Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Riepilogo

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Abstract

Primario cardiomiociti neonatali di ratto sono utili in base nella ricerca cardiovascolare vitro perché possono essere facilmente isolati in gran numero in una singola procedura. Grazie ai progressi nella tecnologia del microscopio è relativamente facile per catturare immagini di cellule in vivo allo scopo di indagare eventi cellulari in tempo reale con una minima preoccupazione per quanto riguarda fototossicità alle cellule. Questo protocollo descrive come prendere le immagini timelapse cellule vive di ratto primaria cardiomiociti neonatali utilizzando un microscopio confocale disco rotante che segue la trasduzione lentivirale e adenoviral di modulare le proprietà della cella. L'applicazione di due diversi tipi di virus rende più facile per raggiungere un adeguato livello dei tassi di trasduzione e di espressione di due geni diversi. Immagini di cellule vive bene focalizzate possono essere ottenuti utilizzando il sistema autofocus del microscopio, che mantiene a fuoco stabile per lunghi periodi di tempo. Applicando questo metodo, le funzioni di ingegnere esogenamenteproteine ​​di ed espressi in cellule primarie in coltura possono essere analizzati. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare la funzione dei geni attraverso l'uso di siRNA nonché di modulatori chimici.

Introduzione

Ratto cardiomiociti neonatali primari sono stati a lungo utilizzati per indagare la funzione dei cardiomiociti in vitro ^1. Sono facili da isolare da cuccioli di ratto da diversi metodi ben consolidati ^2-4. Il metodo più comune impiega collagenasi o tripsina per digerire tessuto connettivo del cuore prima isolamento cellulare. I ricercatori hanno anche sviluppato metodi per isolare cardiomiociti da roditori adulti ^5-8 così come topi neonati ^9,10.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare cardiomiociti da cuccioli di ratto neonatale, impiegando una procedura in due fasi digestione enzimatica. Tripsina prima utilizzazione O / N a 4 ° C, e poi collagenasi purificata a 37 ° C. L'incubazione del tessuto cardiaco con tripsina O / N a 4 ° C riduce i passi necessari per cellule raccolto rispetto ai metodi mediante incubazioni sequenziali in soluzione enzimatica caldo ^2. Inoltre, utilizzando co purificatallagenase piuttosto che gli enzimi greggio, la variabilità da lotto a lotto può essere eliminato, fornendo così una maggiore riproducibilità.

Studi funzionali di una particolare proteina spesso utilizzano un sistema di espressione della proteina utilizzando un adenovirus ^11-13 e / o un lentivirus ^14-16. [Nota cautelativa] La produzione virale e la manipolazione devono essere eseguite secondo le linee guida NIH.

L'adenovirus non si integra nel genoma dell'ospite. Ha una altissima efficienza di trasduzione nella maggior parte dei tipi cellulari, tra cui cellule in divisione e le cellule che non si dividono, così come le cellule primarie e linee cellulari stabilizzate. Questo rende l'adenovirus un vettore affidabile per l'espressione genica. Alti livelli della proteina codificata dal vettore adenovirus sviluppano in 48 hr seguente trasduzione, e possono durare per diverse settimane ^17. Tuttavia, uno svantaggio di utilizzare un adenovirus per l'espressione proteica è che lo sviluppo di un ade ricombinantenovirus è sia complicato e richiede tempo. Questo inconveniente spiega in parte perché molti ricercatori sono state girando a lentivirus per l'espressione del gene ricombinante. A differenza dei costrutti adenovirali, generando un costrutto lentivirale è semplice e veloce. Sebbene lentivirus hanno generalmente inferiori efficienze di trasduzione di adenovirus, in entrambe le cellule in divisione e non si dividono, esse integrarsi nel genoma dell'ospite. Di conseguenza, l'espressione del gene trasdotto è più stabile per lentivirus che per adenovirus.

Grazie ai progressi tecnologici nel campo della microscopia, è molto più facile per catturare immagini di cellule in vivo di cellule esprimenti proteine ​​ricombinanti. Questo vale anche a velocità di tasso di video di acquisizione. Questo permette al ricercatore di determinare come particolari alterazioni nella proteina di interesse impatto funzionalmente cella in tempo reale. Il microscopio confocale disco rotante ha diverse caratteristiche chiave che rendono una tecnica ottimale per livl'imaging cellulare e ^18,19. Il disco rotante Yokogawa consente molto più rapida acquisizione delle immagini, mentre allo stesso tempo utilizzano energia laser molto meno di scansione punto microscopi confocali. Entrambe queste particolarità sono dovute al disco rotante, che contiene numerosi fori confocali attraverso cui il laser passa contemporaneamente ai campioni. Durante l'acquisizione, il disco stesso gira velocemente e ^18-20. Utilizzando il sistema autofocus del microscopio, messa a fuoco stabile viene mantenuta per lunghi periodi di tempo. Questo permette ai ricercatori di scattare immagini di cellule vive ben focalizzati. Immagini acquisite vengono riprodotti come file di filmato. Le immagini sono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini, come ImageJ ^21,22, FIJI ^23, o altri software disponibili in commercio.

