Живых изображений сотовый первичных Rat неонатальных кардиомиоцитов После Аденовирусный и Лентивирусов Трансдукция Использование конфокальной вращающийся диск микроскопия

Резюме

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Аннотация

Первичный крыс неонатальные кардиомиоциты могут быть использованы в основном в пробирке сердечно-сосудистых исследований, поскольку они могут быть легко изолированы в больших количествах в одной процедуры. Благодаря достижениям в области микроскопа технологии это относительно легко для захвата изображений живых клеток с целью исследования клеточных событий в режиме реального времени с минимальным беспокойством относительно фототоксичности к клеткам. Этот протокол описывает, как взять живые клетки интервальная съемка фотографий первичных крысиных неонатальных кардиомиоцитов с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп следующие лентивирусным и аденовирусной трансдукции модулировать свойства клетки. Применение двух различных типов вирусов облегчает достижение соответствующего уровня ставок трансдукции и экспрессии для двух разных генов. Хорошо сфокусированных изображений живых клеток могут быть получены с использованием автоматической фокусировки системы микроскопа, который поддерживает стабильную фокусировку в течение длительных периодов времени. Применяя этот метод, функции экзогенно инженераред белки, экспрессированные в культивируемых первичных клеток могут быть проанализированы. Кроме того, эта система может быть использована для изучения функции генов с использованием киРНК а также химических модуляторов.

Введение

Первичные крысы неонатальные кардиомиоциты уже давно используются для исследования функции кардиомиоцитов в пробирке ^1. Они легко изолировать от крысят несколькими хорошо известными способами ^2-4. Наиболее распространенным методом работают коллагеназы или трипсин, чтобы переварить соединительной ткани сердца до выделения клеток. Исследователи также разработали методы выделения кардиомиоцитов из взрослых грызунов ^5-8, а также новорожденных мышей ^9,10.

Этот протокол описан способ выделения кардиомиоцитов из неонатальных детенышей крыс, используя процедуру ферментативному перевариванию двухступенчатый. Трипсин первом использовании O / N при 4 ° С, а затем очищенный коллагеназы при 37 ° С Инкубация ткани сердца с помощью трипсина O / N при 4 ° С уменьшает шаги, необходимые для сбора урожая клеток по сравнению с методами, использующими последовательные инкубации в теплом растворе фермента ^2. Кроме того, с помощью очищенного COllagenase, а не сырой ферментов, много к партии изменчивость может быть устранена, тем самым обеспечивая повышенную воспроизводимость.

Функциональные исследования конкретного белка часто используют систему экспрессии белка с использованием аденовирус ^11-13 и / или ^14-16 лентивирусов. [Примечание по] Вирусный производство и манипуляции должны проводиться в соответствии с рекомендациями NIH.

Аденовирус не интегрируется в геном хозяина. Она имеет очень высокую эффективность трансдукции в большинстве типов клеток, в том числе делящиеся клетки и не-делящихся клеток, а также первичных элементов и установленных клеточных линий. Это делает аденовирус надежным вектор для экспрессии генов. Высокие уровни белка, кодируемого вектором аденовируса развивать в течение 48 часов следующего трансдукции, и они могут продолжаться в течение нескольких недель ^17. Однако один недостаток использования аденовирус для экспрессии белка в том, что развитие рекомбинантного адекватноnovirus является одновременно сложным и трудоемким. Этот недостаток отчасти объясняет, почему многие исследователи обращаются к лентивирусы для выражения рекомбинантного гена. В отличие от аденовирусных конструкций, создавая лентивирусов конструкцию быстро. Хотя лентивирусы как правило, имеют более низкую эффективность трансдукции, чем аденовирусы, в обоих разделительных и не делящихся клеток, они интегрируются в геном хозяина. Следовательно, выражение гена трансдуцированных является более стабильным, чем для лентивирусов для аденовирусов.

