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요약

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

초록

그들은 쉽게 하나의 절차에 많은 수에서 고립 될 수 있기 때문에 기본 쥐 신생아 심근 세포는 체외 심장 혈관 연구의 기본에 유용합니다. 인해 현미경 기술의 발전으로는 세포에 대하여 최소한의 광독성 우려 실시간으로 세포 사건을 조사하는 목적으로 생균 이미지를 캡처하는 비교적 용이하다. 이 프로토콜은 세포의 특성을 조절하는 렌티 바이러스 및 아데노 바이러스 전달 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경을 사용하여 기본 쥐 신생아 심근 세포 라이브 인터벌 영상을 촬영하는 방법에 대해 설명합니다. 바이러스의 2 종류의 애플리케이션이 쉽게 두 개의 다른 유전자에 대한 적절한 전달 속도 및 발현 수준을 달성 할 수있다. 잘 집중 생균 이미지는 오랜 기간 동안 안정을 유지 초점 현미경의 자동 초점 시스템을 사용하여 얻을 수있다. 이 방법을 적용, 외생 적 엔지니어의 기능일차 배양 된 세포에서 발현 에드 단백질은 분석 될 수있다. 또한,이 시스템은 siRNA를 사용을 통해뿐만 아니라 화학 조절제의 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수있다.

서문

차 쥐 신생아 심근 긴 시험관 1에 심근 기능을 조사하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지 잘 설립 방법 2-4으로 쥐 새끼에서 분리하기 쉽다. 가장 일반적인 방법은 콜라게나 또는 이전의 세포 격리에 심장의 결합 조직을 소화 트립신을 사용합니다. 연구원은 또한 성인 설치류 5-8뿐만 아니라 신생아 마우스 9,10에서 심근 세포를 분리하는 방법을 개발했습니다.

이 프로토콜은 두 단계의 효소 분해 절차를 이용하는, 신생아 래트 새끼로부터 심근 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 트립신은 처음 4 ° C에서 O / N을 사용하고, 37 ℃에서 다음 정제 된 콜라게나된다 4 ° C에서 트립신 O / N과 심장 조직의 배양은 따뜻한 효소 용액 2 연속 배양을 사용하는 방법에 비해 수확 세포에 필요한 단계를 줄일 수 있습니다. 또, 정제 된 CO를 이용하여llagenase 오히려 조 효소보다는, 로트 간 변동 따라서 향상된 재현성을 제공하고, 제거 할 수있다.

특정 단백질의 기능 연구는 종종 아데노 11-13 및 / 또는 14-16 렌티 바이러스를 이용하여 단백질 발현 시스템을 사용한다. [주의 메시지] 바이러스 생산 및 조작은 NIH의 지침에 따라 수행되어야한다.

아데노 바이러스는 숙주의 게놈에 통합되지 않습니다. 이는 분할 셀과 비 분할 세포를 포함하여 대부분의 세포 유형뿐만 아니라 일차 전지 및 확립 세포주에서의 형질 도입 매우 높은 효율을 갖는다. 이 아데노 바이러스 유전자 발현에 대한 신뢰할 수있는 벡터합니다. 아데노 바이러스 벡터에 의해 부호화 된 단백질의 높은 수준의 전달 다음 48 시간 내에 개발하고, 그들은 몇 주 동안 17 일을 지속 할 수있다. 그러나, 단백질 발현 아데노 바이러스를 사용하는 하나의 단점은 재조합 ADE의 개발novirus은 복잡하고 시간 소모적이다. 많은 연구자들은 재조합 유전자 발현에 lentiviruses에 의존 한 이유 단점은 부분적으로 설명합니다. 아데노 바이러스 구조와는 달리, 렌티 바이러스의 구조를 생성하는 것은 빠르고 쉽습니다. lentiviruses 전체적으로 모두 분할 및 비 - 분할 세포에서 아데노 바이러스 형질 도입의보다 낮은 효율을 가지고 있지만, 그들은 숙주 게놈에 통합 않는다. 결과적으로, 형질 도입 유전자의 발현은 아데노 바이러스에 비해 lentiviruses에 안정됩니다.

때문에, 현미경의 분야에서의 기술 진보로, 그것은 재조합 단백질을 발현하는 세포의 생균 이미지를 캡처하는 것이 훨씬 쉽다. 이도 취득 비디오 레이트 속도로 진정한 보유하고 있습니다. 이 조사는 관심의 단백질의 특정 변경이 기능적으로 실시간으로 세포에 영향을 미칠 방법을 결정 할 수 있습니다. 공 촛점 회전 디스크 현미경은 리브을위한 최적의 기술을 만드는 몇 가지 주요 기능을 가지고 있습니다전자 이미징 셀 (18, 19). 동시에 점 스캔 공 초점 현미경보다 훨씬 적은 레이저 파워를 이용하면서 요꼬 회전 디스크는, 훨씬 더 빠른 이미지 수집을 허용한다. 이러한 특징 모두는 레이저가 시료에 동시에 통과하는 다수의 구멍을 포함 촛점 스피닝 디스크에 기인한다. 획득 동안, 디스크 자체가 신속하고 지속적으로 18-20을 회전시킨다. 현미경의 자동 초점 시스템을 사용함으로써, 안정된 포커스는 장기간에 걸쳐 유지된다. 이 연구원은 잘 초점을 맞춘 라이브 셀 이미지를 촬영할 수 있습니다. 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생됩니다. 이미지는 그러한 ImageJ에 21,22 피지 23, 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다.