Protocollo

1. Isolamento di ratto cardiomiociti neonatali

1. Utilizzare mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) e medio minimo essenziale (MEM) addizionato con siero fetale bovino (FBS) e penicillina / streptomicina (P / S) come mezzo di coltura. Aggiungere bromodeossiuridina (BrdU) al mezzo per prevenire la crescita di fibroblasti per i primi 2 giorni dopo l'isolamento.

	Medio Base	FBS	BrdU (mm)	P / S (U / ml)
selezione	DMEM	10%	0	20
Il primo giorno	DMEM	10%	0.1	10
Il giorno successivo	DMEM / MEM	5%	0.1	10
Ulteriore cultura	DMEM / MEM	5%	0	10

Tabella 1:. Medio per cardiomiociti neonatali di ratto Utilizzare questo supporto per la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto. DMEM / MEM è 1:1 mix di DMEM e MEM medium.

1. Isolamento dei cardiomiociti, 1 ª giornata (Stima tempo necessario, circa 1 ora)
   NOTA: Per il lavoro con i roditori neonatali, fare riferimento alle linee guida universitari locali e le regole stabilite dai programmi di cura degli animali, e di aderire ai protocolli di animali istituzionalmente riconosciuti. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso del Resource Center Animal Yale.
   1. Preparare i reagenti e strumenti: soluzione salina bilanciata di calcio e magnesio libero di Hank (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, sul ghiaccio; 1 mg tripsina, ricostituito con 2 ml di CMF HBSS, su ghiaccio; strumenti in autoclave; 70% di etanolo (EtOH) in 250 ml becher; quattro sterilizzati 10 centimetri piatti di plastica, tre per l'isolamento di cuori e uno per tripsinizzazione.
   2. Ordine 1 Litter di 1-a-2-giorni di età cuccioli di ratto (circa 10 PUP) con la loro madre da un distributore animale sperimentale.
   3. Day1, Trasferimento cuccioli di piccola gabbia e eutanasia diga con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200ml/10g e xilazina 20ml/10g) overdose.
   4. Prendere un cucciolo e sterilizzare tutto il suo corpo con il 70% EtOH. Decapitare prole con forbici chirurgiche affilate e ben tenute su un piatto di plastica 10 centimetri sterilizzato in un luogo isolato dagli altri cuccioli.
      NOTA: Per raccogliere i campioni più velocemente possibile, è preferibile usare il metodo più rapido ed efficiente per annullare la vita del roditore. Decapitazione se correttamente utilizzato da professionisti qualificati con attrezzature in buone condizioni può provocare meno paura e ansia per l'animale ed essere più rapido e pratico rispetto ad altre forme di eutanasia. Essa è coerente con le raccomandazioni dei medici veterinari Linee guida dell'Associazione Americana per l'eutanasia degli animali.
   5. Rimuovere battendo luiarte con strumenti sterilizzati, e mettere il cuore in 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS in tubo da 50 ml. NOTA: Rimuovere i cuori più velocemente possibile e metterli immediatamente in ghiaccio. Dopo aver rimosso il cuore dal corpo, tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio.
   6. Raccogliere 5 cuori in 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS e le restanti cinque cuori in altri 30 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS. Agitare il tubo per sciacquare i cuori. NOTA: Dopo questo passo, effettuare le procedure in una cappa a flusso laminare.
   7. Eliminare il surnatante e trasferire i cuori di una nuova sterilizzato piatto di plastica 10 centimetri sul ghiaccio. NOTA: Fare attenzione a non aspirare cuori con l'aspiratore.
   8. Rimuovere grandi navi e / o tessuti indesiderati. Aggiungere 10 ml di ghiaccio raffreddato CMF HBSS al piatto per sciacquare i cuori.
   9. Trasferire tutti i cuori in una nuova sterilizzato piatto di plastica 10 centimetri sul ghiaccio. Tritare i cuori con le forbici a meno di 1 mm ³ su ghiaccio.
   10. Aggiungere 9 ml di freddo CMF HBSS. Aggiungere 1 ml di freddo tripsina ricostituzionestituito con CMF HBSS (finale 50 ug / ml).
   11. Sigillare il piatto con parafilm e coprire con un foglio di alluminio, poi metterlo in camera fredda (4 ˚ C) durante la notte.
2. Isolamento dei cardiomiociti, 2 ª giornata (Stima tempo necessario, circa 4 ore)