В связи с технологическими достижениями в области микроскопии, это намного проще, чтобы захватить клетки изображения живых клеток, выражающих рекомбинантных белков. Это справедливо даже на скоростях Оценить видео приобретения. Это позволяет исследователю определить, как определенные изменения в интересующего белка функционально воздействовать на клетки в реальном времени. Конфокальной вращающийся диск микроскоп имеет несколько ключевых особенностей, которые делают его оптимальным методом для Ливе ячейки изображения ^18,19. Вращающегося диска Yokogawa позволяет гораздо более быстрого получения изображения, в то же время используя гораздо меньше мощности лазера, чем точка сканирующей конфокальной микроскопии. Обе эти особенности обусловлены вращающийся диск, который содержит многочисленные конфокальных отверстия, через которые проходит лазерный одновременно с образцами. Во время приобретения, сам диск вращается быстро и непрерывно ^18-20. С помощью автоматической фокусировки систему микроскопа, устойчивый фокус сохраняется в течение длительного периода времени. Это позволяет исследователям принять целенаправленных изображения живых клеток. Приобретенные изображения воспроизводятся как видеофайл. Изображения анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ ^21,22, Фиджи ²³ или другого имеющегося в продаже программного обеспечения.

протокол

1. Выделение крыс неонатальных кардиомиоцитов

1. Использование модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) и минимальную поддерживающую среду (MEM) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина / стрептомицина (P / S) в качестве культуральной среды. Добавить бромдезоксиуридин (BrdU) в среду, чтобы предотвратить рост фибробластов в течение первых 2 дней после изоляции.

	База среднего	FBS	BrdU (мМ)	P / S (U / мл)
выбор	DMEM	10%	0	20
Первый день	DMEM	10%	0.1	10
На следующий день	DMEM / MEM	5%	0.1	10
Далее культура	DMEM / MEM	5%	0	10

Таблица 1:. Среда для крыс неонатальных кардиомиоцитов Используйте это средства массовой информации для культивирования крысы новорожденных кардиомиоцитов. DMEM / MEM 1:1 смесь DMEM и MEM среде.