프로토콜

쥐 신생아 심근 1. 격리

  1. 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 배지 등의 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)와 보충 최소 필수 배지 (MEM)를 사용합니다. 분리 후의 제 2 일 동안 섬유 아세포의 성장을 방지하기 위하여 중간에 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)를 추가한다.
자료 매체 FBS BrdU의 (MM) P / S (U / ㎖)
선택 DMEM 10 % 0 (20)
첫 날 DMEM 10 % 0.1 10
이튿날 DMEM / MEM 5 % 0.1 10
또한 문화 DMEM / MEM 5 % 0 10

표 1. 쥐 신생아 심근에 대한 중간 쥐 신생아 심근 세포를 배양이 용지를 사용하십시오. DMEM / MEM은 DMEM과 MEM 배지 1:1로 혼합이다.

  1. 심근 격리, 1 일 (예상 소요 시간 약 1 시간)
    주 : 신생아 설치류와 작업의 경우, 동물 보호 프로그램에 의해 설정된 지역 대학 지침 및 규칙을 참조하고, 제도적으로 승인 된 동물 프로토콜을 준수합니다. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 예일 대학 동물 자원 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
    1. 시약과 도구를 준비 칼슘과 마그네슘이없는 행크의 균형 소금 솔루션 (CMF HBSS), 30 ㎖ × 2, 10 ㎖ × 2, 얼음; 얼음에 CMF HBSS 2 ㎖로 재구성 1 MG 트립신; 도구를 멸균; 70 % 250 ㎖의 비커에 에탄올 (EtOH로); 네 10cm 플라스틱 접시, 마음의 세 가지 격리와 트립신을 위해 하나를 살균.
    2. 순서 1 LITT실험 동물 인 분배에서 자신의 댐 1 - 투 - 2 일 된 쥐의 새끼 (약 10 새끼)의 어.
    3. 첫째날은, 작은 케이지에 새끼를 전송하고 케타민 / 자일 라진 칵테일 (케타민, 200ml/10g과 자일 라진의 20ml/10g) 과다 복용으로 댐을 안락사.
    4. 한 강아지를 타고 70 % EtOH로 그 몸 전체를 살균. 다른 새끼에서 고립 된 위치에 멸균 10cm 플라스틱 접시에 잘 유지 날카로운 수술 용 가위로 강아지 목을 벨.
      NOTE : 최대한 빨리 샘플을 수집하기 위해,이 설치류의 수명 종료를위한 가장 신속하고 효율적인 방법을 사용하는 것이 최선이다. 제대로 잘 유지 장비와 숙련 된 전문가에 의해 사용 참수는 동물 적은 두려움과 불안의 원인과 안락사의 다른 형태의보다 신속하고 현실적입니다. 그것은 동물의 안락사에 대한 미국의 의학 협회 가이드 라인의 권고와 일치합니다.
    5. 제거 그에게 구타멸균 된 도구와 기술, 50 ML 원뿔 관에 30 ㎖의 얼음 냉각 CMF HBSS에 마음을 넣어. 참고 : 가능한 한 빨리 마​​음을 제거하고 즉시 얼음에 넣어. 몸에서 마음을 제거한 후, 모든 절차가 얼음에 수행해야합니다.
    6. 얼음 냉각 CMF HBSS 30 ㎖와 얼음 냉각 CMF HBSS의 또 다른 30 ​​㎖의 나머지 5 마음에있는 5 마음을 수집합니다. 마음을 씻어 튜브를 소용돌이 친다. 참고 :이 단계 후, 층류 후드에있는 모든 절차를 수행합니다.
    7. 뜨는을 취소하고 얼음에 새로운 살균 10cm 플라스틱 접시에 마음을 전송할 수 있습니다. 참고 : 흡입기 마음을 흡인하지 않도록주의하십시오.
    8. 대형 선박 및 / 또는 바람직하지 않은 조직을 제거합니다. 마음을 씻어 접시에 얼음 냉각 CMF HBSS의 10 ML을 추가합니다.
    9. 얼음에 새로운 살균 10cm 플라스틱 접시에 모든 마음을 전송합니다. 얼음에 1 ㎜ 미만 3 가위로 마음을 말하다.
    10. 냉장 CMF HBSS의 10 ML을 추가합니다. 냉장 트립신 reconsti의 1 ML을 추가합니다CMF HBSS (최종 50 UG / ml)로 tuted.
    11. 파라 필름으로 요리를 밀봉하고 알루미늄 호일로 커버하고 차가운 방에서 (4 ˚ C)을 해 하룻밤 놓습니다.
  2. 심근 분리, 2 일 (예상 소요 시간 약 4 시간)
    1. 준비 시약 및 도구 : 50 ML 원뿔 튜브 × 2; 얼음 CMF HBSS 1 ㎖로 재구성이 MG 트립신 억제제; 실온 (RT)에서 Leibovitz L-15, 5 ㎖로 재구성 1500 단위 콜라게나; Leibovitz L-15, 멸균 물 1 리터로 재구성 및 0.22 마이크론 필터, 실온에서 8 ㎖를 통해 필터링; 물에 10 ㎎ / ㎖ (32.6 ㎜)의 BrdU; P / S; DMEM + 10 % FBS; MEM; 두 10cm 플라스틱 세포 배양 접시; 3.5 cm의 유리 바닥 요리.
