerde vitro Kardiyovasküler araştırmalarda temel yararlıdır. Nedeniyle mikroskop teknolojisindeki ilerlemeler bu hücrelere fototoksisite ilişkin en az endişe ile gerçek zamanlı olarak hücresel olayları araştırmak amacıyla canlı hücre görüntülerini yakalamak için nispeten kolaydır. Bu protokol hücrenin özelliklerini modüle Lentiviral ve adenoviral transdüksiyon izleyen bir konfokal dönen disk mikroskop kullanılarak primer sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin canlı hücre timelapse görüntüleri çekmek için nasıl açıklar. Virüs iki farklı uygulama daha kolay iki farklı genler için uygun bir iletim hızı ve ekspresyon seviyelerini elde etmek için yapar. Peki odaklı canlı hücre görüntüleri uzun süreler boyunca istikrarlı odak tutar mikroskop otofokus sistemi kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemde, dışsal mühendisinin işlevlerikültürlenmiş primer hücrelerde ifade ed proteinlerin analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu sistem siRNA'lar kullanımı yoluyla hem de kimyasal modülatörlerinin genlerin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

İlköğretim sıçan yenidoğan kardiyomiyositler uzun vitro ¹ kardiyomyosit fonksiyonlarını araştırmak için kullanılmıştır. Onlar birkaç iyi kurulmuş yöntemlerle ^2-4 sıçan yavrular izole etmek kolaydır. En yaygın yöntem kolajenazı önce veya hücre izolasyonu için kalbin bağ dokusu sindirmek için tripsin kullanır. Araştırmacılar ayrıca yetişkin kemirgenler ^5-8 yanı sıra yenidoğan farelerin ^9,10 dan kardiyomiyositlerin izole etmek için yöntemler geliştirmişlerdir.

Bu protokol, iki aşamalı bir prosedür kullanılarak enzim sindirimi, neonatal sıçan yavrularından kardiyomiyositlerde izole edilmesi için bir yöntem tarif eder. Tripsin ilk 4 ° C 'de O / N el ve 37 ° C sıcaklıkta ve sonra saf bir kolajenaz 4 ° C'de tripsin O / N, kalp dokusu inkübasyonu sıcak bir enzim solüsyonu ² ardışık inkübasyonlar kullanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında hücre hasat için gerekli adımları azaltır. Buna ek olarak, saflaştırılmış co kullanarakllagenase daha basit bir enzimlere göre, çok partiye değişkenlik dolayısıyla daha tekrarlanabilirlik sağlayan, elimine edilebilir.

, Belirli bir proteinin fonksiyonel çalışmalar, genellikle bir adenovirüs ^11-13 ve / veya ^14-16 lentivirüs kullanarak bir protein ifade sistemi kullanır. [Uyarıcı not] viral üretim ve manipülasyon NIH talimatlarına göre yapılmalıdır.

Adenovirüs konakçı genomu içine entegre değildir. Bu bölünen hücreler ve bölünmeyen hücreleri de dahil olmak üzere pek çok hücre tipi, hem birincil hücre ve hücre serileri de transdüksiyon çok yüksek bir etkinliğe sahiptir. Bu, adenovirüs gen ifadesi için güvenilir bir vektör sağlar. Adenovirüs vektörü tarafından kodlanan proteinin yüksek seviyeleri transdüksiyonu takip eden 48 saat içinde gelişir ve bunlar birkaç hafta ¹⁷ sürebilir. Bununla birlikte, protein ekspresyonu için bir adenovirüs kullanımının bir dezavantajı olduğu bir yeniden birleştirici ade geliştirilmesiAdenovirüs karmaşık ve zaman alıcı hem de. Birçok araştırmacı rekombinant gen ifadesi için Lentivirüslerden dönüm edilmiştir neden bu dezavantajı kısmen açıklıyor. Adenoviral yapıları aksine, bir lentiviral yapı üreten hızlı ve kolaydır. Lentivirüsler genellikle her iki bölme ve bölünmeyen hücrelere adenovirüs daha düşük transdüksiyon verimliliği, sahip olmakla birlikte, bunlar bir konakçı genom içine entegre yok. Sonuç olarak, kalıt aktarılan genin ifadesi için adenovirüsler daha lentivirüsler daha kararlıdır.