1. Изоляция кардиомиоцитов, день 1 (Оценочная требуется время, приблизительно 1 час)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с новорожденных грызунов, обратитесь к местным требованиям университета и правилами, установленными программами по уходу за животными, и придерживаться институционально одобренных протоколов животных. Все способы, описанные в этом протоколе были утверждены в Институциональная уходу и использованию животных комитета Йельского ресурсного центра животных на.
   1. Подготовка реагентов и инструменты: сбалансированный солевой раствор кальция и магния-Free Хэнка (CMF HBSS), 30 мл х 2, 10 мл х 2, на льду; 1 мг трипсина, восстановленный с 2 ​​мл CMF HBSS, на льду; автоклавного инструментов; 70% этанол (EtOH) в 250 мл химический стакан; четыре стерилизовать 10 см пластиковой посуды, три для изоляции сердца и один для трипсинизации.
   2. Заказать 1 Литтэ из 1-к-2-дневных крысят (около 10 щенков) с их плотины от экспериментального животного дистрибьютора.
   3. День 1, трансфер щенков в маленькой клетке и усыпить плотину с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200ml/10g и ксилазина 20ml/10g) передозировка.
   4. Возьмите одного щенка и стерилизовать все его тело с 70% этанола. Обезглавьте щенка с ухоженными острыми хирургическими ножницами на стерилизованной 10 см пластиковую чашку в месте, изолированном от других щенков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы собрать образцы как можно быстрее, лучше всего использовать самый быстрый и эффективный способ для прекращения жизни грызуна. Обезглавливание при правильном использовании квалифицированными специалистами с благоустроенной оборудования может привести к меньшим страхом и тревогой за животным и быть более быстрым и практичным, чем другие формы эвтаназии. Это согласуется с рекомендациями Американской Ветеринарной Руководства Ассоциации медицинских для эвтаназии животных.
   5. Удалить побоевискусство стерилизованными инструментами, и положил сердце в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS в 50 мл коническую трубку. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите сердца как можно быстрее и положить их на лед сразу. После удаления сердца от тела, все процедуры нужно делать на льду.
   6. Сбор 5 сердца в 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS, а остальные 5 сердца в еще 30 мл ледяной охлажденной CMF HBSS. Вихревой трубки для полоскания сердца. ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, выполнить все процедуры ламинаре.
   7. Удалите супернатант и передать сердца к новому стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не для аспирации сердца с аспиратором.
   8. Удалить крупных сосудов и / или нежелательные ткани. Добавьте 10 мл ледяной охлажденной CMF HBSS к блюду, чтобы ополоснуть сердца.
   9. Перенесите все сердца на новый стерилизованного 10 см пластиковую чашку на льду. Фарш сердца ножницами до менее 1 мм ³ на льду.
   10. Добавить 9 мл охлажденной CMF HBSS. Добавьте 1 мл охлажденной трипсина reconstituted с CMF HBSS (конечная 50 мкг / мл).
   11. Закройте блюдо парафильмом и покрыть ее с алюминиевой фольгой, затем поместить его в холодной комнате (4 ˚ C) в течение ночи.
2. Изоляция кардиомиоцитов, День 2 (Расчетное требуется время, около 4 часов)
   1. Подготовка реагентов и инструменты: 50 мл коническую трубку х 2; 2 мг ингибитора трипсина, восстанавливают 1 мл CMF HBSS, на льду; 1500 единиц коллагеназы, восстановленный с 5 мл Лейбовиц L-15, при комнатной температуре (RT); Лейбовиц L-15, восстановленный с 1 л стерилизованной воды и фильтруют через 0,22 микронный фильтр, 8 мл при комнатной температуре; 10 мг / мл (32,6 мМ) BrdU в воде; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; два 10 см пластиковые клеточных культур блюда; 3,5 см со стеклянным дном блюда.
   2. День 2, Подготовка желатиновые покрытием блюда. Добавьте 1 мл 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть нижнюю тарелку 3,5 см стекло для эксперимента изображений. Выдержите блюда при 37 ˚ С в течение нескольких часов, а затем аспирации и отказаться раствор желатина перед использованием.
      НЕТTE: 3,5 см со стеклянным дном блюдо подходит для эксперимента изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Для извлечения белков из первичных кардиомиоцитов обнаружить экспрессию белка помощи вестерн-блоттинга (ВБ), 0,1% желатина покрытием пластиковые клеточных культур посуду можно использовать.
   3. Перевести все ткани сердца переваривается трипсином в течение ночи с буфером для конической трубе 50 мл на льду в стерилизованной крышкой. Добавить 1 мл ингибитора трипсина в CMF HBSS (конечная 182 мкг / мл). Закрыть крышкой 50 мл коническую трубку плотно, чтобы предотвратить загрязнение.
   4. Выдержите трубки в течение примерно 30 мин в инкубаторе 37 ˚ C, чтобы нагреть ткани и буфер для 30-37 ˚ С. Добавить 5 мл коллагеназы в Лейбовиц L-15 (конечная 94 ед / мл). Инкубировать при 37 ˚ С в течение 45 мин при осторожном встряхивании (170-200 оборотов в минуту в шейкер 37 ˚ С инкубатор).
      Примечание: Этот шаг может быть сделано за пределами ламинарном боксе. Все последующие шаги должны сделать при комнатной температуре.
   5. Лечить снаружи 50 мл коническую трубку с 70% этанола и положитьэто в стерилизованной крышкой.
   6. Растирают тканей с использованием автоматического пипетки с пипетки на 3 мл / сек скорости 20 раз. Разрешить ткани остаток урегулировать в течение 3 мин и процеживают супернатант с 70 мкм ячейки фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: обычный размер 10 мл пипетки может быть использован для растирания.
   7. Добавить 5 мл Лейбовиц L-15 для остальных сгустков ткани и растирают и фильтруют супернатант снова. Промыть фильтр клеток с 2 мл Лейбовиц L-15.
   8. Наведите отфильтрованного раствора клеток в капюшоне в течение 20 - 60 мин, чтобы позволить коллагеназы переварить частично разрушенного коллагена.
   9. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в 20 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и высокой концентрации P / S (20 ед / мл).
   10. Предварительно плиты клетки на двух 10 см пластиковых клеточных культур блюд в течение 1 часа в СО ₂ инкубатора при 37 ˚ C для выбора кардиомиоцитов. Примечание: Фибробласты придавать более легко в нижней части блюда, чем кардиомиоцитов.
   11. БелыйIle ожидания, подготовить DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Добавить 1 мл 10 мг / мл BrdU в 325 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS и P / S.
   12. Вихревой блюда аккуратно и собирать кардиомиоцитов, содержащий супернатант из двух 10 см чашки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство кардиомиоциты все равно завис в супернатанта после 1 часа инкубации. Во избежание загрязнения с фибробластами, которые слегка прикрепленных к блюду, не собирают супернатант с помощью пипетки.
   13. Дополнительно> Граф клеток в супернатант с и без 0,2% трипанового синего и проверить жизнеспособность клеток.
   14. Отложений клетки при 100 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в DMEM, содержащей 10% FBS, P / S (10 ед / мл) и 0,1 мМ BrdU. Пластина клеток в 2 х 10 ⁵ клеток / блюдо в покрытые желатином 3,5 см со стеклянным дном посуды для наблюдения с помощью микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокоить клетки после покрытия по крайней мере 24 часов в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С.
   15. День 3, ЧаNGe средние 24 часа после нанесения покрытия, чтобы DMEM / MEM, содержащей 5% FBS, P / S и 0,1 мМ BrdU.
   16. День 4, Изменение средних 48 часов после посева в DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
       Примечание: изменение среднего каждые 2-3 дня с DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.