    2. 둘째 날, 젤라틴 코팅 요리를 준비합니다. 코트 이미징 실험을위한 3.5 cm 유리 바닥 요리를 0.1 % 젤라틴 용액 1 ㎖를 추가합니다. 다음 대기음 사용하기 전에 젤라틴 용액을 버리고, 몇 시간 동안 37 ˚ C에서 접시를 품어.
      NOTE는 : 3.5 cm의 유리 바닥 요리는 형광 현미경을 이용하여 영상의 실험에 적합하다. 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 단백질 발현을 검출하는 차 심장 근세포에서 단백질을 추출, 0.1 % 젤라틴 코팅 플라스틱 세포 배양 접시를 사용할 수있다.
    3. 멸균 후드에서 얼음에 50 ML 원뿔 관에 버퍼 하룻밤 트립신 소화 모든 심장 조직을 전송합니다. CMF HBSS에있는 트립신 억제제 1 ㎖ (최종 182 UG / ㎖)를 추가합니다. 50 ML 원뿔 관의 덮개를 닫습니다 단단히 오염을 방지합니다.
    4. 조직을 따뜻하게 30-37 ˚ C로 버퍼에 37 ˚ C의 배양기에서 약 30 분 동안 튜브를 품어 Leibovitz L-15에 콜라 5 ㎖ (최종 94 단위 / ㎖)를 추가합니다. 부드러운이 (37 ˚ C 배양기에서 170 ~ 200 rpm으로 진탕)을 흔들면서 45 분 동안 37 ˚ C에서 알을 품다.
      주 :이 단계는 층류 후드 외부에서 수행 될 수있다. 이후의 모든 단계는 실온에서 수행해야합니다.
    5. 70 % EtOH로 50 ㎖ 원추형 튜브의 외측을 소독 넣어멸균 후드 그것.
    6. 20 시간 동안 속도의 3 ㎖ / 초에서 피펫 팅으로 자동 피펫을 사용하여 씹다 조직. 조직의 잔류 물 (70) 음 셀 스트레이너에 뜨는을 3 분 동안 정착 및 필터링 할 수 있습니다.
      참고 : 보통 크기 10 ㎖ 피펫은 분쇄를 위해 사용될 수있다.
    7. 나머지 조직 덩어리 씹다에 Leibovitz L-15의 5 ML을 추가하고 다시 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. Leibovitz L-15 2 ㎖의 셀 스트레이너를 씻으십시오.
    8. 콜라게나 제는 부분적으로 성능이 저하 된 콜라겐을 소화 할 수 있도록 60 분 - 20 후드 필터 셀 솔루션을 놓습니다.
    9. 5 분 동안 100 × g에서 침전물 세포. 10 % FBS 및 고농도의 P / S (20 U / ㎖) 함유 DMEM 20 ㎖에 세포를 다시하는 것은 일시 중지.
    10. 심근 선택을위한 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 1 시간 동안 두 10cm 플라스틱 세포 배양 접시에 미리 플레이트 세포. 참고 : 섬유 아 세포가 심근보다 접시의 바닥에 더 쉽게 연결합니다.
    11. ㅁ일 대기는, DMEM은 10 % FBS, P / S (10 U / ㎖) 및 0.1 ㎜가 BrdU를 포함한 제조. 10 % FBS 및 P / S를 포함하는 DMEM의 325 밀리리터에 10 ㎎ / ㎖ BrdU의 1 ML을 추가합니다
    12. 부드럽게 요리를 소용돌이 두 10cm 접시에서 심근 세포가 포함 상층 액을 수집합니다.
      주 : 대부분의 심근은 여전히​​ 배양 1 시간 후 상층에 떠있는 것입니다. 가볍게 접시에 부착 된 섬유 아 세포가 오염되는 것을 방지하기 위해, 피펫으로 상층 액을 수집하지 않습니다.
    13. 선택> 세포 생존을 확인하는 트리 판 블루로 0.2 %없이 뜨는 세포를 계산합니다.
    14. 5 분 동안 100 × g에서 침전물 세포. 10 % FBS, P / S (10 U / ㎖) 및 0.1 ㎜가 BrdU를 함유하는 DMEM에서 셀을 다시하면 중지 모드. 현미경을 이용하여 관찰 젤라틴 코팅 3.5 cm의 유리 바닥 접시에 2 × 10 5 세포 / 요리의 플레이트 세포. 참고 : 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 최소 24 시간 동안 도금 한 후 세포를 방해하지 마십시오
    15. 3 일, 차NGE 매체 24 시간, 5 % FBS, P / S 및 0.1 ㎜가 BrdU를 함유하는 DMEM / MEM에 도금 후.
    16. 하루 4, 5 % FBS 및 P / S가 포함 된 DMEM / MEM에 도금 후 매체 48 시간 변경
      주 : 5 % FBS 및 P / S가 포함 된 DMEM / MEM으로 2-3 일마다 중간 변경