   1. Preparare i reagenti e strumenti: 50 ml conica tubo x 2; 2 inibitore della tripsina mg, ricostituito con 1 ml di CMF HBSS, su ghiaccio; 1500 unità collagenasi, ricostituito con 5 ml di Leibovitz L-15, a temperatura ambiente (RT); Leibovitz L-15, ricostituito con 1 litro di acqua sterilizzata e filtrare attraverso un filtro da 0,22 micron, 8 ml a temperatura ambiente; 10 mg / ml (32.6 mM) BrdU in acqua; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; due 10 centimetri di plastica di coltura cellulare piatti; Piatti 3,5 centimetri con fondo di vetro.
   2. Day2, Preparazione di piatti di gelatina rivestito. Aggiungere 1 ml di soluzione di gelatina 0,1% per rivestire un piatto fondo di 3,5 centimetri di vetro per un esperimento di imaging. Incubare piatti a 37 ˚ C per diverse ore, poi aspirare e scartare la soluzione di gelatina prima dell'uso.
      NOTE: Un piatto fondo di 3,5 centimetri bicchiere è adatto per un esperimento di imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza. Per estrarre proteine ​​da cardiomiociti primari per rilevare l'espressione della proteina mediante western blotting (WB), possono essere utilizzati rivestite piatti di coltura di cellule di plastica 0,1% di gelatina.
   3. Trasferire tutto tessuto cardiaco digerito con tripsina notte con tampone in una provetta da 50 ml su ghiaccio nella cappa sterile. Aggiungere 1 ml di inibitore della tripsina in CMF HBSS (finale 182 ug / ml). Chiudere il coperchio del tubo conico da 50 ml ermeticamente per evitare la contaminazione.
   4. Incubare la provetta per circa 30 minuti in un incubatore a 37 ˚ C per riscaldare il tessuto e buffer per 30-37 ˚ C. Aggiungere 5 ml di collagenasi in Leibovitz L-15 (finale di 94 unità / ml). Incubare a 37 ˚ C per 45 min con dolce agitazione (170-200 rpm shaker nel 37 ˚ C incubatore).
      NOTA: Questa fase può essere effettuata al di fuori della cappa a flusso laminare. Tutti i passi successivi devono essere effettuate a temperatura ambiente.
   5. Disinfettare la superficie esterna di un tubo conico da 50 ml con il 70% EtOH e metterenella cappa sterile.
   6. Tessuti triturare con auto pipetta con pipettaggio a 3 ml / sec di velocità di 20 volte. Lasciare residui di tessuto di stabilirsi per 3 minuti e filtrare il surnatante con una um filtro cella 70.
      NOTA: Un normale formato 10 ml pipetta può essere utilizzato per la triturazione.
   7. Aggiungere 5 ml della Leibovitz L-15 per i grumi di tessuto rimanenti e triturare e filtrare nuovamente il surnatante. Lavare filtro cella con 2 ml di Leibovitz L-15.
   8. Posizionare soluzione di cellule filtrata in una cappa per 20 - 60 min per permettere collagenasi di digerire il collagene parzialmente degradata.
   9. Cellule sedimenti a 100 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 20 ml di DMEM contenente 10% FBS ed alta concentrazione P / S (20 U / ml).
   10. Cellule pre-piastra su due 10 centimetri di plastica piatti di coltura di cellule per 1 ora in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C per la selezione dei cardiomiociti. NOTA: I fibroblasti attaccano più facilmente al fondo del piatto di cardiomiociti.
   11. While attesa, preparare DMEM contenente 10% FBS, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM BrdU. Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml BrdU per 325 ml di DMEM contenente 10% FBS e P / S.
   12. Agitare delicatamente piatti e raccogliere i cardiomiociti contenente surnatante da due 10 centimetri piatti.
       NOTA: La maggior parte dei cardiomiociti saranno ancora galleggiando nel surnatante dopo 1 ora di incubazione. Per evitare di contaminare con fibroblasti che sono leggermente attaccati al piatto, non raccogliere il surnatante pipettando.
   13. Facoltativo> Contare le celle nel surnatante con e senza lo 0,2% trypan blu per verificare la vitalità cellulare.
   14. Cellule sedimenti a 100 x g per 5 min. Risospendere le cellule in DMEM contenente 10% FBS, P / S (10 U / ml) e 0,1 mM BrdU. Cellule Piatto a 2 x 10 ⁵ cellule / piatto in 3,5 centimetri di vetro piatti peggiori gelatina rivestite per l'osservazione al microscopio. NOTA: Non disturbare le cellule dopo la placcatura per almeno 24 ore in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C.
   15. Giorno 3, ChaESN media 24 ore dopo la placcatura di DMEM / MEM contenente il 5% FBS, P / S e 0,1 BrdU mm.
   16. Giorno 4, Cambiare media 48 ore dopo la placcatura di DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.
       NOTA: Cambiare medio ogni 2-3 giorni con DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.