Nedeniyle mikroskopi alanındaki teknolojik gelişmeler, bu rekombinant proteinleri ifade eden hücrelerin, canlı hücre görüntülerini yakalamak için çok daha kolaydır. Bu bile edinimi video oranı hızlarda geçerlidir. Bu durum araştırmacı ilgilenilen proteinin, özellikle işlevsel değişiklikler, gerçek zamanlı olarak etki hücreyi belirlemek için izin verir. Konfokal dönen disk mikroskop o liv için optimal bir tekniktir yapmak birçok önemli özelliklere sahiptirE hücre görüntüleme ^18,19. Aynı anda nokta tarama konfokal mikroskoplar çok daha az lazer güç kullanırken Yokogawa eğirme disk, çok daha hızlı görüntü elde etmek için izin verir. Bu özelliklerin her ikisi de lazer örnekler aynı zamanda geçtiği çok sayıda eş odaklı delik içeren dönen bir disk, kaynaklanmaktadır. Satın alma sırasında disk kendisini hızla ve sürekli olarak ^18-20 spin. Mikroskop otofokus sistemi kullanarak, istikrarlı odak uzun süreler boyunca devam edilir. Bu araştırmacılar, iyi odaklanmış canlı hücre görüntü almasına izin veriyor. Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır. Görüntüleri, ImageJ ^21,22, FIJI ²³ ya da başka ticari olarak temin edilebilen yazılımı gibi görüntü analizi yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.

Protokol

Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 1. İzolasyon

1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve kültür ortamı olarak fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (MEM) kullanın. Izolasyon sonraki ilk 2 gün boyunca fibroblastların büyümesini önlemek için ortama bromodeoksiuridini (BrdU) ilave edin.

	Taban ortamı	FBS	BrdU (mM)	P / S (U / ml)
seçim	DMEM	% 10.	0	20
İlk gün	DMEM	% 10.	0.1	10
Ertesi gün	DMEM / MEM	% 5	0.1	10
Bundan başka kültürü	DMEM / MEM	% 5	0	10

Tablo 1:. Sıçan neonatal kardiyomiyosetlere Orta sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin kültürleme için bu ortam kullanın. DMEM / MEM, DMEM ve MEM ortamının 01:01 karışımıdır.