2. 렌티 바이러스 전달

  1. 렌티 바이러스 플라스미드의 포장
    참고 :이 주제에 24 ~ 26에 대한 더 깊이있는 정보를 다른 소스를 참조하십시오. 그것은 렌티 바이러스 솔루션을 준비하기 위해 약 3 일 소요됩니다. 그것은 높은 전달 효율을 달성하기 위해 신선한 렌티 바이러스 솔루션을 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다. 렌티 바이러스 플라스미드 병렬 쥐 신생아 심근 고립의 포장을 시작합니다. 대신 렌티 바이러스 플라스미드 포장용 폴리에틸렌 이민 (PEI) (27)를 사용하는 상업적으로 이용 가능한 형질 감염 시약을 사용할 수있다. 제조업체의 지침을 따르십시오.
    1. 시약과 도구를 준비; HEK293T 세포, 10cm 플라스틱 세포 배양 접시, 렌티 바이러스 플라스미드 솔루션 (pMDLg / pRRE, pRSV 반전, pMD2.G, 렌티 바이러스 전이 벡터, 1.0 ㎎ / ㎖ 각) 1 G / L PEI, 혈청 배지, 20 mM의 70 % EtOH로 물에 클로로퀸, 10 %의 표백제, 1 % SDS
    2. 일 0, 10cm 당 2 ~ 2.5 × 10 6 HEK의 293T 세포 형질 전날 접시 접시.
      참고 : 형질에 30-60% 합류 최적입니다.
    3. 1 일, PEI 형질 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML 튜브에 960 UL의 혈청 배지 1 G / L PEI의 30 UL을 추가합니다. 1.5 ML 튜브에 PEI 형질 용액에 4 플라스미드를 추가하고 도청과 혼합.
    플라스미드의 이름 주의 크기 (KBP) 볼륨 추가 (ML) 10cm 접시에 최종 금액 (MG) 10cm 접시 (PM)의 최종 농도
    렌티 바이러스 전이 벡터 포장하는 유전자를 인코딩 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 (60)
    pMDLg / pRRE HIV-1 GAG / POL을 표현 8.8 1.76 1.76 (30)
    pRSV 반전 HIV-1 REV를 표현 4.1 0.82 0.82 (30)
    pMD2.G VSV G에게 표현 5.8 1.16 1.16 (30)

    표 2. 렌티 바이러스 포장에 대한 플라스미드의 양이 10cm 접시에 HEK293 세포를 형질이 플라스미드 금액을 사용합니다. 접시 당 렌티 바이러스 전이 벡터의 최종 금액은 그 크기에 따라 차이가 60 pm에 접시 당 최종 농도를 유지할 수있다. 이중 가닥 DNA의 하나의 염기쌍의 평균 분자량이 660 달톤이다.