2. Trasduzione lentivirali

1. Confezionamento di plasmidi lentivirali
   NOTA: Si prega di fare riferimento ad altre fonti per ulteriori informazioni approfondite su questo argomento ^24-26. Ci vorranno circa 3 giorni per preparare la soluzione lentivirale. E 'meglio usare la soluzione lentivirali fresco per ottenere una maggiore efficienza di trasduzione. Avviare il confezionamento di plasmidi lentivirali e l'isolamento di cardiomiociti neonatali di ratto in parallelo. Invece di utilizzare polietilenimmina (PEI) ²⁷ per il confezionamento di plasmidi lentivirali, un reagente di trasfezione disponibile in commercio può essere utilizzato. Seguire le istruzioni del produttore.
   1. Preparare i reagenti e strumenti; HEKCellule 293T, 10 centimetri di plastica piatti di coltura cellulare, soluzioni plasmidi lentivirali (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, trasferimento di vettori lentivirali, 1,0 mg / ml), 1 g / l PEI, terreno privo di siero, 20 mM clorochina in acqua, il 10% di candeggina, 1% SDS nel 70% EtOH
   2. Giorno 0, Piatto 2-2,5 cellule x 10 ⁶ HEK 293T per 10 cm sfornano il giorno prima trasfezione.
      NOTA: 30-60% di confluenza a transfezione è ottimale.
   3. Giorno 1, Preparazione di una soluzione di trasfezione PEI. Aggiungere 30 ul di 1 g / l PEI a 960 ul terreno privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 4 plasmidi nella soluzione di trasfezione PEI nel tubo da 1,5 ml, e mescolare con maschiatura.

   Nome del plasmide	Appunto	Dimensioni (kbp)	volume aggiunto (ml)	Importo finale in 10 centimetri piatto (mg)	Concentrazione finale di 10 centimetri piatto (pm)
   Trasferimento di vettori lentivirali	codifica gene da confezionare	9-13	3,6-5,2	3,6-5,2	60
   pMDLg / pRRE	esprime HIV-1 gag / POL	8.8	1.76	1.76	30
   PRSV-Rev	esprime HIV-1 REV	4.1	0.82	0.82	30
   pMD2.G	esprime VSV G	5.8	1.16	1.16	30

   Tabella 2:. La quantità di plasmidi per l'imballaggio lentivirali Utilizzare questi importi plasmide per trasfettare cellule HEK293 in 10 piatti cm. Importo finale del trasferimento di vettori lentivirali per ogni piatto può variare in base alle sue dimensioni, mantenere la concentrazione finale per ogni piatto a 60 pM. Peso molecolare medio di una coppia di basi di DNA a doppio filamento è 660 dalton.