1. Kardiyomyosit izolasyon, 1. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 1 saat)
   NOT: neonatal kemirgenler ile çalışma için, hayvan bakım programları tarafından belirlenen yerel üniversite kurallar ve kurallara başvurmak ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan protokollere uygun. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler Yale Hayvan Kaynak Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
   1. Reaktifler ve araçları hazırlayın: kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, buz üzerinde; Buz üzerinde CMF HBSS 2 ml ile yeniden 1 mg tripsin; araçları otoklave % 70 250 ml çanak içinde etanol (EtOH); dört adet 10 cm plastik tabaklar, kalplerin izolasyonu için üç ve tripsinleme için bir sterilize.
   2. Sipariş 1 Littdeneysel hayvan distribütör kendi baraj ile 1-to-2-günlük fare yavrularının (yaklaşık 10 yavrular) arasında er.
   3. Gün1, küçük kafes yavrular aktarın ve ketamin / ksilazin kokteyl (Ketamin, 200ml/10g ve ksilizin 20ml/10g) doz aşımı ile baraj euthanize.
   4. Bir yavru almak ve% 70 EtOH ile tüm vücut sterilize. Diğer yavrular izole bir yerde steril bir 10 cm plastik tabak bakımlı keskin cerrahi makas ile yavru işten çıkarmak.
      Not: kısa sürede örnekleri toplamak için, bu kemirgen ömrünü sona erdirilmesi için en hızlı ve etkili bir yöntem kullanmak en iyisidir. Düzgün bakımlı ekipmanları ile uzman profesyoneller tarafından kullanılan Decapitation hayvan için daha az korku ve kaygı neden ve ötenazi diğer formları daha hızlı ve pratik olabilir. Bu Hayvanların ötanazi Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Yönergeleri tavsiyeleri ile uyumludur.
   5. Kaldır he dayaksterilize araçları ile sanat, ve 50 ml konik tüp içinde 30 ml buz soğutulmuş CMF HBSS'de kalp koydu. NOT: Mümkün olduğunca çabuk kalpleri çıkarın ve hemen buz üzerine koydu. Vücuttan kalbini çıkardıktan sonra, tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
   6. Buz soğutulmuş CMF HBSS, 30 ml soğutulmuş ve buz CMF HBSS başka bir 30 ml geri kalan 5 kalplerinde 5. kalpleri toplayın. Kalpleri durulama tüp girdap. NOT: Bu aşamadan sonra, bir laminar akış başlığı içinde bütün işlemleri gerçekleştirmek.
   7. Süpernatantı atın ve buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için kalpleri aktarın. NOT: aspiratör ile aspire kalpleri için dikkatli olun.
   8. Büyük gemiler ve / veya istenmeyen dokuları kaldırmak. Kalpleri durulama çanak buz soğutulmuş CMF HBSS 10 ml ekleyin.
   9. Buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için bütün kalpleri aktarın. Buz üzerinde en az 1 mm ^{ila 3} makas ile kalpleri kıyma.
   10. Soğutulmuş CMF HBSS 9 ml ekleyin. Soğutulmuş tripsin reconsti 1 ml ekleyinCMF HBSS (son 50 ug / ml) ile ikâmeli.
   11. Parafilm çanak Seal ve alüminyum folyo ile örtün, sonra soğuk bir odada (4 ˚ C) o gecede yerleştirin.
2. Kardiyomyosit izolasyon, 2. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 4 saat)
   1. Hazırlayın reaktifler ve araçları: 50 ml konik tüp x 2; Buz üzerinde CMF 1 ml HBSS ile yeniden 2 mg tripsin inhibitörü; Oda sıcaklığında (RT) Leibovitz L-15, 5 ml ile yeniden 1500 tane kolajenaz; Leibovitz L-15, steril 1 litre su ile tekrar oluşturulmuş ve bir 0.22 mikron filtre, oda sıcaklığında 8 ml geçirilerek filtre edilmektedir; Su içinde 10 mg / ml (32.6 mM) BrdU; P / S; DMEM +% 10 FBS; MEM; iki adet 10 cm plastik hücre kültürü yemekleri; 3.5 cm cam alt yemekler.
   2. Day2, jelatin kaplı yemekler hazırlanıyor. Kaplamak için bir görüntüleme deney için, 3.5 cm cam alt çanak% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml ilave edilir. Daha sonra aspire ve kullanımdan önce jelatin solüsyonu atın, birkaç saat boyunca 37 ° C'de ˚ yemekler inkübe edin.
      HAYIRTE: 3,5 cm cam alt tabak bir flüoresan mikroskop kullanılarak bir görüntüleme deney için uygundur. Western blot (WB) ile protein ekspresyonunu tespit etmek için birinci kardiyomiyositlerde proteinlerin ekstre edilmesi için,% 0.1 jelatin kaplı plastik hücre kültürü tabakları kullanılabilir.
   3. Steril kaputu buz üzerinde bir 50 ml konik tüp tamponla gece boyunca tripsin ile sindirilmiş bütün kalp dokusu aktarın. CMF HBSS tripsin inhibitörü 1 ml (son 182 ug / ml) eklenir. 50 ml konik tüp yakın kapak sıkıca bulaşmasını önlemek için.
   4. Doku ısınmaya bırakılmış ve 30-37 ˚ C'ye tampon için 37 ˚ C inkübatör içinde yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin Tüpü Leibovitz L-15 olarak 5 ml kollajenaz (nihai 94 birim / ml) eklenir. Yumuşak (37 ˚ C kuluçka makinesi içinde 170-200 rpm çalkalama) çalkalama ile 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ˚.
      Not: Bu adım laminar akış başlığı dışında yapılabilir. Tüm takip eden aşamalar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
   5. % 70 EtOH ile 50 ml konik tüp dışında dezenfekte edin ve koyunsterilize kaput o.
   6. 20 kez hız 3 ml / sn pipetleme ile otomatik pipet kullanarak öğütün dokular. Doku kalıntısı 70 um hücre süzgeç ile süpernatant 3 dakika dinlendirilir ve filtre için izin verin.
      Not: A normal boyut 10 ml pipet toz haline getirme için kullanılabilir.
   7. Kalan doku kümeleri ve trituratının için Leibovitz L-15 5 ml ekleyin ve tekrar süpernatant filtre. Leibovitz L-15, 2 ml hücre süzgeç yıkayın.
   8. Kolajenaz kısmen bozulmuş kolajen sindirimi izin 60 dakika - 20 için bir başlık olarak, süzüldü hücre çözeltisi yerleştirin.
   9. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. ,% 10 FBS ve yüksek konsantrasyon P / S (20 U / ml) ihtiva eden DMEM, 20 ml hücrelerin yeniden askıya.
   10. Kardiyomiyosit seçim için 37 ˚ ° C'de _CO2 inkübatörü içinde, 1 saat boyunca iki adet 10 cm plastik hücre kültürü tabakları üzerine, ön plaka hücreleri. NOT: Fibroblastlar kardiomyositlerindeki daha yemeğin altına daha kolay eklemek.
   11. WhIle bekleme, DMEM,% 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren hazırlar. % 10 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM içinde 325 ml 10 mg / ml 1 ml BrdU ekleme
   12. Nazikçe yemekleri girdap ve iki adet 10 cm yemekleri kardiyomyosit içeren süpernatant toplamak.
       NOT: Çoğu kardiyomiyositlerde hala inkübasyondan 1 saat sonra yüzer yüzen olacaktır. Hafifçe çanak bağlı olan fibroblast ile kirlenmesini önlemek için, pipetleme süpernatantı toplamak yok.
   13. İsteğe bağlı> hücre canlılığı kontrol etmek için tripan mavisi ile ve% 0.2 olmadan yüzer hücreleri sayın.
   14. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. % 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM içinde hücrelerin yeniden askıya. Mikroskop kullanarak gözlem için jelatin kaplı 3.5 cm cam alt yemekler 2 x 10 ⁵ hücre / tabak plaka hücreleri. NOT: 37 ˚ C'de CO ₂ inkübatör en az 24 saat boyunca kaplama sonra hücrelerin rahatsız etmeyin
   15. Gün 3, ChaNGE ortamı, 24 saat,% 5 FBS, P / S ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM / MEM için kaplama sonrası.
   16. Gün 4,% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM sonra kaplama ortamı 48 saat değiştirme
       NOT:% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM ile her 2-3 günde bir ortam değiştirme