    1. 오래된 매체를 폐기부드럽게 10cm의 HEK의 293T 세포의 요리, 그리고에서 새로운 매체의 10 ML을 추가 (DMEM + 10 % FBS, P / S 제외).
    2. PEI-DNA 혼합물을 추가 부드럽게 접시에 방향을 드롭하고 부드럽게 매체를 혼합하는 소용돌이 친다. 10 ㎖ 매체에 20 밀리미터 클로로퀸 (최종 20 μM의)의 10 UL을 추가합니다. NOTE : 클로로퀸은 리소좀 구획 (28) 내에서 pH를 부분 중화 통해 플라스미드를 함유하는 형질 감염 복합체의 분해를 감소시킬 것으로 생각된다.
    3. 6 시간 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 배양한다. 이어서, PEI-DNA 혼합물을 함유하는 배지를 제거하고 새로운 배지 10 mL를 넣고 (DMEM + 10 % FBS + 20 mM의 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), pH 7.4로 + P / S) . 참고 : 부화 후, 바이러스는 매체에서 생산됩니다. 흡인 파스퇴르 피펫 및 / 또는 팁은 10 % 표백제로 소독해야합니다. 항상 생물 안전 캐비닛 표면의 오염을 제거에 관계없이 상층 액이 유출되었는지 여부의 70 % EtOH로 잠재적으로 오염 된 장비또는 없습니다. 유출이 발생한 경우, 70 % EtOH로 1 % SDS와 철저한 소독이 필요합니다.
    4. 하루 2-3, 콜로라도에 품어 48 ~ 72 시간. 4 일 37 ˚ C에서 인큐베이터는 렌티 바이러스 솔루션 (2.2 절에 계속) 수집합니다.
      참고 : 중간 형질 전환 후 48 시간에서 변경 될 수 있습니다. 두 바이러스 상층 액을 48 시간과 72 시간을 수집하는 것은 높은 역가의 바이러스 솔루션을 얻기 위해 달성 할 수 있습니다.
  2. 렌티 바이러스 솔루션 및 전달의 컬렉션
    1. 시약과 도구를 준비 : 15 ML 원뿔 튜브, 1 M HEPES, pH 7.4로 (0.22 음 필터링)
    2. 4 일이, 루어 코리아 주사기 멸균 10 ml의 렌티 바이러스 입자 (렌티 바이러스 솔루션)를 포함하는 상층 액을 수집 한 후 0.45를 통해 뜨는을 필터링 음 15 ML 원뿔 튜브에 필터링합니다. 필터링 된 렌티 바이러스 솔루션 (최종 10 MM) 1 M HEPES pH 7.4로의 1 / 100 볼륨을 추가합니다.
      참고 : 필터링 만 셀룰로오스 에이스를 사용테이트 또는 폴리 에테르 설폰 (PES) (낮은 단백질 바인딩) 필터. 니트로 셀룰로오스 필터를 사용하지 마십시오. 니트로 셀룰로오스는 렌티 바이러스 봉투 표면 단백질을 결합하여 바이러스를 파괴합니다.
    3. 섹션 1.2의 마지막 단계에서 얻은 쥐 신생아 심근 3.5 cm 요리에서 매체를 제거, 3.5 cm 접시에 필터링 된 렌티 바이러스 용액 1 ㎖를 추가합니다.
    4. hexadimethrine 브로마이드 (최종 농도 4-6 UG / ㎖)를 추가 .
      참고 : Hexadimethrine 브로마이드는 렌티 바이러스 전달 효율을 향상시킬 수 있습니다. hexadimethrine 브로마이드의 농도가 최적화되어야한다.
    5. 렌티 바이러스 전달 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 6 시간 동안 접시를 품어 후, 5 % FBS 및 P / S가 포함 된 새로운 DMEM / MEM 중간 변경 3 일 동안 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 접시를 품어.
      참고 : 렌티 바이러스에 의한 호스트 게놈에 외래 유전자의 통합이 72 시간에 완료 될 것으로 간주됩니다.
    7. 주 7은, 다음 단계를 위해 단계 2.2.5 세포를 사용한다. 참고 : 렌티 바이러스 플라스미드에서 단백질 발현은 상대적 발현 수준을 결정하기 위해 전달의 48 ~ 72 시간 후 WB 또는 면역 세포 화학 (ICH)에서 확인 할 수있다 (그림 1A와 1B).
  3. 렌티 바이러스 용액의 농도
    참고 : 그것은 렌티 바이러스 용액 역가가 충분히 높지 않을 경우, 높은 형질 도입 효율을 달성하기 위해 신선 렌티 바이러스 액을 사용하는 것이 최선이며, 렌티 바이러스 용액은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전 (29)에 의해 농축 될 수있다.
    1. 4X PEG 용액 (32 % PEG6000, 400 mM 염화나트륨 (염화나트륨), 40 mM의 HEPES pH 7.4로)의 제조
      1. 125 ㎖의 4 배 PEG 솔루션의 경우, PEG6000 40g의 무게를 한 후 60 ㎖의 물에 용해.
        NOTE : NOTE : (. 즉 PEG6000의 평균 분자량은 6000이다) PEG 후의 개수 평균 분자량
        참고 : 2.3.1.2) 천천히 10 ㎖를 추가5 M의 NaCl. 천천히 1 M HEPES pH 7.4로 5 ㎖를 추가합니다. 2 M 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
        참고 : 2.3.1.3) 125 ㎖의 물을 추가합니다. 0.22 UM 멤브레인 필터로 여과하여 4X PEG 용액을 멸균하고 4 ˚ C.에서 보관
    2. 렌티 바이러스 농도
      1. 필터 렌티 바이러스는 0.45 음 필터를 사용하여 새로운 50 ㎖ 튜브에 뜨는을 형질 도입.
        참고 : 뜨는 1:3) : 2.3.2.2) 배 PEG 용액에게 1시 3분 비율 (PEG 솔루션을 추가합니다. 16-48 시간 동안 4 ˚ C에서 보관하십시오.
        참고 : 30 분 4 ˚ C에서 2,600 X g에서 2.3.2.3) 원심 분리기. 5 분 동안 4 ˚ C에서 2,600 X g에서 뜨는 원심 분리기를 폐기하십시오.
        참고 : 2.3.2.4) 펠렛을 방해하지 않도록주의 상층 액을 버린다. 다시 일시 1 / 2을 일본어 상청 양의 1 / 25 부피로 사용하여 무 혈청 배지에서 펠릿.
        참고 : 2.3.2.5)를 직접 사용하거나 다음 -80 ˚ C에서 보관 액체 질소를 사용하여 동결