   2. Scartare vecchio mezzoda 10 cm piatto di cellule HEK 293T, e delicatamente aggiungere 9 ml di nuovo medium (DMEM + 10% FBS, senza P / S).
   3. Aggiungete il composto di PEI-DNA delicatamente goccia a goccia sul piatto e mescolare delicatamente per mescolare con il mezzo. Aggiungere 10 ul di clorochina 20 mm (finale 20 uM) a 10 ml di media. NOTA: La clorochina è pensato per ridurre la degradazione dei complessi trasfezione contenenti plasmidi mediante parziale neutralizzazione del pH nei compartimenti lisosomiali ^28.
   4. Incubare in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C per 6 ore. Quindi, rimuovere terreno contenente la miscela PEI-DNA e aggiungere 10 ml di nuovo (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - acido (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), pH7.4 + P / S) . NOTA: Dopo l'incubazione, virus sarà prodotta nel mezzo. Pipette e / o suggerimenti aspirante Pasteur devono essere decontaminati del 10% di candeggina. Decontaminare sempre la superficie cappa di sicurezza biologica e le attrezzature potenzialmente contaminate con il 70% EtOH indipendentemente dal fatto che surnatante è stato versatoo non. Se si è verificato fuoriuscite di decontaminazione completa con 1% SDS nel 70% EtOH è necessario.
   5. Giorno 2-3, incubare in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C per 48-72 ore. Giorno 4, raccogli soluzione lentivirali (la Sezione 2.2).
      NOTA: Piano può essere modificato in 48 ore dopo la trasfezione. Raccolta surnatante virus 48 ore e 72 ore per due volte può raggiungere per ottenere soluzioni antivirus titolo più elevati.
2. Raccolta di soluzione lentivirali e trasduzione
   1. Preparare reagenti e strumenti: 15 ml provette coniche, 1 M HEPES, pH7.4 (0,22 um filtrato)
   2. Giorno 4, Collect surnatante contenente particelle lentivirali (soluzione lentivirali) con 10 ml sterilizzati siringa Luer-Lok, quindi filtrare il surnatante con 0,45 um filtrare in un tubo da 15 ml. Aggiungere 1/100 volume di 1 M HEPES pH7.4 alla soluzione lentivirali filtrata (finale 10 mm).
      NOTA: Per il filtraggio, utilizzare solo asso di cellulosatate o polietersulfone (PES) (basso legame di proteine) filtri. Non utilizzare filtri di nitrocellulosa. Nitrocellulosa lega proteine ​​di superficie sulla busta lentivirale e distrugge il virus.
   3. Rimuovere medio da 3,5 centimetri piatti a base di cardiomiociti neonatali di ratto, ottenuti nell'ultimo passaggio della Sezione 1.2, aggiungere 1 ml di soluzione lentivirali filtrata al piatto 3,5 centimetri.
   4. Aggiungere hexadimethrine bromuro (concentrazione finale 4-6 ug / ml).
      NOTA: Hexadimethrine bromuro può aumentare lentivirali efficienza di trasduzione. Concentrazione di hexadimethrine bromuro deve essere ottimizzato.
   5. Incubare piatto per 6 ore in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C per lentivirali trasduzione, poi cambiare medio nuova DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S. Incubare piatto in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C per 3 giorni.
      NOTA: L'integrazione del gene esogeno nel genoma dell'ospite da lentivirus è considerato essere completato entro 72 ore.
   7. Giorno 7, usare le cellule dal punto 2.2.5 per il passo successivo. NOTA: Espressione della proteina dal plasmide lentivirale può essere confermata mediante WB o immunocitochimica (ICH) dopo 48-72 ore di trasduzione per determinare il livello di espressione relativa (Figura 1a e 1b).
3. Concentrazione della soluzione lentivirali
   NOTA: E 'meglio usare la soluzione lentivirale fresco al fine di conseguire più elevati di efficienza di trasduzione, nel caso la soluzione lentivirale titolo non è abbastanza alta, la soluzione lentivirale può essere concentrata in polietilene glicole (PEG), la precipitazione ^29.
   1. Preparazione della soluzione 4x PEG (32% PEG6000, cloruro di sodio 400 mm (NaCl), 40 mM HEPES pH7.4)
      1. Per 125 ml di soluzione 4x PEG, pesare 40 g di PEG6000, poi scioglierlo in 60 ml di acqua.
         NOTA: NOTA: (. Cioè peso molecolare medio di PEG6000 è 6.000) Il numero dopo PEG è il peso molecolare medio
         NOTA: 2.3.1.2) aggiungere lentamente 10 ml5 M NaCl. Lentamente aggiungere 5 ml di 1 M HEPES pH7.4. Regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio 2 M.
         NOTA: 2.3.1.3) Aggiungere acqua a 125 ml. Sterilizzare soluzione di PEG 4x con membrana di filtrazione con un filtro da 0,22 um e conservarlo a 4 ˚ C.
   2. Concentrazione lentivirus
      1. Filtro lentivirale trasduzione surnatante in una nuova provetta da 50 ml con un filtro da 0,45 um.
         NOTA: 2.3.2.2) Aggiungere la soluzione 4x PEG rapporto 1:3 (soluzione di PEG: surnatante = 1,3). Conservare a 4 ˚ C per 16-48 ore.
         NOTA: 2.3.2.3) Centrifugare a 2.600 x g a 4 ˚ C per 30 min. Scartare il surnatante e centrifugare a 2.600 x g a 4 ˚ C per 5 min.
         NOTA: 2.3.2.4) Scartare con attenzione il surnatante per non disturbare il pellet. Risospendere pellet in terreno privo di siero con 1/2 a 1/25 del volume del volume surnatante originale.
         NOTA: 2.3.2.5) Utilizzare direttamente o congelamento con azoto liquido poi conservare a -80 ˚ C

