Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Resumen

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Resumen

Primarios de rata cardiomiocitos neonatales son útiles en básica en la investigación cardiovascular in vitro, ya que pueden ser fácilmente aislados en grandes cantidades en un único procedimiento. Debido a los avances en la tecnología de microscopio que es relativamente fácil de capturar imágenes de células vivas con el fin de investigar los eventos celulares en tiempo real con una mínima preocupación con respecto a la fototoxicidad a las células. Este protocolo se describe cómo tomar imágenes timelapse células vivas de rata primaria cardiomiocitos neonatales con un microscopio confocal de disco giratorio tras la transducción lentiviral y adenoviral para modular las propiedades de la célula. La aplicación de dos tipos diferentes de virus hace que sea más fácil de conseguir que la tasa de expresión y la transducción de los niveles adecuados de dos genes diferentes. Imágenes de células vivas bien enfocadas pueden ser obtenidos usando el sistema de enfoque automático del microscopio, que mantiene el enfoque estable durante largos períodos de tiempo. La aplicación de este método, las funciones del ingeniero exógenamenteproteínas ed expresadas en células primarias cultivadas pueden ser analizados. Además, este sistema puede ser usado para examinar las funciones de los genes a través del uso de siRNAs, así como de los moduladores químicos.

Introducción

De rata cardiomiocitos neonatales primarios han sido utilizados para investigar la función de los cardiomiocitos in vitro ^1. Son fáciles de aislar de las crías de rata por varios métodos bien establecidos ^2-4. El método más común emplea colagenasa o tripsina para digerir tejido conectivo del corazón antes del aislamiento celular. Los investigadores también han desarrollado métodos para aislar los cardiomiocitos de los roedores adultos ^5-8, así como los ratones neonatales ^9,10.

Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos a partir de crías de rata neonatales, el empleo de un procedimiento de digestión de la enzima de dos pasos. La tripsina se utilizó por primera vez O / N a 4 ° C, y luego colagenasa purificada a 37 º C. La incubación del tejido del corazón con tripsina O / N a 4 ° C reduce las medidas necesarias para las células de la cosecha en comparación con los métodos que utilizan las incubaciones secuenciales en una solución de enzima caliente ^2. Además, mediante el uso de co purificadallagenase en lugar de las enzimas del crudo, la variabilidad de lote a lote puede ser eliminado, lo que proporciona una mayor reproducibilidad.

Los estudios funcionales de una proteína particular, a menudo emplean un sistema de expresión de proteínas utilizando un adenovirus ^11-13 y / o un lentivirus ^14-16. [NOTA DE ADVERTENCIA] La producción viral y la manipulación deben llevarse a cabo de acuerdo con las directrices del NIH.

El adenovirus no se integra en el genoma del huésped. Tiene una muy alta eficiencia de transducción en la mayoría de tipos de células, incluyendo células que se dividen y células que no se dividen, así como células primarias y líneas celulares establecidas. Esto hace que el adenovirus de un vector fiable para la expresión génica. Los altos niveles de la proteína codificada por el vector de adenovirus se desarrollan dentro de 48 horas después de la transducción, y pueden durar varias semanas ^17. Sin embargo, un inconveniente a la utilización de un adenovirus para la expresión de proteínas es que el desarrollo de un ADE recombinantenovirus es complicado y lleva mucho tiempo. Este inconveniente se explica en parte por qué muchos investigadores han acudido a los lentivirus para la expresión de genes recombinantes. A diferencia de las construcciones adenovirales, generando un constructo lentiviral que es rápida y fácil. Aunque lentivirus generalmente tienen una menor eficiencia de la transducción de adenovirus que, en ambas células que se dividen y que no se dividen, que no integrarse en el genoma del huésped. En consecuencia, la expresión del gen transducido es más estable para los lentivirus que para adenovirus.

Debido a los avances tecnológicos en el campo de la microscopía, es mucho más fácil para capturar imágenes de células vivas de las células que expresan proteínas recombinantes. Esto es cierto incluso a velocidades de tasa de vídeo de adquisición. Esto permite que el investigador para determinar cómo las alteraciones particulares en la proteína de interés funcionalmente impactan la célula en tiempo real. El microscopio confocal de disco giratorio tiene varias características clave que hacen que sea una técnica óptima para livde formación de imágenes e celular ^18,19. El disco giratorio Yokogawa permite la adquisición de imágenes mucho más rápido, mientras que al mismo tiempo la utilización de mucha menos energía de láser que los microscopios confocales de barrido punto. Ambas características especiales se deben a la disco giratorio, que contiene numerosos agujeros confocal a través del cual el láser pasa simultáneamente a las muestras. Durante la adquisición, el propio disco gira rápida y continuamente ^18-20. Al utilizar el sistema de enfoque automático del microscopio, el enfoque estable se mantiene durante largos períodos de tiempo. Esto permite a los investigadores a tomar imágenes de células vivas bien enfocadas. Las imágenes adquiridas se reproducen como un archivo de película. Las imágenes se analizaron utilizando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ ^21,22, FIYI ^23, u otro software disponible comercialmente.