3. 아데노 바이러스 전달

참고 : 아데노 바이러스 구조 (13)의 건설 및 전파 방법에 대한 다른 소스를 참조하십시오. 흡인 파스퇴르 피펫 및 / 또는 팁은 10 % 표백제로 소독해야합니다. 항상 생물 안전 캐비닛 표면의 오염을 제거하고 잠재적 관계없이 상층 액이 유출되었는지 여부의 70 % EtOH로 장비 오염. 유출이 발생한 경우, 70 % EtOH로 1 % SDS와 철저한 소독이 필요합니다.

  1. 50 % 조직 배양 감염 량에 의한 아데노 바이러스 적정 (TCID 50)
    참고 : 전달하기 전에, 그것은 아데노 바이러스 원액을 적정 할 필요가있다. TCID 50 바이러스 용액을 적정 할 수있는 가장 좋은 방법 중 하나이다. 이 방법은 TCID 50를 계산 HEK 293T 세포에 감염 용량으로 역가를 평가하기 때문에 아데노 바이러스 주식의 실제 infectability을 반영한다. PFU (플라크 형성 유니TS) 약 0.56 (30)의 인자 TCID (50)에 비례한다.
    1. HEK의 293T 세포, 10cm 세포 배양 접시, 96 - 웰 바닥이 평평한 세포 배양 접시, 8 채널 멀티 피펫 : 세포와 도구를 준비
    2. 한 10cm 접시에 70~90% 합류하는 HEK 293T 세포를 준비합니다.
    3. 바이러스 주식의 1 / 10 (4)의 사전 희석을 수행합니다. 96 - 웰 평판 바닥 세포 배양 플레이트의 각 웰에 DMEM + 10 % FBS 50 UL 추가. 에서 H.에, 첫 번째 행에 사전 희석 바이러스 주식의 25 UL 추가
    4. 잘 혼합하고 8 채널 멀티 피펫으로 두 번째 행에 우물의 첫 번째 행에서 25 UL를 전송합니다. 1 / 3까지 우물의 각 행에 바이러스 솔루션의 희석과 11 행을 포함하여 반복하고 지난 25 UL을 버린다.
    5. 씹다 HEK의 293T의 DMEM + 10 % FBS 10 ML에 세포. 1 ~ 12 행에서 각 웰에 세포 솔루션의 50 UL을 추가합니다.
    6. 11~13일에 CO2 배양기에서 37 ˚ C에서 세포를 품어. DMEM + 1의 50 UL 추가4-5일 도금 7 ~ 8 일 후에 0 %의 FBS.
    7. 감염 다음 11-13일에서 각 웰의 세포 변성 효과를 측정한다.
    레인 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    행 디 디 디 디 디 디 디 디 디
    행 B 디 디 디 디 디 디 디 디 디
    행 C 디 디 디 디 디 디 디 디 디
    행 D 디 디 디 디 디 디 디
    행 E 디 디 디 디 디 디 디 디 디 디 디
    행 F 디 디 디 디 디 디 디
    행 G 디 디 디 디 디 디 디 디
    행 H 디 디 디 디 디 디 디 디 디 디 디
    한 줄에 긍정적 인 우물의 수 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    한 줄에 긍정적 인 우물의 비율 1 1 1 1 1 1 1 825 0.63 0.25 0.25 0
    디 50 %의 세포 변성 효과를 통해 표시
    50 %가없는 세포 변성 효과에 따라 표시

    레인 1, 희석 3 1 10 배 4; 레인 2, 희석 3 2 10 배 4; ...; 레인 11, 희석 3 2 10 배 11; 레인 (12), 제어 할 수 있습니다.
    S는 한 줄에 긍정적 인 우물의 비율의 합 =
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0.75 +0.63 +0.25 +0.25 +0 = 8.875
    TCID 50 = 3 × 10 4 × 3 × (8.875-0.5) = 2.97 × 10 8
    TCID 50 / ㎖ = 5.94 × 10 9

    표 3. 감염된 96 잘 판 (10) 일 배양 후 각 웰의 세포 변성 효과를 측정하고 한 줄에 긍정적 인 우물의 비율의 합계의 예.