2.. Lentiviral transdüksiyon

1. Lentiviral plasmidlerin ambalajlama
   NOT: Bu konu ^24-26 hakkında daha derinlemesine bilgi için başka kaynaklara başvurun. Bu Lentiviral çözeltisi hazırlamak için yaklaşık 3 gün sürecek. Daha yüksek transdüksiyon etkinliğini elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir. Lentiviral plasmidler ve paralel olarak neonatal sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonun paketleme başlatın. Bunun yerine lentiviral plasmidlerin paketlenmesi için polietilenimin (PEI) ²⁷ kullanmak yerine, bir ticari olarak temin edilebilir transfeksiyon reaktifi kullanılabilir. Üreticisinin talimatlarına uyun.
   1. Reaktifler ve araçları hazırlamak; HEK293T hücreleri, 10 cm Plastik hücre kültürü kapları, lentiviral plasmid çözeltiler (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral transfer vektörü, 1.0 mg / ml her biri), 1 g / l PEI, serum içermeyen ortam, 20 mM % 70 EtOH içinde suda klorokin,% 10 ağartma maddesi,% 1 SDS
   2. Gün 0, 10 cm başına 2-2.5 x 10 ⁶ HEK 293T hücreleri transfeksiyondan bir gün önce çanak Plate.
      NOT: transfeksiyondan% 30-60 izdiham uygunudur.
   3. Gün 1, PEI transfeksiyon solüsyonu hazırlanması. Bir 1.5 ml bir tüp içinde 960 ul serumsuz ortama 1 g / l PEI 30 ul ekle. 1.5 ml tüp içinde PEI transfeksiyon çözelti içine 4 plazmidler ekleyin ve dokunarak ile karıştırın.

   Plasmid Adı	Not	Boyut (KBP)	hacmi eklenmiş (ml)	10 cm çanak Final miktarı (mg)	10 cm çanak (PM) nihai konsantrasyonu
   Lentiviral transfer vektörü	paketlenecek olan geni kodlayan	9-13	3,6-5,2	3,6-5,2	60
   pMDLg / pRRE	HIV-1, gag / pol ifade	8.8	1.76	1.76	30
   pRSV-Rev	HIV-1 ifade eden REV	4.1	0.82	0.82	30
   pMD2.G	VSV G ifade	5.8	1.16	1.16	30

   Tablo 2:. Lentiviral ambalaj plasmidlerin miktarı 10 cm tabaklarda HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu için, bu plazmid miktarda kullanın. Tabak başına lentiviral transfer vektörü nihai miktarı, boyutuna göre farklılık 60 uM'de tabak başına son konsantrasyon muhafaza edebilir. Çift şeritli DNA, bir baz çiftinin ortalama moleküler ağırlığı 660 daltondur.