Protocolo

1. Aislamiento de cardiomiocitos neonatales de rata

1. Utilice medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) y penicilina / estreptomicina (P / S) como el medio de cultivo. Añadir bromodesoxiuridina (BrdU) al medio para prevenir el crecimiento de fibroblastos durante los primeros 2 días después del aislamiento.

	Medio base	FBS	BrdU (mM)	P / S (U / ml)
selección	DMEM	10%	0	20
El primer día	DMEM	10%	0.1	10
Al día siguiente	DMEM / MEM	5%	0.1	10
Además cultura	DMEM / MEM	5%	0	10

Tabla 1:. Medio para ratas cardiomiocitos neonatales Utilizar este medio para el cultivo de cardiomiocitos de ratas neonatales. DMEM / MEM es una mezcla 1:1 de DMEM y medio MEM.

1. El aislamiento de los cardiomiocitos, Día 1 (tiempo requerido estimado, alrededor de 1 hora)
   NOTA: Para el trabajo con los roedores neonatales, consultar las guías universitarias locales y las normas establecidas por los programas de cuidado de los animales, y se adhieren a los animales protocolos aprobados institucionalmente. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité del Centro de Recursos Animales de Yale Institucional Cuidado de Animales y el uso.
   1. Preparar los reactivos y herramientas: solución salina equilibrada de calcio y magnesio, libre de Hank (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, en hielo; 1 mg de tripsina, se reconstituye con 2 ml de HBSS CMF, en el hielo; herramientas en autoclave; 70% de etanol (EtOH) en 250 ml vaso de precipitados; cuatro esterilizar placas de plástico de 10 cm, tres para el aislamiento de corazones y uno para tripsinización.
   2. Orden 1 litter de crías de rata de 1 a 2 días de edad (unos 10 cachorros) con su presa de un distribuidor de animales de experimentación.
   3. Día 1, Transfer cachorros a pequeña jaula y eutanasia presa con un cóctel de ketamina / xilazina (ketamina, 200ml/10g y 20ml/10g xilazina) sobredosis.
   4. Tome una cría y esterilizar la totalidad de su cuerpo con EtOH al 70%. Decapita a las crías con tijeras quirúrgicas agudas en buen estado en un plato de plástico de 10 cm esterilizada en un lugar aislado de otros cachorros.
      NOTA: Con el fin de recoger las muestras tan pronto como sea posible, lo mejor es utilizar el método más rápido y eficaz para poner fin a la vida de los roedores. Decapitación cuando es utilizado por profesionales cualificados con equipo en buen estado puede resultar en menos temor y ansiedad para el animal y ser más rápido y práctico que otras formas de eutanasia. Es consistente con las recomendaciones de las Guías de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria para la Eutanasia de los Animales.
   5. Retire paliza que learte con herramientas esterilizadas, y poner el corazón en 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS en 50 ml tubo cónico. NOTA: Quite el corazón lo más rápido posible y ponerlos en hielo inmediatamente. Después de quitar el corazón desde el cuerpo, todos los procedimientos se deben realizar en hielo.
   6. Recoger 5 corazones en 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS y los 5 corazones restantes en otros 30 ml de hielo enfriado CMF HBSS. Agitar el tubo para enjuagar los corazones. NOTA: Después de este paso, realice todos los procedimientos en una campana de flujo laminar.
   7. Descartar el sobrenadante y transferir los corazones a una nueva fuente de plástico esterilizado 10 cm en el hielo. NOTA: Tenga cuidado de no aspirar los corazones con el aspirador.
   8. Retire los grandes vasos y / o tejidos no deseados. Añadir 10 ml de hielo enfriado CMF HBSS al plato para enjuagar los corazones.
   9. Transfiera todos los corazones a una nueva fuente de plástico esterilizado 10 cm en el hielo. Picar los corazones con tijeras a menos de 1 mm ³ en hielo.
   10. Añadir 9 ml de HBSS frío CMF. Añadir 1 ml de tripsina reconstituido refrigeradotuido con CMF HBSS (final de 50 ug / ml).
   11. Sellar la placa con parafilm y se cubre con papel de aluminio, luego se coloca en la cámara fría (4 ˚ C) durante la noche.
2. El aislamiento de los cardiomiocitos, Día 2 (tiempo requerido estimado, alrededor de 4 horas)