3. Trasduzione Adenoviral

NOTA: Si prega di fare riferimento ad altre fonti di metodi per la costruzione e propagazione di costrutti adenovirali ^13. Pipette e / o suggerimenti aspirante Pasteur devono essere decontaminati del 10% di candeggina. Decontaminare sempre la superficie cappa di sicurezza biologica e potenzialmente contaminati apparecchiature con il 70% EtOH indipendentemente dal fatto che surnatante è stato versato. Se si è verificato fuoriuscite di decontaminazione completa con 1% SDS nel 70% EtOH è necessario.

1. Titolazione Adenoviral del 50% della dose infettante la coltura tissutale (TCID ₅₀₎
   NOTA: Prima di trasduzione, è necessario per titolare la soluzione stock adenovirale. TCID ₅₀ è uno dei migliori metodi per titolare la soluzione virale. Poiché il metodo restituisce un titolo da una capacità infettiva di cellule HEK 293T, calcolato _TCID50 riflette infectability effettiva del adenovirus magazzino. Il PFU (formazione di placca units) è proporzionale alla TCID ₅₀ con un fattore di circa 0,56 ^30.
   1. Preparare le cellule e gli strumenti: cellule HEK 293T, 10 centimetri piatti di coltura cellulare, piastra a 96 pozzetti di coltura cellulare a fondo piatto, 8-multicanale pipetta
   2. Preparare 70-90% di cellule 293T confluenti HEK in un piatto 10 centimetri.
   3. Eseguire una pre-diluizione 1/10 ⁴ dello stock virus. Aggiungere 50 ul di DMEM + 10% FBS a ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare da 96 pozzetti a fondo piatto. Aggiungere 25 ul del virus magazzino pre-diluito in prima fila, dalla A alla H.
   4. Mescolare bene e trasferire 25 ul dalla prima fila di pozzi per la seconda fila con un multi pipetta a 8 canali. Ripetere il terzo diluizione della soluzione virale a ogni riga di pozzi fino ad includere la riga 11 e scartare lo scorso 25 ul.
   5. Triturare HEK cellule 293T in 10 ml di DMEM + 10% FBS. Aggiungere 50 ul di soluzione di cellule in ogni pozzetto dalle righe da 1 a 12.
   6. Incubare le cellule a 37 ˚ C in incubatore a CO2 per 11-13 giorni. Aggiungere 50 ul di DMEM + 10% FBS dopo 4-5 giorni e 7-8 giorni di placcatura.
   7. Misurare gli effetti citopatici in ciascun pozzetto a 11-13 giorni dopo l'infezione.

   corsia

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Fila A

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   Row B

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   Row C

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   Row D

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   E Row

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   Fila F

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   Fila G

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   d

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   d

   Fila H

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   d

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   d

   d

   il numero di pozzetti positivi per riga

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   6

   5

   2

   2

   0

   il rapporto dei pozzetti positivi per riga

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   0.75

   0.63

   0.25

   0.25

   0

   d	Visualizzazione oltre il 50% degli effetti citopatici
   	Visualizzazione di sotto del 50% o nessun effetto citopatico

   Corsia 1, 3 diluizione ¹ x10 ^4; corsia 2, 3 diluizione ² x10 ^4; ...; corsia 11, diluizione 3 ² x10 ^11; corsia 12, il controllo.
   S = la somma dei rapporti di pozzetti positivi per fila
   = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8,875
   TCID ₅₀ = 3 x 10 x ⁴ x 3 (8,875-,5) = 2,97 x 10 ⁸
   TCID ₅₀ / ml = 5,94 x 10 ⁹

   Tabella 3: Esempio di una infetto ben 96 piastre dopo 10 giorni di incubazione Misurare gli effetti citopatici in ciascun pozzetto e sommare i rapporti di pozzetti positivi per riga..

