Intraluminale Drug Delivery auf die Maus arteriovenöse Fistel Endothel

Zusammenfassung

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Zusammenfassung

Abgabe therapeutischer Mittel arteriovenöse Fistel (AVF) zur Verbesserung der Reifung entweder via intraluminalen oder externe Wege verabreicht werden kann. Die einfache murine AVF Modell wurde mit intraluminale Verabreichung von Arzneimittellösung in die venöse Endothel zugleich als Fistel Schaffung kombiniert. Technische Aspekte dieses Modells diskutiert. Unter Vollnarkose wird ein Bauchschnitt gemacht und die Aorta und untere Hohlvene (IVC) ausgesetzt sind. Die Infrarot-Nieren-Aorta und IVC sind zum Klemmen seziert. Nach proximal und distal Klemmung wird der Einstichstelle freigelegt und eine 25 G-Nadel verwendet wird, beide Wände der Aorta und in die IVC zu durchstechen. Unmittelbar nach dem Einstich, ein Reporter-Gen-exprimierenden viralen Vektor wurde in der IVC über die gleiche Nadel infundiert, um 15 min inkubiert. Die intraluminale Verabreichungsmethode ermöglicht robustere virales Gen Lieferung an den venösen Endothel im Vergleich zur Verabreichung durch die externe Route. Diese novel Verfahren zur Lieferung wird Studien erleichtern, die die Rolle des Endothels in AVF Reifung erforschen und zum Zeitpunkt der chirurgischen Operation intraluminal Arzneimittelabgabe ermöglichen.

Einleitung

Die murine aortovenous Fistel (AVF) Einstich Modell zwischen der Aorta und der unteren Hohlvene (IVC) ist jetzt eine etablierte Technik. ¹ In diesem Modell beide Wände der infra-renale Aorta sind mit einer 25 G Nadel durchstochen, in das austretende angrenzenden Infranieren Hohlvene; die vordere Aorten-Eingangsloch ist mit einfachen Kompression repariert, und erfordert keine Naht Reparatur. Serien Follow-up - Prüfung von hochauflösenden Doppler - Ultraschall und histologische Analyse zeigt die AVF eine Reifephase haben und dann eine versagende Phase, die bekannte Pathophysiologie menschlicher AVF rekapituliert. ²

Mechanismen erforschen, die AVF Reifung modulieren, verbesserte Verfahren zur Abgabe von therapeutischen Mitteln an die Reifungs AVF Endothels benötigt. Lieferung von therapeutischen Wirkstoffen auf Schiffe können entweder über endovaskuläre Lieferung an das Lumen oder über externe Lieferung an die Adventitia sein. Ein Beispiel für eine externe Lieferung ist der comhäufigsten verwendeten adventitiellen Anwendung von Pluronic-Gel. Dieses Copolymer wird thermo-reversibel und vom flüssigen in den festen Gel umgewandelt wenn sie auf Körpertemperatur erwärmt. Frühere Studien haben gezeigt , aufrechterhalten Arzneimittelabgabe erreicht wird , wenn die Droge in Pluronic - Gel gemischt topisch in vivo angewendet wird. ^3,4 adventitiellen Anwendung von viralen Vektoren oder siRNA mit Pluronic - Gel wurde als perivaskuläre Abgabesystem wirksam zu sein berichtet. ^5,6 Wir haben auch berichtet , dass die Behandlung von explantierten humanen Vena saphena mit adventitiellen Stimulation durch Peptide , die in der Phosphorylierung der endothelialen Rezeptorproteine ​​führte. ⁷

Auf der anderen Seite haben Forscher auch intraluminale Lieferung von beiden viralen und nicht - viralen Vektoren in canine ^8-10 und Kaninchen ^11,12 Modelle von Venentransplantaten verwendet. In diesen Berichten wurde Gentransfer durchgeführt ex vivo nach der Ernte Vene. Eslami et al. Berichtet endovaskuläre viralen Gens lieferny Venen in situ zu Karotis ohne einen Bypass zu schaffen. ¹³ Gloverman et al. berichtete intraluminale und adventitiellen Lieferung von nackter DNA in Ratte Femoralarterie-V. epigastrica superficialis Fisteln. ¹⁴ Die Mayo - Gruppe berichtet adventitiellen Arzneimittelabgabe in Arterie-Halsvene Fisteln Maus Carotis. ^15,16 Allerdings sind diese bereits berichtet Modelle eine genähte Anastomose , die zum Erstellen die AVF. In diesem Bericht wird intraluminale Medikamentenabgabe bei gleichzeitiger AVF Schöpfung bei Mäusen beschrieben, eine Naht lose Modell der AVF Schöpfung verwenden. Durch die Verwendung dieses modifizierte murine AVF Modell eine einfache Methode zur intraluminale Medikamentenabgabe an den venösen Schenkel der Fistel durchgeführt werden.