   1. Preparar reactivos y herramientas: 50 ml cónico tubo x 2; 2 mg de inhibidor de tripsina, se reconstituye con 1 ml de HBSS CMF, en el hielo; 1.500 unidades de colagenasa, reconstituido con 5 ml de Leibovitz L-15, a temperatura ambiente (TA); Leibovitz L-15, se reconstituye con 1 litro de agua esterilizada y se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, 8 ml a RT; 10 mg / ml (32,6 mM) de BrdU en agua; P / S; DMEM + 10% de FBS; MEM; dos placas de cultivo celular de plástico de 10 cm; Platos inferior 3,5 cm de vidrio.
   2. Día 2, Preparación de platos recubiertos con gelatina. Añadir 1 ml de solución de gelatina al 0,1% para recubrir un plato inferior 3,5 cm de vidrio para un experimento de formación de imágenes. Incubar los platos a 37 ˚ C durante varias horas, y luego aspirar y descartar la solución de gelatina antes de su uso.
      NOTE: Un plato inferior 3,5 cm de vidrio es adecuado para un experimento de formación de imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Para la extracción de proteínas a partir de cardiomiocitos primarios para detectar la expresión de proteínas por transferencia de Western (WB), se pueden usar 0,1% de gelatina recubiertas placas de plástico de cultivo de células.
   3. Transferir todo el tejido cardíaco digerido por la tripsina durante la noche con tampón a un tubo cónico de 50 ml en hielo en la campana esterilizada. Añadir 1 ml de inhibidor de tripsina en CMF HBSS (final de 182 ug / ml). Cierre la tapa del tubo cónico de 50 ml herméticamente para evitar la contaminación.
   4. Incubar el tubo durante unos 30 min en una incubadora a 37 ˚ C para calentar el tejido y el tampón de 30 a 37 ˚ C. Añadir 5 ml de colagenasa en Leibovitz L-15 (final de 94 unidades / ml). Se incuba a 37 ˚ C durante 45 minutos con agitación suave (170-200 rpm agitador en el 37 ˚ C incubadora).
      NOTA: Este paso se puede hacer fuera de la campana de flujo laminar. Todas las etapas posteriores se deben realizar a temperatura ambiente.
   5. Desinfectar el exterior de un tubo cónico de 50 ml con 70% de EtOH y poneren la campana esterilizada.
   6. Tejidos tritura utilizando una pipeta automática con pipeta a 3 ml / seg de velocidad de 20 veces. Permita que los residuos de tejido se asiente durante 3 min y filtrar el sobrenadante con un filtro de células de 70 um.
      NOTA: Un ml pipeta de tamaño regular 10 puede ser utilizado para la trituración.
   7. Añadir 5 ml de la Leibovitz L-15 a los grupos de tejidos restantes y el residuo se tritura y se filtra el sobrenadante de nuevo. Lavar filtro de células con 2 ml de la Leibovitz L-15.
   8. Coloque la solución celular filtrado en una campana durante 20 - 60 min para permitir la colagenasa para digerir el colágeno parcialmente degradado.
   9. Células sedimento en 100 x g durante 5 min. Volver a suspender las células en 20 ml de DMEM que contiene 10% de FBS y alta concentración de P / S (20 U / ml).
   10. Células Pre-placas en dos de plástico placas de cultivo celular de 10 cm durante 1 hora en CO ₂ incubadora a 37 ˚ C para la selección de los cardiomiocitos. NOTA: Los fibroblastos se adhieren más fácilmente a la parte inferior del plato de cardiomiocitos.
   11. Whde espera Ile, preparar DMEM que contenía 10% de FBS, P / S (10 U / ml) y 0,1 mM de BrdU. Añadir 1 ml de 10 mg / ml de BrdU a 325 ml de DMEM que contenía FBS al 10% y P / S.
   12. Agitar suavemente platos y recoger el sobrenadante que contiene los cardiomiocitos a partir de dos placas de 10 cm.
       NOTA: La mayoría de los cardiomiocitos se seguirán flotando en el sobrenadante después de 1 h de incubación. Para evitar la contaminación con fibroblastos que están ligeramente unidas a la placa, no recoger el sobrenadante por pipeteo.
   13. Opcional> Contar las células en el sobrenadante con y sin 0,2% de azul de tripano para comprobar la viabilidad celular.
   14. Células sedimento en 100 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en DMEM que contiene 10% de SFB, P / S (10 U / ml) y 0,1 mM BrdU. Las células de placas a 2 x 10 ⁵ células / placa en placas de fondo 3.5 cm de vidrio recubiertos de gelatina para la observación mediante el microscopio. NOTA: No perturbar las células después de la siembra durante al menos 24 horas en el incubador de _CO2 a 37 ˚ C.
   15. Día 3, Change medianas 24 horas después de la siembra a DMEM / MEM que contiene 5% de FBS, P / S y 0,1 mM BrdU.
   16. Día 4, cambio de medio de 48 horas después de la siembra de DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.
       NOTA: Cambie medio cada 2-3 días con DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.