2. Лентивирусов трансдукции

1. Упаковка лентивирусных плазмид
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для дальнейшего углубленного информации по этому вопросу ^24-26. Это займет около 3 дней, чтобы подготовить лентивирусного решение. Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов для достижения более высокой эффективности трансдукции. Начните упаковку лентивирусных плазмид и изоляции крыс неонатальных кардиомиоцитов в параллельном режиме. Вместо того чтобы использовать полиэтиленимин (PEI) ²⁷ для упаковки лентивирусов плазмид, коммерчески доступный реагент трансфекции может быть использован. Следуйте инструкциям производителя.
   1. Подготовка реагентов и инструментов; НЕККлетки 293Т, 10 см пластиковые клеточных культур блюда, лентивирусные решения плазмиды (pMDLg / pRRE, PRSV-Rev, pMD2.G, лентивирусный векторные передачи, 1,0 мг / мл каждая), 1 г / л PEI, сыворотки среде, 20 мМ хлорохин в воде, 10% отбеливателя, 1% SDS в 70% этанола
   2. День 0, плиты 2-2,5 х 10 ⁶ НЕК 293Т клеток на 10 см блюдо накануне трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 30-60% слияния в трансфекции является оптимальным.
   3. День 1, Подготовка PEI трансфекции решение. Добавить 30 мкл 1 г / л PEI в 960 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл трубки. Добавить 4 плазмиды в трансфекции решения PEI в 1,5 мл трубки, и смешать с отводом.

   Название плазмиды	Примечание	Размер (кб)	Объем добавлено (мл)	Окончательная сумма в 10 см блюдо (мг)	Конечная концентрация в 10 см блюдо (PM)
   Лентивирусов вектор переноса	кодирует ген должен быть упакован	9-13	3.6-5.2	3.6-5.2	60
   pMDLg / pRRE	выражает ВИЧ-1 GAG / POL	8.8	1.76	1.76	30
   PRSV-Версия	выражает ВИЧ-1 REV	4.1	0.82	0.82	30
   pMD2.G	выражает VSV G	5.8	1.16	1.16	30

   Таблица 2:. Количество плазмид для упаковки лентивирусов использовать эти суммы для трансфекции плазмиды клеток НЕК293 в 10 см чашки. Итоговый объем лентивирусным вектора переноса за блюдо может отличаться в зависимости от его размера, поддерживать конечной концентрации за блюдо при 60 мкМ. Средний молекулярный вес от одной базовой пары двухцепочечной ДНК 660 дальтон.