   2. Eski orta atınyavaşça 10 cm HEK 293T hücreleri tabak ve yeni ortamın 9 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS, P / S olmadan).
   3. PEI-DNA karışımını ekleyin, yavaşça tabağa-bilge bırakın ve yavaşça orta ile karıştırın girdap. 10 ml ortama 20 mM klorokin'e (nihai 20 uM), 10 ul ekle. Not: Chloroquine lızozomal bölmeleri ²⁸ içindeki pH kısmi nötrleştirilmesi ile plasmid ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden bozulmasını azaltmak için düşünülmektedir.
   4. 6 saat boyunca 37 ° C'de ˚ _CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir. Daha sonra, PEI-DNA karışımını ihtiva eden orta kaldırmak ve yeni ortamı 10 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS + 20 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 + P / S) . Not: inkübasyondan sonra, virüs ortamında üretilecektir. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile potansiyel kirlenmiş ekipman,ya da. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.
   5. Gün 2-3, CO Ġnkübasyon 48-72 saat. 4. Gün boyunca 37 ˚ C'de ₂ inkübatör, lentiviral çözüm (Bölüm 2.2 devam) toplamak.
      NOT: Orta transfeksiyonundan sonra 48 saat değiştirilebilir. Iki virüs süpernatant 48 saat ve 72 saat Toplama yüksek titresi virüs çözümleri elde etmek için elde edebilir.
2. Lentiviral çözeltisi ve transdüksiyon toplanması
   1. Reaktif ve araçları hazırlayın: 15 ml konik tüpler, 1 M HEPES, pH 7.4 (0.22 um süzülmüş)
   2. 4. gün, Luer-Lok şırınga steril 10 ml lentivirüs parçacıklar (lentiviral çözelti) ihtiva eden supernatant toplamak, daha sonra 0.45 um filtre süpernatan, bir 15 mL konik tüp içine filtre. Süzüldü lentiviral çözelti (son 10 mM) ve 1 M HEPES pH 7.4 içinde 1/100 hacim.
      NOT: filtreleme için, sadece selüloz ace kullanınTate veya polietersülfon (PES) (düşük protein bağlama) filtreler. Nitroselüloz filtre kullanmayın. Nitroselüloz Lentiviral zarfın yüzey proteinleri bağlanır ve virüs yok.
   3. Bölüm 1.2 son aşamasında elde edilen sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 3.5 cm yemekler, orta çıkarın, 3,5 cm çanak süzülmüş Lentiviral solüsyonu 1 ml ekleyin.
   4. Heksadimetrin bromit (nihai konsantrasyon 4-6 ug / ml) ilave .
      NOT: Heksadimetrin bromür Lentiviral transdüksiyon etkinliğini artırabilir. Heksadimetrin bromür konsantrasyonu optimize edilmelidir.
   5. Lentiviral transdüksiyon boyunca 37 ° C'de ˚ _CO2 inkübatörü içinde 6 saat boyunca inkübe çanak, sonra% 5 FBS ve P / S ihtiva eden yeni bir DMEM / MEM için orta değiştirmek 3 gün boyunca 37 ° C'de ˚ _CO2 inkübatöründe inkübe çanak.
      Not: lentivirüs ile konakçı genom içine egzojen genin entegrasyonu 72 saat tamamlanması olarak kabul edilir.
   7. Gün 7, bir sonraki aşama için adım 2.2.5 hücreleri kullanın. Not: lentiviral plazmidinden protein sentezleme göreli ekspresyon seviyesini belirlemek amacıyla transdüksiyonunun 48-72 saat sonra WB imünosito kimyasal olarak ya da (ICH) tarafından teyit edilebilir (Şekil 1a ve 1b).
3. Lentiviral çözeltisinin konsantrasyonu
   NOT: Bu lentıvıral çözüm titre yeterince yüksek değilse bu durumda, en yüksek iletim verimliliği elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir, lentiviral solüsyon polietilen glikol (PEG) çöktürme ²⁹ konsantre edilebilir.
   1. 4x PEG çözeltisi (% 32 PEG6000, 400 mM sodyum klorür (NaCl), 40 mM HEPES pH 7.4) Hazırlanması
      1. 4x 125 ml PEG çözeltisi için, PEG6000, 40 g ağırlığında daha sonra 60 ml su içinde çözülür.
         Not: Not: (. Örneğin PEG6000, Ortalama molekül ağırlığı 6000 olan) PEG sonra sayısı ortalama molekül ağırlığıdır
         NOT: 2.3.1.2) yavaş yavaş 10 ml ekleyin5 M NaCl. Yavaş yavaş 1 M HEPES pH 7.4, 5 ml ekleyin. 2 M sodyum hidroksit kullanılarak pH 7.4 'e ayarlayın.
         NOT: 2.3.1.3) 125 ml su ekleyin. Bir 0.22 um filtre ile membran filtrasyonu ile 4x PEG solüsyonu sterilize ve 4 ˚ C'de saklayın
   2. Lentivirüstür konsantrasyonu
      1. Filtre lentiviral, 0.45 um filtre kullanılarak yeni bir 50 ml tüp içine süpernatant kalıt.
         NOT: yüzer = 01:03): 2.3.2.2) 4x PEG çözüme 01:03 oranını (PEG çözüm ekleyin. 16-48 saat boyunca 4 ˚ C'de saklayın.
         Not: 30 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de 2.3.2.3) santrifüjleyin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de santrifüj süpernatan ve atın.
         NOT: 2.3.2.4) pelet rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde süpernatant atın. Yeniden askıya 1/2, orijinal süpernatan hacminin 1/25 hacme kadar kullanılarak serum barındırmayan ortam içinde pelet.
         NOT: 2.3.2.5) doğrudan kullanın ya da daha sonra -80 ˚ C'de saklamak sıvı azot kullanılarak dondurmak

3.. Adenoviral iletimi

Not: adenoviral yapıların ¹³ inşası ve yayılması için yöntemler için diğer kaynaklara bakınız. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve potansiyel bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile ekipmanları kirlenmiş. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.