    1. Kaerber의 공식에 따라 역가를 계산 31.
    2. TCID 50 = (첫 번째 차선의 희석) × (희석) (S-0.5)
    3. S는 한 줄에 긍정적 인 우물의 비율의 합 =
      참고 :이 프로토콜에 대한, TCID 50 = (30000) × (3) (S-0.5). 바이러스 용액 (50)은 UL이 프로토콜에서 사용되기 때문에, TCID 50 / ㎖을 계산할 0.05 TCID 50를 나눈다.
  2. 아데노 바이러스 전달
    1. 그 역가 (PFU / ㎖, ML 또는 TCID 50 / ㎖ 바이러스 입자 /)에서 아데노 바이러스 솔루션의 필요한 양을 계산합니다. MOI (감염의 다중성)를 계산하는 공식을 사용합니다.
    2. EM> [여기 장소 표 4]
    3. 무 혈청 배지로 바이러스 용액의 계산 된 양을 추가 (표 5 참조). 잘 섞어 실온에서 20 분 동안 품어.
    4. EM> [여기 장소 표 5]
    5. DAY7, 섹션 2.2의 마지막 단계에서 얻은 접시를 가지고, 5 % FBS 및 P / S가 포함 된 새로운 DMEM / MEM 750 UL과 매체를 대체
      주 : 매체 볼륨의 감소원래 볼륨의 50 %로 전달에 높은 전달 효율을 위해 중요하다.
    6. 요리에 희석 바이러스 솔루션을 추가합니다. 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 4-8 시간 동안 접시를 품어 그런 다음, 새로운 배지로 교체.
    7. 37 ˚ C에서 CO 2 배양기에서 48 시간 동안 접시를 품어 하루 8-9에서 라이브 세포 이미징 실험을위한 세포를 사용합니다. NOTE : 아데노 바이러스 플라스미드의 단백질 발현은 상대적 단백질 발현 수준 (도 1C 및 1D)를 결정하기 위해 전달의 24-48 시간 후에 WB 또는 ICH에 의해 확인 될 수있다.

4. 라이브 셀 이미징

  1. 온도 조절 챔버와 공 촛점 회전 디스크 현미경 및 CO 2 환경 시스템 (선택 사양)를 사용하여 이미지 수집
    1. 모든 장치가 종래의 취득 개시를 37 ˚ C로 평형화되도록 종래 취득 적어도 1 시간에 온도 제어 시스템을 켜고. confoc를 켭니다알 디스크 현미경 시스템 (PC 작업, 현미경, 회전 디스크 장치, CCD 카메라, 레이저, 형광등 광원, 일반 광원, 동력 단계, 자동 셔터)를 회전합니다.
      주 : 1 개 이상의 시간이 모든 장치의 전체 온도 평형을 달성 할 필요가있다.
    2. 필요한 경우, 인수에 원하는 매체에 3.5 cm의 유리 바닥 요리 매체를 변경합니다. 온도 조절 챔버에서 공 촛점 회전 디스크 현미경의 무대에서 접시를 놓습니다.
      참고 : 때문에 1.5 호 커버 유리와 3.5 cm 유리 바닥 접시 (약 0.16-0.19 mm 두께)의 현미경을 이용하여 최적의 관측에 구면 수차에 이상적입니다. 사용하는 목적은 보정 고리가있는 경우, 0.17 mm보다 두꺼운 커버 유리로 수득 이미지는 보정 될 수있다. 또한, 페놀 레드는 약간의 형광을 가지고 있습니다. 때때로 그것은 페놀 레드없이 DMEM 등으로서 페놀 레드없는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. CO를 제어하는​​ 장치가 없으면 2 농도, 사용하는 것이 좋습니다 CO 2 독립적 인 장기 시간 경과 이미징 HEPES로 완충 매체 또는 매체.
    3. 접안 렌즈로 빛의 경로를 선택합니다.
    4. 에 밝은 필드 광원의 셔터를 켭니다. 접안 렌즈를 통해 현미경으로 세포에 초점을 조절합니다. 시야 광원 오프 셔터를 켭니다.
    5. 에 형광 광원의 셔터를 켭니다. 접안 렌즈를 통해 현미경으로 형광 단백질을 발현하는 세포를 찾을 수 있습니다. 형광 광원 오프 셔터를 켭니다.
    6. 선택> 보도 시간 경과 수집하는 동안 지속적인 초점을 유지하기 위해에 완벽한 초점 시스템을 설정하는 현미경의 앞에 완벽한 초점 시스템의 활성화 버튼을 누릅니다.
    7. 회전하는 디스크 공 초점 현미경으로 빛의 경로를 변경합니다. 적절하게 이미지 진열대를 확인, 운영 소프트웨어를 사용하여 수집을위한 설정을 조정합니다화면에 YED. (예를 들어, 초점, 레이저 출력, 노출 시간, CCD 카메라의 이득 및 오프 세트)
    8. 운영 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지 획득을위한 집합 설정. 예 : 채널 하나 EGFP에서 형광 신호를 획득하는 "빛의 경로를 사용하여 채널을 변경"과 "EGFP 채널 1"을 선택합니다.
    9. 운영 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 이미지를 취하기 위해 시간 경과 설정을 구성하여 시간 점 사이의 주파수를 설정합니다. 예 : 한 번 소수점 5 분마다 획득하려면, 드롭 다운 메뉴에서 "시간 - 포인트 당 분"을 선택하고 텍스트 필드에 5를 입력합니다.
      주 : 실제의 속도로 영화를 만들기 위해 "최고 속도"를 선택합니다. 형광 단백질의 발현이 낮은 경우에, 형광 경과 취득 중에 신속 표백있다. 그 경우는 획득 시간 포인트의 수를 줄이는 것이 좋다.
    10. "역을 클릭하여 시간 경과 수집을 시작합니다이미지 시퀀스를 획득하기 위해 RT "단추.
      주 : 다중 포인트 획득 기능을 사용하지 않는 것이 더 낫다. 그것은 시간 경과 이미징 동안 영상 분야의 초점 또는 운동의 손실이 발생할 수 있습니다.
  2. 획득 된 영상의 분석
    NOTE : 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생 및 분석 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있다.
    1. 동영상에 포함되는 획득 된 영상을 선택한다. 필요한 경우, 자르기 이미지에서 관심 영역과 운영 소프트웨어를 이용하여 동영상의 파일 크기를 감소시키는 흥미로운 시간 포인트를 선택한다.
    2. AVI의 동영상 파일 또는 MOV 형식으로 이미지를 내 보냅니다. "형식"드롭 다운 메뉴와 완성 된 동영상에 필요한 타이밍에서 영화 형식을 선택한 다음 "내보내기"를 클릭합니다. 참고 : 5 분마다 실제 속도보다 3,000 배 빠른 초당 10 프레임에서 동영상으로 재생 될 수있는 한 시간이 시점에서 획득 한 시간 경과 이미지.