2. Transducción lentiviral

1. Embalaje de plásmidos lentivirales
   NOTA: Por favor consulte otras fuentes para obtener más información en profundidad sobre este tema ^24-26. Tomará cerca de 3 días para preparar la solución lentiviral. Lo mejor es utilizar la solución lentiviral fresca para lograr una mayor eficacia de la transducción. Inicie el embalaje de los plásmidos lentiviral y el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales de rata en paralelo. En lugar de utilizar polietilenimina (PEI) ²⁷ para el embalaje de los plásmidos lentiviral, un reactivo de transfección comercialmente disponible se puede utilizar. Siga las instrucciones del fabricante.
   1. Preparar reactivos y herramientas; HEK293T, 10 cm de plástico placas de cultivo celular, soluciones de plásmido lentiviral (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, vector lentiviral transferencia, 1,0 mg / ml cada una), 1 g / l de PEI, medio libre de suero, 20 mM cloroquina en el agua, el 10% del blanqueo, 1% SDS en EtOH al 70%
   2. Día 0, mural 2-2,5 x 10 ⁶ células HEK 293T por placa de 10 cm el día antes de la transfección.
      NOTA: 30-60% de confluencia en la transfección es óptima.
   3. Día 1, Preparación de solución de transfección PEI. Añadir 30 ul de 1 g / l de PEI a 960 medio libre de suero ul en un tubo de 1,5 ml. Añadir 4 plásmidos en la solución de transfección PEI en el tubo de 1,5 ml, y mezclar con el tapping.

   Nombre del plásmido	Nota	Tamaño (kpb)	más volumen (ml)	Importe final en placa de 10 cm (mg)	La concentración final en placa de 10 cm (pM)
   Vector de transferencia de Lentiviral	gen codifica a ser empaquetado	9-13	03.06 a 05.02	03.06 a 05.02	60
   pMDLg / pRRE	expresa el VIH-1 gag / pol	8.8	1.76	1.76	30
   pRSV-Rev	expresa el VIH-1 REV	4.1	0.82	0.82	30
   pMD2.G	expresa G VSV	5.8	1.16	1.16	30

   Tabla 2:. La cantidad de plásmidos para embalaje lentiviral Utilice estas cantidades de plásmido a transfectar células HEK293 en placas de 10 cm. Importe final de vector lentiviral transferencia por plato puede ser diferente en función de su tamaño, mantener la concentración final por plato a 60 pM. Peso molecular medio de un par de bases de ADN de doble cadena es 660 daltons.