1. % 50 doku kültürü enfeksiyon dozu ile Adenoviral titrasyon _(TCID50)
   NOT: transdüksiyon önce, adenoviral stok solüsyonu titre etmek için gereklidir. _TCID50 viral titre etmek için en iyi yöntemlerden biridir. Yöntem _TCID50 hesaplanan HEK 293T hücrelerine bulaşıcı bir kapasite, bir titre değerlendirir için adenovirüs stoklar gerçek Bulaşabilirliği yansıtır. PFU (plak oluşturucu units) yaklaşık 0.56 bir ³⁰ faktörü ile TCID ₅₀ ile orantılıdır.
   1. HEK 293T hücreleri, 10 cm hücre kültür kapları, 96-gözlü düz dipli hücre kültürü plakası, 8 kanallı pipet multi: hücreleri ve araçları hazırlanması
   2. 10 cm çanak 70-90% Konfluent HEK 293T hücreleri hazırlayın.
   3. Virüs stokunun 1/10 ⁴ bir ön seyreltme gerçekleştirin. Bir 96-gözenekli düz tabanlı hücre kültürü plakasının her oyuğuna DMEM +% 10 FBS, 50 ul ekle. A'dan H., ilk satırda içine önceden seyreltilmiş virüs stokunun 25 ul ekle
   4. İyice karıştırın ve 8-kanallı multi pipet ile ikinci satıra kuyu ilk satırdan 25 ul aktarın. 1/3 kadar kuyuların her satır için viral çözelti seyreltme ve 11. satırda dahil olmak üzere tekrarlayın ve son 25 ul atın.
   5. Öğütün HEK 293T DMEM +% 10 FBS içinde 10 ml hücre. 1 ile 12 arasındaki sıralarındaki her bir hücre içine çözeltisinin 50 ul ekle.
   6. 11-13 gün boyunca CO2 inkübatöründe 37 ° C'de ˚ hücreleri inkübe edin. DMEM + 1, 50 ul ekle4-5 gün ve kaplama 7-8 gün sonra% 0 FBS.
   7. Enfeksiyondan sonra 11-13 gün sonra, her oyuktaki sitopatik etkiler ölçün.

   şerit

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Satır A

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır B

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır C

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır D

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır D

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır F

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Satır G

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Sıra H

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   satır başına pozitif kuyu sayısı

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   6

   5

   2

   2

   0

   satır başına pozitif olan kaynaklar oranının

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   0.75

   0.63

   0.25

   0.25

   0

   d	% 50 Sitopatik etkileri üzerinde gösteriliyor
   	% 50 ya da hiç Sitopatik etkileri altında gösteriliyor

   Şerit 1, ¹ seyreltme 3 x10 ^4; şerit 2, seyreltme 3 ² x10 ^4; ...; şerit 11, seyreltme 3 ² x10 ^11; Şerit 12, kontrol.
   S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
   = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8.875
   TCID ₅₀ = 3 x 10 ⁴ x 3 x (8,875-0,5) = 2.97 x 10 ⁸
   _TCID50 / ml = 5.94 x 10 ⁹

   Tablo 3:. Enfekte olmuş bir 96 well-levha 10 gün inkübe edildikten sonra her bir hazne içinde sitopatik etkisini ölçmek ve sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı örneği.