   2. Утилизировать старые средуот 10 см блюдо из HEK 293Т и осторожно добавить 9 мл новой среде (DMEM + 10% FBS, без P / S).
   3. Добавить смесь PEI-ДНК мягко каплям на тарелку и нежно вихревой смешать со средой. Добавить 10 мкл 20 мМ хлорохина (конечная 20 мкМ) в 10 мл среды. Примечание: Хлорохин, как полагают, уменьшают деградацию плазмиды, содержащие трансфекции комплексов через частичной нейтрализации рН в пределах лизосомальных отсеков ^28.
   4. Выдержите в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 6 часов. Затем удалить среду, содержащую смесь PEI-ДНК и добавляют 10 мл новой среде (DMEM + 10% FBS + 20 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоту (HEPES), рН 7,4 + P / S) . ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации вируса будет производиться в среде. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатантили нет. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.
   5. 2-3 день, инкубировать в СО _{2-инкубатор} при 37 ˚ С в течение 48-72 часов. День 4, собирать лентивирусов решение (продолжать разделе 2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средний могут быть изменены в 48 часов после трансфекции. Сбор Вирус супернатант 48 часов и 72 часа в два раза может достичь для получения более высокого титра вируса решения.
2. Коллекция решения лентивирусным и трансдукции
   1. Подготовка реагента и инструменты: 15 мл конические пробирки, 1 М HEPES, рН 7,4 (0,22 мкм фильтруется)
   2. День 4, Сбор супернатант, содержащий частицы лентивирусов (лентивирусов раствор) 10 мл стерилизованной Luer-Lok шприц, затем фильтруют супернатанта через 0,45 мкм фильтр в 15 мл коническую пробирку. Добавить 1/100 объема 1 М HEPES рН 7,4 до отфильтрованного раствора лентивирусов (конечная 10 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фильтрации, используйте только целлюлозы тузТейт или полиэфирсульфона (PES) (связывание низким содержанием белка) фильтры. Не используйте нитроцеллюлозных фильтров. Нитроцеллюлозы связывает поверхностные белки на лентивирусным конверт и разрушает вирус.
   3. Удалите среду от 3,5 см чашки крысы неонатальных кардиомиоцитов, полученных на последнем шаге разделе 1.2, добавить 1 мл фильтрованной лентивирусным решения 3.5 см блюдо.
   4. Добавить гексадиметрин бромид (конечная концентрация 4-6 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: гексадиметрин бромид может повысить лентивирусов эффективность трансдукции. Концентрация гексадиметрин бромид должны быть оптимизированы.
   5. Выдержите блюдо для 6 часов в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение лентивирусным трансдукции, а затем изменить среду, чтобы новый DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S. Выдержите блюдо в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интеграция экзогенного гена в геном хозяина по лентивирус считается, будет завершена к 72 часов.
   7. День 7, использовать клетки от шага 2.2.5 для следующего шага. Примечание: Белки выражение из лентивирусов плазмиды может быть подтверждено WB или иммуноцитохимии (ICH) после 48-72 часов трансдукции, чтобы определить относительный уровень экспрессии (фиг.1А и 1В).
3. Концентрация лентивирусным решения
   Примечание: Лучше всего использовать свежий раствор лентивирусов, чтобы достичь наивысшую эффективность трансдукции, в случае, лентивирусов решение титр не достаточно высока, лентивирусов раствор может быть сконцентрирован полиэтиленгликоль (ПЭГ) осадков ^29.
   1. Приготовление раствора 4x ПЭГ (32% ПЭГ6000, 400 мМ хлорида натрия (NaCl), 40 мМ HEPES рН 7,4)
      1. Для 125 мл раствора ПЭГ 4x, взвешивают 40 г ПЭГ6000, затем растворить его в 60 мл воды.
         Примечание: Примечание: (. Т.е. средняя молекулярная масса составляет 6000 ПЭГ6000) после ПЭГ число средняя молекулярная масса
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.2) Медленно добавляют 10 мл5 М NaCl. Медленно добавьте 5 мл 1 М HEPES рН 7,4. Регулировка рН до 7,4 с помощью 2 М гидроксида натрия.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.1.3) Добавьте воду до 125 мл. Стерилизация 4x раствора ПЭГ мембранной фильтрацией с 0,22 мкм фильтр и хранить его при температуре 4 ˚ С.
   2. Лентивирус концентрация
      1. Фильтр лентивирусов трансдуцированных супернатант в новую пробирку на 50 мл с помощью 0,45 мкм фильтра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.2) Добавить решение 4x Peg 1:03 соотношение (раствор ПЭГ: супернатант = 1:3). Хранить при температуре 4 ˚ С в течение 16-48 часов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.3) Центрифуга при 2600 х г при 4 ˚ С в течение 30 мин. Удалите супернатант и центрифуги в 2600 х г при 4 ˚ C в течение 5 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.4) Удалите супернатант осторожно, чтобы не нарушая гранул. Повторное приостановить гранул в бессывороточной среде с использованием 1/2 до 1/25 объема от первоначального объема надосадочной жидкости.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 2.3.2.5) Используйте прямо или заморозить с помощью жидкого азота затем сохранить при -80 ˚ C

3. Аденовирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к другим источникам для методов построения и распространения аденовирусных конструкций ^13. Аспирационные Пипетки Пастера и / или советы должны быть подвергнуты дезактивации на 10% отбеливателя. Всегда обеззараживания биологической безопасности поверхность шкафа и потенциально загрязненное оборудование с 70% этанола независимо от того, была пролита супернатант. Если разлив произошел, тщательное обеззараживание с 1% SDS в 70% этанола необходимо.

1. Аденовирусный титрования на 50% тканевой культуры инфекционного дозы (TCID ₅₀₎
   Примечание: Перед трансдукции, необходимо, чтобы титровать аденовирусный маточного раствора. ТцД ₅₀ является одним из лучших методов для титрования вируса решение. Поскольку метод оценивает титр инфекционным мощностью до НЕК 293Т, рассчитанной тцД ₅₀ отражает фактическое infectability аденовируса складе. ОРП (бляшкообразующих униTS) пропорциональна TCID ₅₀ с коэффициентом около 0,56 ^30.
   1. Подготовка клетки и инструменты: НЕК 293Т, 10 см клеточных культур блюда, 96-а плоским дном культуры клеток плиты, 8-канальный мульти пипеток
   2. Подготовьте 70-90% сливной НЕК 293Т в одном 10 см блюдо.
   3. Выполните предварительный разбавление 1/10 ⁴ вируса складе. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS в каждую лунку 96-луночного плоским дном для культуры клеток пластины. Добавьте 25 мкл предварительно разбавленной вируса складе в первом ряду, от А до Я.
   4. Хорошо перемешать и перенести 25 мкл из первой строки скважин на второй строке с 8-канальной пипетки несколькими. Повторите разведение на 1/3 вирусной решения каждой строке скважин, вплоть до 11-й строки и отбросить последние 25 ул.
   5. Triturate НЕК клетки 293Т в 10 мл DMEM + 10% FBS. Добавить 50 мкл раствора клеток в каждую лунку от строк с 1 по 12.
   6. Инкубируйте клетки при 37 ˚ С в СО2-инкубаторе для 11-13 дней. Добавить 50 мкл DMEM + 10% FBS через 4-5 дней и 7-8 дней обшивки.
   7. Измерьте цитопатические эффекты в каждую лунку по 11-13 дней после заражения.

   переулок

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   Ряд

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд B

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд C

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд D

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд E

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд F

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд G

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   Ряд Н

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   г

   количество положительных лунок в каждом ряду

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   8

   6

   5

   2

   2

   0

   соотношение положительных лунок в каждом ряду

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   1

   0,75

   0.63

   0.25

   0.25

   0

   г	Показано более 50% цитопатических эффектов
   	Показано под 50% или не цитопатических эффектов

   Дорожка 1, разбавление 3 ^{1 4} x10; дорожка 2, разбавление 3 ² x10 ^4; ...; полоса 11, разбавление 3 ² x10 ^11; , д. 12, контроль.
   S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
   = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
   ТцД ₅₀ = 3 х 10 ⁴ х 3 х (8.875-0.5) = 2,97 х 10 ⁸
   ТцД ₅₀ / мл = 5,94 х 10 ⁹

   Таблица 3: Пример зараженного 96 хорошо пластины после 10 дней инкубации измерить цитопатические эффекты в каждую лунку и подвести соотношения положительных скважин в ряду..