   2. Deseche medio viejode placa de 10 cm de células HEK 293T, y suavemente añadir 9 ml de nuevo medio (DMEM + 10% de FBS, sin P / S).
   3. Agregue la mezcla de PEI-DNA gota a gota con cuidado sobre el plato y mezcle suavemente para mezclar con el medio. Añadir 10 ul de cloroquina 20 mM (concentración final 20 uM) al medio de 10 ml. NOTA: La cloroquina se cree que reduce la degradación de los complejos de transfección que contienen el plásmido a través de la neutralización parcial del pH dentro de los compartimentos lisosomales ^28.
   4. Incubar en CO ₂ incubadora a 37 ˚ C durante 6 horas. A continuación, eliminar el medio que contiene la mezcla de PEI-ADN y añadir 10 ml de nuevo medio (DMEM + 10% de FBS + 20 mM de 4 - ácido (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), pH 7,4 + P / S) . NOTA: Después de la incubación, el virus se produce en el medio. Pipetas Pasteur de aspiración y / o consejos deben ser descontaminados en un 10% de lejía. Descontaminar siempre la superficie biológica cabina de seguridad y equipos que puedan estar contaminados con EtOH al 70%, independientemente de si se ha derramado líquido sobrenadanteo no. Si se ha producido el derrame, la descontaminación a fondo con 1% de SDS en 70% de EtOH es necesaria.
   5. Día 2-3, incubar en CO ₂ incubadora a 37 ˚ C durante 48-72 horas. Día 4, recoge solución lentiviral (vaya a la Sección 2.2).
      NOTA: Medium se puede cambiar en 48 horas después de la transfección. Recopilación de sobrenadante de virus 48 horas y 72 horas en dos ocasiones puede alcanzar para obtener soluciones de virus título superior.
2. Colección de solución y la transducción lentiviral
   1. Preparar reactivos y herramientas: 15 ml tubos cónicos, 1 M HEPES, pH 7.4 (0.22 um filtrada)
   2. Día 4, se recoge el sobrenadante que contiene partículas de lentivirus (solución lentiviral) con 10 ml esterilizados Luer-Lok jeringa, luego filtrar el sobrenadante a través de 0,45 um filtrar en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1/100 volumen de 1 M de HEPES pH 7,4 a la solución filtrada lentiviral (final de 10 mM).
      NOTA: Para el filtrado, utilice sólo el as de celulosatate o polietersulfona (PES) (baja unión a proteínas) Filtros. No utilice filtros de nitrocelulosa. La nitrocelulosa se une proteínas de superficie en el sobre lentiviral y destruye el virus.
   3. Retire medio de 3,5 cm de platos de rata cardiomiocitos neonatales, obtenidos en el último paso de la Sección 1.2, añadir 1 ml de solución lentiviral filtrado al plato 3,5 cm.
   4. Añadir bromuro de hexadimetrina (concentración final 4-6 ug / ml).
      NOTA: bromuro de hexadimetrina puede mejorar la eficacia de transducción lentiviral. La concentración de bromuro de hexadimetrina debe ser optimizado.
   5. Incubar plato durante 6 horas en el incubador de _CO2 a 37 ˚ C para la transducción lentiviral, a continuación, cambiar a medio y nuevo DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S. Incubar plato de CO ₂ incubadora a 37 ˚ C durante 3 días.
      NOTA: La integración del gen exógeno en el genoma del huésped por lentivirus se considera para ser completado por 72 hrs.
   7. Día 7, Usar células de la etapa 2.2.5 para el siguiente paso. NOTA: Expresión de proteínas a partir del plásmido lentiviral se puede confirmar por WB o inmunocitoquímica (ICH) después de 48-72 horas de transducción con el fin de determinar el nivel relativo de expresión (Figura 1a y 1b).
3. Concentración de la solución lentiviral
   NOTA: Es mejor utilizar la solución lentiviral fresco con el fin de lograr mayores eficiencias de transducción, en caso de que la solución título lentiviral no es lo suficientemente alta, la solución lentiviral se puede concentrar por polietilenglicol (PEG) de precipitación ^29.
   1. Preparación de la solución 4x PEG (PEG6000, cloruro de sodio 400 mM, 32% (NaCl), 40 mM de HEPES pH 7,4)
      1. Para 125 ml de solución PEG 4x, pesar 40 g de PEG6000, a continuación, se disuelven en 60 ml de agua.
         NOTA: NOTA: (. Es decir, peso molecular medio de PEG6000 es 6.000) El número después de PEG es el peso molecular medio
         NOTA: 2.3.1.2) Agregue lentamente 10 mlde 5 M de NaCl. Agregue lentamente 5 ml de 1 M HEPES, pH 7,4. Ajustar el pH a 7,4 utilizando hidróxido de sodio 2 M.
         NOTA: 2.3.1.3) Añadir agua hasta 125 ml. Esterilizar la solución PEG 4x por filtración de membrana con un filtro de 0,22 um y almacenarlo a 4 ˚ C.
   2. Concentración Lentivirus
      1. Filtro lentiviral transduced sobrenadante en un nuevo tubo de 50 ml utilizando un filtro de 0,45 um.
         NOTA: 2.3.2.2) Añadir la solución de 4x PEG 1:3 (solución de PEG: sobrenadante = 1:3). Almacenar a 4 ˚ C durante 16-48 horas.
         NOTA: 2.3.2.3) Se centrifuga a 2600 x g a 4 ˚ C durante 30 min. Desechar el sobrenadante y se centrifuga a 2600 x g a 4 ˚ C durante 5 min.
         NOTA: 2.3.2.4) Desechar el sobrenadante con cuidado para evitar perturbar el sedimento. Vuelva a suspender el pellet en medio libre de suero por medio de 1/2 a 1/25 volumen del volumen de sobrenadante inicial.
         NOTA: 2.3.2.5) Utilice directa o congelar con nitrógeno líquido y luego almacenar a -80 ˚ C