   8. Kaerber ait formüle uygun olarak titreyi hesaplamak ^31.
   9. _TCID50 = (ilk şerit seyreltme) x (seyreltme) ^(S-0.5)
   10. S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
       NOT: Bu protokol için, TCID ₅₀ = (30000) x (3) ^(S-0.5). Viral çözeltisi 50 ul Bu protokolde kullanıldığı için, _TCID50 / ml hesaplamak için 0.05 _TCID50 ile bölün.
2. Adenoviral transdüksiyon
   1. Kendi titresi (PFU / ml, ya da _TCID50 / ml viral partikül /) için adenoviral çözeltinin gerekli miktarı hesaplanır. MOI (enfeksiyon çokluğu) hesaplamak için formül kullanın.
   2. em> [buraya yerleştirin Tablo 4]
   3. Serumsuz ortama virüs çözeltisi hesaplanan miktarını ekleyin (bkz. Tablo 5). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
   4. em> [Burada Yeri Tablo 5]
   5. Day7, Bölüm 2.2 son aşamasında elde edilen çanak alın ve% 5 FBS ve P / S içeren yeni DMEM / MEM 750 ul ile orta yerine
      Not: orta hacminorijinal hacminin yaklaşık% 50 transdüksiyon yüksek transdüksiyon verimliliği için çok önemlidir.
   6. Çanak seyreltilmiş virüs solüsyonu ekleyin. 37 ˚ C'de _CO2 inkübatör içinde 4-8 saat inkübe çanak Daha sonra, taze ortam ile değiştirin.
   7. 37 ˚ C'de _CO2 inkübatör 24-48 saat boyunca inkübe çanak Gün, 8-9 de, canlı hücre görüntüleme deneyi için hücreler kullanın. Not: adenoviral plazmidinden protein sentezleme göreli protein ekspresyon seviyesi (Şekil 1c ve 1d) belirlemek amacıyla transdüksiyon 24-48 saat sonra WB veya ICH ile teyit edilebilir.

4. Canlı hücre görüntüleme

1. Sıcaklık kontrollü bir oda ile bir konfokal dönen disk mikroskop ve CO ₂ çevre sistemi (isteğe bağlı) kullanarak görüntü elde etme
   1. Tüm cihazlar önce satın başlamasından 37 ˚ ° C'ye kadar dengeye, böylece önceden satın alınması, en az 1 saat üzerindeki sıcaklık kontrol sistemi getirin. Confoc açınal diski mikroskop sistemi (PC operasyon için, mikroskop, dönen disk ünitesi, CCD kamera, lazerler, floresan ışık kaynağı, normal ışık kaynağı, motorlu sahne ve otomatik kepenkler) iplik.
      NOT: Daha fazla 1 saat tüm cihazların tam sıcaklığı dengeye ulaşmak için gereklidir.
   2. Gerekirse, edinimi için istenen ortama 3,5 cm cam alt yemekler orta değiştirin. Sıcaklık kontrollü odasında konfokal dönen disk mikroskop sahnede çanak yerleştirin.
      NOT: nedeniyle No 1.5 cam kapak ile 3.5 cm cam alt çanak (yaklaşık 0,16-0,19 mm kalınlık) mikroskopi kullanılarak optimum gözlem için küresel sapmaları idealdir. Kullanılan amacı, düzeltme yaka varsa, 0.17 mm'den daha kalındır örtücü camları elde görsel düzeltilebilir. Ayrıca, Fenol kırmızı hafif bir floresan var. Bazen fenol kırmızısı olmadan bu DMEM gibi bir fenol kırmızı içermeyen ortam, kullanımı tercih edilir. CO denetlemek için bir cihaz varsa 2 konsantrasyonu, onu kullanmak daha iyidir bir CO ₂ bağımsız uzun vadeli time-lapse görüntüleme için HEPES'e tarafından tamponlu, orta ya da orta.
   3. Okülerlerinde ışık yolu seçin.
   4. Üzerinde parlak bir alan ışık kaynağının deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında hücrelere odağı ayarlayın. Aydınlık alan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
   5. Üzerinde floresan ışık kaynağı için deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında floresan proteinleri ifade eden hücrelerin bulun. Floresan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
   6. İsteğe> Basın time-lapse edinimi sırasında sabit odak tutmak için üzerinde mükemmel odaklama sistemi açmak için mikroskop önünde mükemmel odaklama sistemi için aktivasyon düğmesine basın.
   7. Dönen bir disk konfokal mikroskop ışık yolu değiştirin. Uygun görüntüler displa kontrol, işletim yazılımı kullanarak edinimi için ayarlarınıEkranda yed. (Örneğin Odak, lazer güç, etki süresi, CCD kamera kazanç ve off-set)
   8. Işletim yazılımı kullanılarak floresan görüntü elde etmek için set ayarları. Örnek: Kanal biri için EGFP'nin floresan sinyali elde etmek: "ışık yolları kullanarak kanal değiştirme" ve "EGFP Kanal 1" seçeneğini seçin.
   9. Işletim yazılımı kullanarak zaman atlamalı görüntü almak için time-lapse ayarlarını yapılandırarak zaman noktaları arasındaki frekansı ayarlayın. Örnek: Bir zaman noktasını her 5 dakikada kazanmak için, açılan menüden "Time-noktası başına Dakika" seçeneğini seçin ve metin alanına 5 girin.
      NOT: gerçek hızda bir film yapmak için "Maksimum Hız" seçeneğini seçin. Floresan protein ifadesi düşükse, floresan time-lapse edinimi sırasında hızlı beyazlatabilir. Bu durumda, bu satın alma zaman noktalarının sayısını azaltmak için daha iyidir.
   10. "Sta tıklayarak time-lapse satın alma başlayınBir görüntü dizisini elde etmek rt "düğmesine basın.
       NOT: Birden fazla puan toplama işlevini kullanmak daha iyi değil. Bu time-lapse görüntüleme sırasında görüntüleme alanında odak veya hareket kaybına neden olabilir.
2. Alınan görüntülerin Analizi
   NOT: Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır ve analiz yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
   1. Bir filmde dahil edilecek edinilen görüntüleri seçin. Gerekirse, kırpma görüntüleri ilgi bölgeleri ve işletim yazılımı kullanarak filmin dosya boyutunu azaltmak için ilginç bir zaman-noktalarını seçin.
   2. Bir AVI film dosyasına veya MOV formatında İhracat görüntüler. "Format" açılır menüsünden ve bitmiş film için gerekli zamanlama bir film biçimini seçin, ardından "Export" tıklayın. NOT: Her 5 dakikada gerçek hızdan 3.000 kat daha hızlı saniyede 10 kare, bir film olarak geri çalınabilir bir zaman noktasında edinilen Time-lapse görüntüleri.