Protokoll

Die Genehmigung durch die entsprechende Institutional Animal Care und Use Committee erhalten.

1. Anästhesie und präoperative Verfahren

1. Anesthetize männlichen C57Bl / 6 Eis im Alter von 8 Wochen mit verdampfte 3% Isofluran und 0,8 l / min Sauerstoff in eine Acrylinduktionskammer verabreicht.
2. Bestätigen ausreichende Anästhesie durch den Mangel an Reaktion auf Zehe Prise. 3% Isofluran durch kontinuierliche Inhalation - Bewegen Sie die Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch und positionieren, um eine Silikonmaske zu liefern 2 verdampft.
3. Entfernen ventralen Haare vom Hals zum Unterbauch eine chemische Enthaarungscreme verwenden.
4. Führen Sie Doppler - Ultraschall - Untersuchung vor der AVF Chirurgie Baseline - Charakteristika der arteriellen und venösen Rückstrom und Gefäßdurchmesser in den Bereichen von Interesse zu erfassen. ^1,2
5. Bringen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 25 G-Nadel und laden Sie die Spritze mit dem gewünschten Medikament. Biegung der Nadel zu einem Winkel von 60 Grad ungefähr 4 mm von der Notwendigkeitle Spitze. Fassen Sie die 25 G-Nadel mit einem gebogenen Nadelhalter.

2. Operative Verfahren

1. Bereiten Sie die Inzisionsstelle mit einem Antiseptikum und ein Operationstuch anwenden. Verwenden Sie sterile Handschuhe und Instrumente zur aseptischen Bedingungen in der gesamten Operation erhalten.
2. Machen Sie eine Mittellinie Bauchschnitt mit einem Skalpell aus dem Niveau der unteren Leberrand erstreckt, knapp über dem Schambein.
3. Legen Sie eine Aufroller und ausweiden alle Eingeweide aus der Bauchhöhle zur rechten Seite. Wickeln Sie die Eingeweide in Gaze, getränkt mit Kochsalzlösung. Präparieren Sie die Membran, die die retro-Peritoneum verbindet und unteren Kolon vollen Blick auf die Aorta und IVC zu erhalten.
4. Präparieren Sie die infra-renalen Aorta und IVC aus den umliegenden Geweben, die Vorbereitung für proximale und distale Klemm.
5. Legen Sie eine einzelne Mikroclip über beide proximalen Aorta und dem proximalen IVC auf der Ebene direkt unterhalb der linken Nierenvene. Legen Sie eine zweite Mikroclip über beide distal Aorta und das distale IVC.
6. Fassen des Bindegewebes die Aorta umgibt und medial zu drehen , so dass die Rückenfläche der Aorta leicht für den arteriellen Einstich ausgesetzt ist, wie zuvor beschrieben. ¹
7. Schnell die Einstichstelle aus. Die Punktionsstelle wird von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation am kaudalen Aspekt der Gefäße, etwa drei Viertel des Abstandes sein. Halten Sie die Aorta in einer gedrehten Position mit der linken Hand, sezieren die linke seitliche Rand der Aorta, so dass es genügend Belichtung ist Einstich mit der rechten Hand zu ermöglichen. Achten Sie darauf, nicht zwischen der Aorta und der IVC zu sezieren.
8. Pflegen Sie die Aorta in einer gedrehten Position und durchstechen die Aorta durch in die IVC unter Verwendung einer 25 G-Nadel mit einem daran befestigten 1 ml Spritze mit Wirkstofflösung. (1A)
9. Infuse die Wirkstofflösung (100-200 ul) mit der linken Hand. Die Nadel kann durch die erweiterte und dünn zu sehenIVC Wand , wenn die transparente Arzneimittellösung aus dem IVC (1B, C) ​​das venöse Blut verdrängt. Bleiben Sie ruhig und die Nadel in Position für 15 Minuten aufrechtzuerhalten.
10. Entfernen Sie die distale Mikrochirurgie Clip zu de-Klemme nur die distale Aorta und das distale IVC.
11. Entfernen Sie die Nadel und dann bedecken Sie die Einstichstelle der Aorta durch benachbarte retroperitonealen Gewebe nach oben ziehen.
12. Entfernen Sie den proximalen Mikrochirurgie Clip zu de-klemmen die proximale Aorta und den proximalen IVC. Bei der De-Klemm wird arterielle Blut in den IVC beobachtet fließt, anstatt dunkel venösen Blutfluss. Halten Sie das Einstichloch für 1 min abdecken.
13. Nach der Bestätigung der Hämostase durch Beobachtung für 30 Sekunden ohne Kompression, kehren die Därme in ihre natürliche Position und schließen Sie den Bauch mit einem fortlaufenden Naht nach Ihren zugelassenen Tier Protokoll.