3. Transducción adenoviral

NOTA: Por favor consulte otras fuentes para los métodos para la construcción y propagación de construcciones adenovirales ^13. Pipetas Pasteur de aspiración y / o consejos deben ser descontaminados en un 10% de lejía. Descontaminar siempre la superficie biológica cabina de seguridad y potencialmente contaminada equipos con EtOH al 70%, independientemente de si se ha derramado líquido sobrenadante. Si se ha producido el derrame, la descontaminación a fondo con 1% de SDS en 70% de EtOH es necesaria.

1. Titulación Adenoviral en un 50% el cultivo de tejidos dosis infecciosas (TCID ₅₀₎
   NOTA: Antes de transducción, es necesario valorar la solución madre adenoviral. TCID ₅₀ es uno de los mejores métodos para valorar la solución viral. Debido a que el método evalúa un título por una capacidad de infección a las células HEK 293T, calculado _TCID50 refleja infectabilidad real de la acción adenovirus. La UFP (uni formadoras de placaTS) es proporcional a la TCID ₅₀ con un factor de alrededor de 0,56 ^30.
   1. Preparar las células y herramientas: células HEK 293T, 10 cm de platos de cultivo celular de 96 pocillos de placas de cultivo celular de fondo plano, de múltiples pipeta de 8 canales
   2. Preparar el 70-90% de las células HEK 293T confluentes en una placa de 10 cm.
   3. Realizar una pre-dilución de 1/10 ^{de 4} de las acciones de virus. Añadir 50 ul de DMEM + 10% de FBS a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano. Añadir 25 ul del stock de virus pre-diluido en la primera fila, de la A a la H.
   4. Mezclar bien y transferir 25 ul de la primera fila de pocillos de la segunda fila con una de múltiples pipeta de 8 canales. Repetir la dilución 1/3 de la solución viral para cada fila de pocillos hasta e incluyendo la fila 11 y descartar última 25 ul.
   5. Células 293T Se tritura HEK en 10 ml de DMEM + 10% de FBS. Añadir 50 ul de solución de células en cada pocillo de las filas 1 a 12.
   6. Se incuban las células a 37 ˚ C en la incubadora de CO2 durante 11-13 días. Añadir 50 ul de DMEM + 10% FBS después de 4-5 días y 7-8 días de chapado.
   7. Medir los efectos citopáticos en cada pocillo a 11 a 13 días después de la infección.

   carril

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Fila A

   d

   d

   d

   d

   d

   d

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   Fila B

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   Fila C

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   Fila D

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   Fila E

   d

   d

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   d

   Fila F

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   La fila G

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   Fila H

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   d

   el número de pozos positivos por fila

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   6

   5

   2

   2

   0

   la relación de los pocillos positivos por fila

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   0.75

   0.63

   0.25

   0.25

   0

   d	Viendo más del 50% efectos citopáticos
   	Viendo menos de 50% o nada de efectos citopáticos

   Carril 1, 3 dilución ¹ x10 ^4; carril 2, dilución 3 ² x10 ^4; ...; carril 11, dilución 3 ² x10 ^11; carril 12, de control.
   S = la suma de las proporciones de los pocillos positivos por fila
   = 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
   TCID ₅₀ = 3 x 10 ⁴ x 3 x (8,875 a 0,5) = 2,97 x 10 ⁸
   DICT ₅₀ / ml = 5,94 x 10 ⁹

   Tabla 3: Ejemplo de un infectado de 96 pocillos de la placa después de 10 días de incubación Medir los efectos citopáticos en cada pocillo y resumir las razones de los pocillos positivos por fila..