Sonuçlar

Teknik, lentivirüs encoding EGFP (gelişmiş yeşil floresan protein)-etiketli Cx43 (Connexin43) veya hücrelerde EGFP-etiketli proteinleri ifade etmek için kullanılan bir mutasyona uğramış Cx43 ³² ve bir adenovirüs kodlama FGFR1DN (fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 baskın negatif açıklamak için ) hücrede ^33-35 FGF sinyalizasyon kapatmaya kullanıldı. Kardiyomiyositlerde izolasyonu, aşağıdaki üç gün, izole edilmiş kardiyomiyositlerde hücrelerinde EGFP-etiketli protein...

Tartışmalar

Neonatal sıçan izole edilmiş primer kardiyomiyositlerde uzun in vitro kardiyomiyosit fonksiyonlarını incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, ilk olarak 4 ° C'de tripsin O / N ile sindirerek ve daha sonra saflaştırılmış kolajenaz, iki aşamalı bir enzim sindirimi yöntemi kullanılarak sıçan yavrularından neonatal kardiyomiyositlerde izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Saflaştırılmış kolajenaz adımı kullanarak bir avantajı enzim aynı sınıf tüm izolasyon için kullanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 scissors for decapitation	WPI	501749	Autoclave before use
1 fine scissors for heart isolation and chopping	WPI	14393	Autoclave before use
2 fine forceps (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave before use
Three sterilized 10 cm plastic dishes	Sigma	CLS430165	for hearts isolation
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C	for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0.17-14-C	for TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70 % (v/v) in water	Sigma	E7148
2% gelatin	Sigma	G1393
One sterilized 10 cm plastic dish	Sigma	CLS430165	for trypsinization
Aluminium foil	any brand
parafilm	Sigma	P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish	Sigma	CLS430165	for selection
Auto pipette	Drummond Scientific	4-000-300	for trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter	nexcelom		to check and count cells
Microscope and Hematocytometer	any brand		to check and count cells
Trypan Blue Solution, 0.4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubator	Sanyo	MCO-19AIC
incubating orbital shaker	Sigma	Z673129	to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution	BD Pharmingen	550891
DMEM, High Glucose	invitrogen	41965039	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM	invitrogen	31095029	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal Bovine Serum	invitrogen	26140079
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	invitrogen	15140-122
Section 2 lentiviral transduction
three packaging plasmids
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (serum-free medium)	invitrogen	31985070
transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)	Polysciences	24765-2	It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substitute for PEI as transfection reagent
chloroquine	Sigma	C6628	dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES	Sigma	H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized	BD	309604
0.45 um filters	Sigma	F8677	use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
polyethylene glicol 6000	Sigma	81260
Sodium chloride	Sigma	S9888
sodium hydroxide	Sigma	S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes	Sigma	CLS430165
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile	BD Falcon	353072	for titration
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel	eppendorf	3122 000.035
Section 4 live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy	PerkinElmer	L7267000
a temperature controlled chamber	any brand		to keep temperature at 37 C
a CO2 environmental system	any brand		optional to maintain CO2 concentration optimal
Medium
CO2 Independent Medium, No Glutamine	invitrogen	18045-054	for long time time-lapse imaging
DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red	invitrogen	21063-029	for long time time-lapse imaging