   8. Calcolare il titolo secondo la formula di Kaerber ^31.
   9. TCID ₅₀ = (diluizione della prima corsia) x (diluizione) ^(S-0.5)
   10. S = la somma dei rapporti di pozzetti positivi per fila
       NOTA: Per questo protocollo, TCID ₅₀ = (30000) x (3) ^(S-0.5). Perché il 50 ul di soluzione virale è utilizzato in questo protocollo, dividere TCID ₅₀ da 0,05 a calcolare TCID ₅₀ / ml.
2. Trasduzione adenovirale
   1. Calcolo della quantità necessaria di soluzione adenovirale dal suo titolo (PFU / ml, particella virale / ml o TCID ₅₀ / ml). Utilizzare la formula per calcolare MOI (molteplicità di infezione).
   2. em> [Inserire Tabella 4 qui]
   3. Aggiungere importo calcolato della soluzione antivirus per mezzo privo di siero (cfr. tabella 5). Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   4. em> [Inserire tabella 5 qui]
   5. Day7, Take piatto ottenuto durante l'ultima fase della Sezione 2.2, e sostituirlo media con 750 ul di nuovo DMEM / MEM contenente il 5% FBS e P / S.
      NOTA: Riduzione del volume medioa trasduzione a circa il 50% del volume iniziale è fondamentale per alta efficienza di trasduzione.
   6. Aggiungere la soluzione virus diluito piatto. Incubare piatto per 4-8 ore in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C. Poi, sostituirlo con terreno fresco.
   7. Incubare piatto per 24-48 ore in CO ₂ incubatore a 37 ˚ C. Al giorno 8-9, utilizzare le cellule per l'esperimento live-cell imaging. NOTA: Espressione proteica dal plasmide adenovirale può essere confermata mediante WB o ICH dopo 24-48 ore di trasduzione per determinare il livello di espressione relativa proteina (Figura 1C e 1d).

4. Imaging cellulare dal vivo

1. Acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio confocale disco rotante con una camera a temperatura controllata ed un sistema ambientale CO ₂ (opzionale)
   1. Ruotare il sistema di controllo della temperatura su almeno 1 ora prima dell'acquisizione, in modo che tutti i dispositivi equilibrare a 37 ˚ C prima dell'inizio di acquisizione. Accendere confocal spinning sistema di microscopia disco (PC per il funzionamento, microscopio, spinning unità disco, fotocamera CCD, laser, sorgente luminosa fluorescente, sorgente di luce normale, palcoscenico motorizzato e persiane automatiche).
      NOTA: Più di 1 ora è necessario per raggiungere la temperatura di equilibrio completo di tutti i dispositivi.
   2. Cambiare media 3,5 centimetri con fondo di vetro piatti a supporto desiderato per l'acquisizione, se necessario. Porre la capsula sul palco del microscopio confocale disco rotante in una camera a temperatura controllata.
      NOTA: A causa di aberrazione sferica per l'osservazione ottimale utilizzo microscopio di un piatto fondo di 3,5 centimetri di vetro con n ° 1,5 coperchio in vetro (circa 0,16-0,19 mm di spessore) è l'ideale. Se l'obiettivo utilizzato ha un collare di correzione, immagini ottenute con vetrini coprioggetto spessore dello 0,17 mm possono essere corretti. Inoltre, fenolo rosso ha una leggera fluorescenza. A volte è preferibile utilizzare un terreno privo di rosso fenolo, come DMEM senza rosso fenolo. Se non ci sono dispositivi per controllare CO 2 sul palco microscopio, è meglio utilizzare un CO ₂ medie o medio tamponato da HEPES per il lungo termine time-lapse imaging indipendente.
   3. Selezionare il percorso ottico verso gli oculari.
   4. Ruotare l'otturatore della sorgente luminosa in campo chiaro su. Regolare il fuoco alle cellule sotto il microscopio attraverso gli oculari. Ruotare l'otturatore per il campo chiaro sorgente di luce spenta.
   5. Ruotare l'otturatore per la sorgente di luce fluorescente. Trova le cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti sotto il microscopio attraverso gli oculari. Ruotare l'otturatore per il fluorescente sorgente.
   6. Facoltativo> Premere il tasto di attivazione per il sistema di messa a fuoco perfetta davanti al microscopio per accendere il sistema di messa a fuoco perfetta al fine di mantenere costante attenzione durante l'acquisizione time-lapse.
   7. Modificare il percorso della luce al microscopio confocale disco rotante. Regolare le impostazioni per l'acquisizione in modo appropriato tramite il software operativo, controllando immagini displaYED sullo schermo. (Es. fuoco, potenza del laser, tempo di esposizione, CCD guadagno della telecamera e off-set)
   8. Impostare le impostazioni per l'acquisizione di immagini a fluorescenza utilizzando il software operativo. Esempio: selezionare "Modifica canali utilizzando percorsi di luce" e "Channel 1: EGFP" per acquisire segnale fluorescente da EGFP per un canale.
   9. Impostare la frequenza tra i punti temporali configurando le impostazioni di time-lapse, al fine di scattare immagini time-lapse utilizzando il software operativo. Esempio: Per acquisire un time-point ogni 5 minuti, selezionare "Minuti per Time-point" dal menu a discesa e immettere 5 nel campo di testo.
      NOTA: Selezionare "Velocità massima" per fare un film a velocità reale. Se l'espressione della proteina fluorescente è basso, la fluorescenza può candeggiare rapidamente durante l'acquisizione time-lapse. In tal caso, è preferibile ridurre il numero di acquisizione punti temporali.
   10. Avviare l'acquisizione time-lapse cliccando sul pulsante "statasto rt "per acquisire una sequenza di immagini.
       NOTA: E 'meglio non utilizzare la funzione di acquisizione più punti. Essa può causare la perdita di messa a fuoco o movimento del campo dell'imaging durante il time-lapse imaging.
2. Analisi di immagini acquisite
   NOTA: Acquisite le immagini possono essere riprodotte come file di filmato e analizzati utilizzando il software di analisi.
   1. Selezionare le immagini acquisite da inserire in un film. Se necessario, le regioni di taglio di interesse da immagini e selezionare interessanti punti temporali per ridurre le dimensioni del file del filmato utilizzando il software operativo.
   2. Esportare le immagini come file video in formato AVI o MOV. Selezionare un formato filmato dal menu a discesa "Formato" e la tempistica necessaria per il film finito, quindi fare clic su "Esporta". NOTA: time-lapse immagini acquisite in una sola volta punto ogni 5 minuti possono essere riprodotti come un film a 10 fotogrammi al secondo, che è 3.000 volte più veloce rispetto alla velocità effettiva.