   8. Calcular el título de acuerdo con la fórmula de Kaerber ^31.
   9. TCID ₅₀ = (dilución de primer carril) x (dilución) ^(S-0.5)
   10. S = la suma de las proporciones de los pocillos positivos por fila
       NOTA: Para este protocolo DICT ₅₀ = (30 000) x (3) ^(S-0.5). Debido a que 50 ul de solución viral se utiliza en este protocolo, divida TCID ₅₀ por 0,05 para calcular DICT ₅₀ / ml.
2. Transducción adenoviral
   1. Calcular la cantidad requerida de solución de adenovirus a partir de su título (PFU / ml, partícula viral / ml o ₅₀ TCID / ml). Utilice la fórmula para calcular MOI (multiplicidad de infección).
   2. em> [Place Tabla 4 aquí]
   3. Agregue la cantidad calculada de solución de virus de medio libre de suero (véase la Tabla 5). Mezclar bien e incubar durante 20 min a TA.
   4. em> [lugar de la tabla 5 aquí]
   5. Día 7: Toma plato obtenido en el último paso de la Sección 2.2, y vuelva a colocar medio con 750 ul de nuevo DMEM / MEM que contiene 5% de SFB y P / S.
      NOTA: La reducción del volumen medioen la transducción de hasta aproximadamente 50% del volumen original es crítico para alta eficacia de transducción.
   6. Añadir la solución de virus diluido al plato. Incubar plato durante 4-8 horas en el incubador de _CO2 a 37 ˚ C. A continuación, reemplace con un nuevo medio.
   7. Incubar plato durante 24-48 horas en CO ₂ incubadora a 37 ˚ C. En el día 8-9, Usar células para el experimento de imágenes de células vivas. NOTA: Expresión de proteínas a partir del plásmido adenoviral puede ser confirmado por WB o HIC después de 24-48 horas de transducción con el fin de determinar el nivel de expresión relativa de proteínas (Figura 1c y 1d).

4. Imágenes de células vivas

1. La adquisición de imágenes utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con una cámara de temperatura controlada y un sistema de medio ambiente de CO ₂ (opcional)
   1. Girar el sistema de control de la temperatura en al menos 1 hora antes de la adquisición, de manera que todos los dispositivos equilibren a 37 ˚ C antes del comienzo de la adquisición. Encienda confocal girar sistema de microscopio de disco (PC para la operación, microscopio, girando la unidad de disco, cámara CCD, láser, fuente de luz fluorescente, la fuente de luz normal, la etapa motorizada y persianas automáticas).
      NOTA: Más de 1 hora es necesario para alcanzar el equilibrio de la temperatura completa de todos los dispositivos.
   2. Cambie medio en 3,5 cm de platos con fondo de cristal a medio deseado para la adquisición, si es necesario. Coloque el recipiente en el escenario de un microscopio confocal de disco giratorio en una cámara de temperatura controlada.
      NOTA: Debido a la aberración esférica para la observación óptima mediante el uso de microscopía de un plato inferior 3,5 cm de vidrio con tapa de vidrio No. 1.5 (alrededor de 0,16 hasta 0,19 mm de grosor) es ideal. Si el objetivo se está utilizando tiene un collar de corrección, las imágenes obtenidas con cubiertas de vidrio más grueso que 0,17 mm pueden ser corregidas. También, Rojo fenol tiene una ligera fluorescencia. A veces es preferible utilizar un medio libre de rojo de fenol, tal como DMEM sin rojo de fenol. Si no hay ningún dispositivo para controlar CO _{2 concentración en la platina del microscopio, es mejor utilizar un CO2 medio o medio amortiguado por HEPES para time-lapse de largo plazo independiente.}
   3. Seleccione la trayectoria de la luz a los oculares.
   4. Gire el obturador de la fuente luminosa de campo claro en. Ajuste el enfoque de las células bajo el microscopio a través de los oculares. Gire el obturador para la fuente de luz fuera de campo brillante.
   5. Gire el obturador de la fuente de luz fluorescente. Encuentra las células que expresan proteínas fluorescentes bajo el microscopio a través de los oculares. Gire el obturador para la fuente de la luz fluorescente.
   6. Opcional> Pulse el botón de activación para el sistema de enfoque perfecto delante del microscopio para activar el sistema de enfoque perfecto en el fin de mantener la atención constante durante la adquisición de lapso de tiempo.
   7. Cambie la ruta de la luz para el microscopio confocal de disco giratorio. Ajuste la configuración para la adquisición apropiadamente el uso del software operativo, comprobando imágenes displayEd en la pantalla. (Por ejemplo, Focus, la potencia del láser, tiempo de exposición, CCD ganancia de la cámara y off-set)
   8. Ajustes fijados para la adquisición de imágenes de fluorescencia utilizando el software operativo. Ejemplo: Seleccione "Cambiar canales utilizando trayectorias de la luz" y "Canal 1: EGFP" para adquirir la señal fluorescente de EGFP para el canal uno.
   9. Ajuste la frecuencia entre los puntos de tiempo mediante la configuración de los ajustes de lapso de tiempo con el fin de tomar las imágenes con lapso de tiempo utilizando el software operativo. Ejemplo: Para adquirir un punto de tiempo cada 5 minutos, seleccione "Minutos por Time-punto" en el menú desplegable e introduzca 5 en el campo de texto.
      NOTA: Seleccione "Velocidad máxima" para hacer una película a la velocidad real. Si la expresión de la proteína fluorescente es baja, la fluorescencia puede blanquear rápidamente durante la adquisición de lapso de tiempo. En ese caso, es mejor reducir el número de adquisición de puntos de tiempo.
   10. Iniciar la adquisición de lapso de tiempo haciendo clic en el "stabotón rt "para adquirir una secuencia de imágenes.
       NOTA: Es mejor no utilizar la función de adquisición-de múltiples puntos. Puede causar pérdida de concentración o movimiento del campo de la imagen en time-lapse.
2. Análisis de las imágenes adquiridas
   NOTA: Adquirido imágenes se pueden reproducir en formato de película y se analizaron utilizando el software de análisis.
   1. Seleccione las imágenes adquiridas que se incluirán en una película. En caso necesario, las regiones de cultivos de interés a partir de imágenes y seleccione interesantes puntos de tiempo para reducir el tamaño del archivo de película utilizando el software operativo.
   2. Exportación de imágenes como un archivo de película en formato AVI o MOV. Selecciona un formato de película en el menú "Formato" lista desplegable y el tiempo requerido para la película terminada, haga clic en "Exportar". NOTA: las imágenes con lapso de tiempo adquiridos en un punto de tiempo cada 5 minutos se pueden reproducir como una película a 10 cuadros por segundo, que es 3.000 veces más rápido que su velocidad real.