결과

기술, 렌티 바이러스 부호화 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) 태그 Cx43 (connexin43에) 또는 세포에서 EGFP-태그 된 단백질을 표현하는 데 사용 된 돌연변이 Cx43 (32), 및 아데노 인코딩 FGFR1DN (섬유 아세포 성장 인자 수용체 1 우성 네거티브를 설명하기 위해 ) 세포 33-35에서 FGF 신호를 종료하는 데 사용되었다. 심근 세포의 분리는 다음과 같은 세 가지 일, 절연은 심근 세포에서 EGFP-태그 된 ...

토론

신생아 쥐에서 분리 된 주요 심근 긴 체외에서 심근의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 처음 4 ° C에서 트립신 O / N로 소화 한 후 정제 된 콜라게나, 두 단계의 효소 소화 방법을 사용하여 쥐의 새끼에서 신생아 심근의 분리하는 방법을 설명합니다. 정제 된 콜라겐 분해 공정을 이용하는 하나의 장점은 효소의 동일 등급 모두 아이솔레이션을 위해 사용된다는 점이다. 따라...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

We would like to thank Dr. Alengo Nyamay'antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 scissors for decapitationWPI501749Autoclave before use
1 fine scissors for heart isolation and choppingWPI14393Autoclave before use
2 fine forceps (Dumont No. 5)SigmaF6521Autoclave before use
Three sterilized 10 cm plastic dishesSigmaCLS430165for hearts isolation
3.5 cm glass bottom culture dishesMatTekP35G-1.5-20-Cfor final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm glass bottom culture dishesMatTekP35G-0.17-14-Cfor TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70 % (v/v) in waterSigmaE7148
2% gelatinSigmaG1393
One sterilized 10 cm plastic dishSigmaCLS430165for trypsinization
Aluminium foilany brand
parafilmSigmaP7543
Two 10 cm plastic cell culture dishSigmaCLS430165for selection
Auto pipetteDrummond Scientific 4-000-300for trituration
Cell counter
  Cellometer, automated cell counternexcelomto check and count cells
  Microscope and Hematocytometerany brandto check and count cells
Trypan Blue Solution, 0.4%invitrogen15250-061
CO2 incubatorSanyoMCO-19AIC
incubating orbital shakerSigmaZ673129to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solutionBD Pharmingen550891
DMEM, High Glucoseinvitrogen41965039Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEMinvitrogen31095029Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal Bovine Seruminvitrogen26140079
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) invitrogen15140-122
Section 2 lentiviral transduction
three packaging plasmids
 pMDLg/pRREAddgene12251
 pRSV-RevAddgene12253
 pMD2.GAddgene12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (serum-free medium)invitrogen31985070
transfection reagent
  polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) Polysciences24765-2It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
  X-tremeGENE 9Roche6365779001substitute for PEI as transfection reagent
chloroquineSigmaC6628dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPESSigmaH3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilizedBD309604
0.45 um filtersSigmaF8677use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromideSigmaH9268dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
polyethylene glicol 6000Sigma81260
Sodium chlorideSigmaS9888
sodium hydroxideSigmaS5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cellsATCCCRL-11268
Some 10 cm cell culture dishesSigmaCLS430165
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterileBD Falcon353072for titration
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channeleppendorf3122 000.035
Section 4 live cell imaging
Spinning disk confocal microspopyPerkinElmerL7267000
a temperature controlled chamberany brandto keep temperature at 37 C
a CO2 environmental systemany brandoptional to maintain CO2 concentration optimal
Medium
  CO2 Independent Medium, No Glutamineinvitrogen18045-054  for long time time-lapse imaging
  DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red invitrogen21063-029for long time time-lapse imaging

참고문헌

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