Risultati

Per illustrare la tecnica, un EGFP lentivirus codifica (proteina fluorescente verde)-tag Cx43 (Connexin43) o un Cx43 mutato ³² è stato usato per esprimere le proteine ​​EGFP-tag nelle cellule, e una codifica adenovirus FGFR1DN (recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 1 negativo dominante ) è stato utilizzato per arrestare la segnalazione FGF nella cella ^33-35. Tre giorni dopo l'isolamento di cardiomiociti, i cardiomiociti isolati state trasdotte con lentivirus per esprimere prot...

Discussione

Cardiomiociti primari isolati da ratti neonati sono stati a lungo utilizzati per studiare le funzioni dei cardiomiociti in vitro. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cardiomiociti neonatali di cuccioli di ratto utilizzando un metodo di digestione enzimatica in due fasi, prima digestione con tripsina O / N a 4 ° C e poi collagenasi purificata. Un vantaggio di impiegare il passo collagenasi purificata è che lo stesso grado di enzima viene utilizzato per tutte isolamenti. Pertanto, la qu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Scissors for decapitation	WPI	501749	Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping	WPI	14393	Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes	Sigma	CLS430165	For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C	For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0.17-14-C	For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water	Sigma	E7148
2% Gelatin	Sigma	G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish	Sigma	CLS430165	For trypsinization
Aluminium foil	Any brand
Parafilm	Sigma	P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish	Sigma	CLS430165	For selection
Autopipette	Drummond Scientific	4-000-300	For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter	nexcelom		To check and count cells
Microscope and hematocytometer	Any brand		To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubator	Sanyo	MCO-19AIC
Incubating orbital shaker	Sigma	Z673129	To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution	BD Pharmingen	550891
DMEM, high glucose	invitrogen	41965039	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM	invitrogen	31095029	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum	invitrogen	26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	invitrogen	15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (serum-free medium)	invitrogen	31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)	Polysciences	24765-2	It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine	Sigma	C6628	Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES	Sigma	H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized	BD	309604
0.45 μm filters	Sigma	F8677	Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000	Sigma	81260
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium hydroxide	Sigma	S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes	Sigma	CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile	BD Falcon	353072	For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel	eppendorf	3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy	PerkinElmer	L7267000
A temperature-controlled chamber	Any brand		To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system	Any brand		Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine	invitrogen	18045-054	For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red	invitrogen	21063-029	For long time time-lapse imaging