Resultados

Para ilustrar la técnica, un lentivirus EGFP codificación (proteína fluorescente verde potenciada)-etiquetados Cx43 (connexin43) o un Cx43 mutado ³² se utilizó para expresar proteínas EGFP-etiquetados en las células, y un adenovirus que codifica FGFR1DN (receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 negativo dominante ) se utilizó para apagar la señalización de FGF en la celda ^{33 a 35.} Tres días después de la aislamiento de los cardiomiocitos, los cardiomiocitos aislados fueron tr...

Discusión

Cardiomiocitos primarios aislados de ratas neonatales han sido utilizados para estudiar las funciones de cardiomiocitos in vitro. Este protocolo describe un método para el aislamiento de cardiomiocitos neonatales de crías de rata utilizando un método de digestión de la enzima de dos pasos, primero la digestión con tripsina de O / N a 4 ° C y luego se colagenasa purificada. Una ventaja de emplear el paso de colagenasa purificada es que el mismo grado de enzima se utiliza para todos los aislamientos. Por lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 scissors for decapitation	WPI	501749	Autoclave before use
1 fine scissors for heart isolation and chopping	WPI	14393	Autoclave before use
2 fine forceps (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave before use
Three sterilized 10 cm plastic dishes	Sigma	CLS430165	for hearts isolation
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C	for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0.17-14-C	for TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70 % (v/v) in water	Sigma	E7148
2% gelatin	Sigma	G1393
One sterilized 10 cm plastic dish	Sigma	CLS430165	for trypsinization
Aluminium foil	any brand
parafilm	Sigma	P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish	Sigma	CLS430165	for selection
Auto pipette	Drummond Scientific	4-000-300	for trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter	nexcelom		to check and count cells
Microscope and Hematocytometer	any brand		to check and count cells
Trypan Blue Solution, 0.4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubator	Sanyo	MCO-19AIC
incubating orbital shaker	Sigma	Z673129	to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution	BD Pharmingen	550891
DMEM, High Glucose	invitrogen	41965039	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM	invitrogen	31095029	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal Bovine Serum	invitrogen	26140079
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	invitrogen	15140-122
Section 2 lentiviral transduction
three packaging plasmids
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (serum-free medium)	invitrogen	31985070
transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)	Polysciences	24765-2	It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substitute for PEI as transfection reagent
chloroquine	Sigma	C6628	dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES	Sigma	H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized	BD	309604
0.45 um filters	Sigma	F8677	use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
polyethylene glicol 6000	Sigma	81260
Sodium chloride	Sigma	S9888
sodium hydroxide	Sigma	S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes	Sigma	CLS430165
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile	BD Falcon	353072	for titration
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel	eppendorf	3122 000.035
Section 4 live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy	PerkinElmer	L7267000
a temperature controlled chamber	any brand		to keep temperature at 37 C
a CO2 environmental system	any brand		optional to maintain CO2 concentration optimal
Medium
CO2 Independent Medium, No Glutamine	invitrogen	18045-054	for long time time-lapse imaging
DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red	invitrogen	21063-029	for long time time-lapse imaging