   8. Рассчитать титр по формуле Kaerber в ^31.
   9. ТцД ₅₀ = (разбавление первой полосе) х (разведение) ^(S-0.5)
   10. S = сумме соотношения положительных лунок в каждом ряду
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, тцД ₅₀ = (30000) х ^{(3) (S-0.5).} Поскольку 50 мкл вирусного раствора используется в данном протоколе, разделить TCID ₅₀ на 0,05 рассчитать TCID ₅₀ / мл.
2. Аденовирусной трансдукции
   1. Рассчитать необходимое количество аденовирусного раствора от его титра (PFU / мл, вирусной частицы / мл или TCID ₅₀ / мл). Используйте формулу для расчета МВД (множественность заражения).
   2. EM> [Место Таблица 4 здесь]
   3. Добавить расчетное количество раствора вируса в бессывороточной среде (см. таблицу 5). Все хорошо перемешать и выдержать в течение 20 минут при комнатной температуре.
   4. EM> [Место Таблица 5 здесь]
   5. День7 возьми блюдо, полученное на последнем шаге раздела 2.2, и заменить среду с 750 мкл нового DMEM / MEM, содержащей 5% FBS и P / S.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение среднего объемав трансдукции до примерно 50% от первоначального объема является критическим для высокой эффективностью трансдукции.
   6. Добавить разбавленный вируса решение блюдо. Выдержите блюдо для 4-8 часов в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С. Затем вместо свежей средой.
   7. Выдержите блюдо для 24-48 часов в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ˚ С. В день 8-9, использовать клетки для эксперимента изображений живых клеток. Примечание: Белки выражение из аденовирусного плазмиды может быть подтверждено WB или ICH после 24-48 часов трансдукции, чтобы определить относительную уровень экспрессии белка (фиг. 1с и 1d).

4. Изображений живых клеток

1. Получение изображений с помощью конфокальной вращающийся диск микроскоп с контролируемой температурой камеры и экологической системы CO ₂ (необязательно)
   1. Включите систему контроля температуры по крайней мере 1 часа до приобретения, так что все устройства в равновесие до 37 ˚ С до начала приобретения. Включите confocаль спиннинг диск микроскопа системы (ПК для работы, микроскоп, вращающийся диск блок, ПЗС-камеры, лазеры, флуоресцентный источник света, нормальный источник света, моторизованный этап и автоматические жалюзи).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более 1 час необходимо добиться полного уравновешивания температуры всех устройств.
   2. Изменение среды в 3,5 см со стеклянным дном блюд до нужной среды для приобретения, если это необходимо. Место блюдо на сцене конфокальной спиннинг диска микроскопа в контролируемой температурой камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с сферической аберрации для оптимального наблюдения с помощью микроскопа использованием 3,5 см со стеклянным дном блюдо с п. 1.5 покровного стекла (около 0.16-0.19 мм толщины) идеально подходит. Если цель используется имеет коррекции воротник, изображения, полученные с покровными стеклами толщиной более 0,17 мм может быть скорректировано. Кроме того, Фенол красный имеет небольшой флуоресценции. Иногда желательно использовать фенол красный свободный среду, такую ​​как DMEM без фенолового красного. Если нет устройство для контроля CO _{2 концентрация на столике микроскопа, то лучше использовать СО 2 независимых среднего или среднего буферизируются HEPES для долгосрочного покадровой обработки изображений.}
   3. Выберите оптический путь окуляров.
   4. Поверните заслонку светлого поля источника света на. Настройте фокус с клетками под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для светлого поля источника света офф.
   5. Поверните затвор для флуоресцентного источника света на. Найти клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки под микроскопом через окуляры. Поверните затвор для флуоресцентного источника света офф.
   6. Дополнительно> Нажмите кнопку активации для совершенной системы фокусировки перед микроскопом, чтобы включить совершенную систему фокусировки на, чтобы сохранить фокус устойчивый при приобретении покадровой.
   7. Измените путь света к вращающимся диском конфокальной микроскопии. Изменение настроек для приобретения надлежащим с помощью программного обеспечения, проверка изображения ДИСПЛЕЙYED на экране. (Например, Focus, мощность лазера, время экспозиции, ПЗС усиления камеры и вне набора)
   8. Установить настройки для флуоресцентного получения изображений с помощью операционной программного обеспечения. Пример: Выберите "Изменить каналы с использованием световых путей» и «Канал 1: EGFP" приобрести флуоресцентный сигнал от EGFP для одного канала.
   9. Установите частоту между временных точках по настройке параметров покадровой, чтобы принять покадровой изображения с помощью программного обеспечения. Пример: на приобретение одной временной точке каждые 5 минут, выберите "Минут на временной точке" из выпадающего меню и введите 5 в поле ввода текста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите "максимальной скорости", чтобы сделать фильм по фактической скорости. Если выражение флуоресцентного белка низкий, флуоресценция может быстро отбелить во время сбора покадровой. В этом случае лучше уменьшить количество сбора временных точках.
   10. Запустите приобретение покадровой, нажав кнопку "STAКнопка RT ", чтобы приобрести последовательность изображений.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше не использовать функцию сбора несколько-очков. Это может привести к потере фокуса или движения области изображения во время покадровой обработки изображений.
2. Анализ полученных изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приобрел изображения могут быть воспроизведены в видеофайл и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа.
   1. Выберите полученные изображения, которые будут включены в кино. При необходимости, на полях области интереса со стороны образов и выберите интересные моменты времени, чтобы уменьшить размер файла фильма с помощью программного обеспечения.
   2. Экспорт изображений в виде файла фильма в AVI или в формате MOV. Выберите формат фильма из "Формат" в раскрывающемся меню и сроках, необходимых для готового фильма, затем нажмите кнопку "Экспорт". ПРИМЕЧАНИЕ: покадровой изображения, полученные на одном временной точке каждые 5 минут можно воспроизводить как фильм частотой 10 кадров в секунду, что в 3000 раз быстрее, чем его фактической скорости.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать технику, лентивирус кодирования EGFP (усиливается зеленый флуоресцентный белок) с метками Сх43 (коннексина 43) или мутировал Сх43 ³² был использован, чтобы выразить EGFP с метками белков в клетках и кодировку аденовируса FGFR1DN (фактор роста фибробластов рецептора 1...