3. Post-operative Verfahren

1. Nach dem Schließen des Bauches, beenden anesthesia. Bewerben postoperative Pflege einschließlich Analgesie und Wundversorgung in Übereinstimmung mit den Anweisungen von der Institutional Animal Care und Use Committee empfohlen. Analgesieprüfung verwenden wir Buprenorphin bei 0,1 mg / kg intrasmuscularly alle 12 h für 24 Stunden, die chirurgische Verfahren folgende.
2. Am ersten Tag nach der Operation durchführen Doppler-Ultraschall-Durchgängigkeit des AVF zu bestätigen. Darüber hinaus messen die anderen Behälter und Fließeigenschaften seriell und für Änderungen von der präoperativen Ausgangswerten zu vergleichen. ^1,2

Zeige intraluminale Lieferung bei AVF Chirurgie Abbildung 1. (A) Operative Foto. Klemmen Sie den proximalen und distalen Aorta sowie die IVC von Mikrochirurgie Clips anwenden. Die Punktion der Aorta durch in die IVC unter Verwendung einer 25 G - Nadel mit angebrachtem Spritze mit Wirkstofflösung. (B) Ein Higihre Leistung Bild (4-fache Vergrößerung) des punktierten IVC vor der Infusion. Die Nadelspitze wird durch dunkel gefärbte venösem Blut verdeckt. Gelbe Pfeile bezeichnen die Wand-zu-Wand - Durchmesser des IVC. (C) eine höhere Leistung Bild (4 - fache Vergrößerung) des punktierten IVC nach der Infusion. Die Nadelspitze (schwarzer Pfeil) durch die sanft aufgetrieben und dünne IVC Wand (gelbe Pfeile) als die transparente Arzneimittellösung verdrängt das venöse Blut zu sehen.

Ergebnisse

In einer Serie von 33 Mäusen, Überleben am ersten postoperativen Tag betrug 97,0%; AVF Durchgängigkeit, wie durch Ultraschall bestimmt wurde, betrug 84,9%.

Gene Transduktionswirksamkeit dieser endovaskulären Lieferweg mit der traditionellen externen Route verglichen. Zur intraluminalen Liefer (ILD), unmittelbar nach der Punktion 200 ul Adenovirus-GFP (Ad-GFP) Vektor - Lösung (1 × 10 ⁹ PFU / ml) wurde über die...

Diskussion

Diese Modifikation des murinen AVF Modell enthält intraluminal Arzneimittelabgabe an das venöse Endothel zum Zeitpunkt der AVF-Erstellung. Ein AVF wurde durch Punktierung der infra-renalen Aorta mit einer 25 G-Nadel und zur Verlängerung der Einstich durch die gegenüberliegende Aortenwand in die IVC, gefolgt von Injektion von Arzneimittellösung durch die gleiche Nadel geschaffen. Die Lösung wird beibehalten inner caval, dh., Im venösen Schenkel des AVF, bis de-Klemm. Was unterscheidet dieses Modell von an...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G	Used as 30% solution in d-water
GFP antibody	NOVUS BIOLOGICALS INC	NB100-1770
Ad-CMV-GFP	VECTOR BIOLABS	1060
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP	Baxter	2F7122
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8	BD	305122
BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip	BD	309659
Scalpel	Surgical Design Inc	22079707
6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting	ETHICON INC	697G
Vevo 770 ultrasound machine	Visualsonics	20 - 60 Mhz scan head; RMV-704
Vascular clamp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5424
Clamp applying forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5410