Обсуждение

Первичные кардиомиоциты, выделенные из новорожденных крыс уже давно используются для изучения функций кардиомиоцитов в пробирке. Этот протокол описывает способ выделения неонатальных кардиомиоцитов из крысят с использованием двухэтапный метод фермент пищеварение, сначала пер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Scissors for decapitation	WPI	501749	Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping	WPI	14393	Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5)	Sigma	F6521	Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes	Sigma	CLS430165	For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-1.5-20-C	For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0.17-14-C	For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water	Sigma	E7148
2% Gelatin	Sigma	G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish	Sigma	CLS430165	For trypsinization
Aluminium foil	Any brand
Parafilm	Sigma	P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish	Sigma	CLS430165	For selection
Autopipette	Drummond Scientific	4-000-300	For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter	nexcelom		To check and count cells
Microscope and hematocytometer	Any brand		To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4%	invitrogen	15250-061
CO2 incubator	Sanyo	MCO-19AIC
Incubating orbital shaker	Sigma	Z673129	To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution	BD Pharmingen	550891
DMEM, high glucose	invitrogen	41965039	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM	invitrogen	31095029	Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum	invitrogen	26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	invitrogen	15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
pRSV-Rev	Addgene	12253
pMD2.G	Addgene	12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro	Clontech	632183
Opti-MEM (serum-free medium)	invitrogen	31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)	Polysciences	24765-2	It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001	substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine	Sigma	C6628	Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES	Sigma	H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized	BD	309604
0.45 μm filters	Sigma	F8677	Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide	Sigma	H9268	Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000	Sigma	81260
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sodium hydroxide	Sigma	S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes	Sigma	CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile	BD Falcon	353072	For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel	eppendorf	3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy	PerkinElmer	L7267000
A temperature-controlled chamber	Any brand		To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system	Any brand		Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine	invitrogen	18045-054	For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red	invitrogen	21063-029	For long time time-lapse imaging