RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Zusammenfassung

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Zusammenfassung

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Einleitung

Die intrazelluläre bakterielle Erreger ─ Bakterien verursachen Infektionskrankheiten und in der Lage zu wachsen und in den Zellen von menschlichen Wirten Wiedergabe ─ sind ein großes Gesundheitsproblem weltweit ^5. Um eindringen und zu replizieren in einer Säugerzelle, haben intrazelluläre Erreger anspruchsvolle Virulenzmechanismen und Faktoren erworben. Während diese Mechanismen grundlegender Bedeutung für die Fähigkeit sind, eine Krankheit zu verursachen, wissen wir wenig über ihre Regulation und Dynamik. Da Genexpressionsprofile von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien nicht die tatsächliche Umgebung, in Wirtszellen beziehen, gibt es einen wachsenden Bedarf an Transkriptom in ihren intrazellulären Nischen gewachsen von Bakterien analysiert. Solche Analysen werden die Entzifferung von spezifischen bakteriellen Anpassungen durch den Host ausgelöst ermöglichen und wird dazu beitragen, neue Ziele für therapeutische Design zu identifizieren. Transkriptom-Analyse von intrazellulär gewachsen Bakterien ist sehr anspruchsvoll, da Säuger RNA durch an bakterielle RNA-Überzahlmindestens das Zehnfache. In diesem Manuskript beschreiben wir eine experimentelle Methode bakterielle RNA von Listeria monocytogenes Bakterien zu isolieren innerhalb murine Makrophagen - Zellen wachsen. Die extrahierte RNA kann verwendet werden, intrazelluläre Anpassungen und Virulenzmechanismen von pathogenen Bakterien durch verschiedene Techniken von Transkriptionsanalyse, wie beispielsweise RT-PCR, RNA-Seq, Mikroarray und andere Hybridisierungs basierten Technologien zu studieren.

L. monocytogenes ist der Erreger der Listeriose beim Menschen eine Krankheit mit klinischen Manifestationen Targeting in erster Linie Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen und schwangere Frauen ^6. Es ist ein Gram-positive fakultativ intrazelluläre Erreger , die eine breite Palette von Säugetierzellen befällt, die seit Jahrzehnten als ein Modell in der Wirt-Pathogen - Interaktionen ⁷ Studien verwendet wurden. Nach invasion, liegt es zunächst in einer Vakuole oder einem phagosome (im Falle von Phagozyten), von dem es in t entweichen müssener Gastgeber um Zellzytosol zu replizieren. Mehrere Virulenzfaktoren wurden ⁸ das Entweichen Prozess zu vermitteln gezeigt, in erster Linie die porenbildende Hämolysin, Listeriolysin O (LLO) und zwei zusätzliche Phospholipasen. Im Cytosol nutzen die Bakterien die Host - Aktin - Polymerisation Maschinen selbst auf Aktin - Filamenten innerhalb der Zelle zu treiben und von Zelle zu Zelle (1) zu verteilen. Alle wichtigen Virulenzfaktoren von L. monocytogenes beteiligt Invasion, intrazellulären Überleben und die Replikation, werden vom Master Virulenz Transkriptionsregulator aktiviert, PrfA. ^8-10.

In den letzten zehn Jahren mehrere Studien , die von uns durchgeführt und haben andere Methoden zur Transkriptom - Analyse von intrazellulär gewachsenen Bakterien in Wirtszellen ^2,11-15 erfolgreich angewendet. Zwei Hauptansätze sind verwendet, um bakterielle RNA von Wirt-RNA zu trennen, die basieren auf: 1) Selektive Anreicherung von bakterieller RNA und 2) RNA-Isolierung durch differenz Zell-Lyse. Der erste Ansatz beruht auf subtraktive Hybridisierung von Gesamt - RNA - Extrakten zu Säuger - RNA - Moleküle (beispielsweise kommerziell erhältlichen Kits) oder selektive Erfassung von bakteriellen transkribierte Sequenzen (SCOTS) ^11. Der zweite Ansatz beruht auf differentiellen Lysis von Bakterien und Wirtszellen, in denen die Wirtszellen lysiert werden, während Bakterienzellen intakt bleiben. Bakterienzellen werden dann aus der Wirtszelle Lysat, üblicherweise durch Zentrifugation abgetrennt und die RNA Standardtechniken extrahiert werden. Das Hauptproblem mit diesem Ansatz ist, dass zusammen mit der intakten Bakterien-Wirtszellen Zellkerne sind ebenfalls isoliert, so dass die RNA-Präparationen noch Säuger RNA enthalten. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu überwinden, ist intakten Bakterien aus Wirtszellen Zellkerne unter Verwendung differentieller Zentrifugation zu trennen, obwohl dieses Verfahren in der Regel Zeit in Anspruch nimmt während der Extraktion das Anliegen von Veränderungen in Genexpressionsprofil zu erhöhen. In diesem Papier stellen wir eine verbesserte und schnelle bacteria RNA-Extraktion-Protokoll, das auf die Zelldifferential Lyse-Ansatz basiert. Zuerst L. monocytogenes Makrophagenzellen infiziert sind , mit kaltem Wasser lysiert. Als nächstes werden Makrophagen-Kerne werden durch eine kurze Zentrifugation entfernt und intakten Bakterien schnell auf Filtern gesammelt, aus dem RNA heißem Phenol-SDS-Extraktion bakterieller Nukleinsäuren isoliert werden.

Protokoll

Anmerkung: Während des gesamten Versuchs werden Makrophagenzellen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ Umluft Inkubator inkubiert und nur aus dem Inkubator genommen für experimentelle Manipulationen, die in einer Klasse - II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Arbeiten mit L. monocytogenes Bakterien ist nach biologischen Sicherheitsstufe 2 Vorschriften.

1. Zellpräparation und bakterielle Infektion (Tag 1 und 2)

1. Tag 1
   1. Seed 2,0 x 10 ⁷ Knochenmark stammMakrophagenZellen (BMDM) auf einer 145 mm - Schale in 30 ml BMDM + Pen-Strep - Medien (Tabelle 2). Seed 3 Platten für jeden Bakterienstamm zu analysieren. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren in einem 5% CO ₂ Inkubator Gebläseluft.
   2. Starten Sie eine Nacht Bakterienkultur von Wildtyp (WT) L. monocytogenes Stamms 10403S in 10 ml Hirn - Herz - Infusion (BHI) -Medium bei 30 ° C in einem Standard - Inkubator. Platz Kulturröhrchen schräg ohne Schütteln. Hinweis:Diese Wachstumsbedingungen bis regulieren die Expression der Flagellen Gene, die effiziente Infektion fördert.
2. Tag 2
   1. Vorwärmen BMDM Medium (ohne Pen-Strep - Antibiotika) (Tabelle 2) und Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 ° C.
   2. Makrophagen-Monoschicht wasche zweimal mit 25 ml vorgewärmtes PBS Antibiotika zu entfernen. 30 ml frisch BMDM Medium.
   3. Waschen wurden 1,5 ml Bakterienkultur über Nacht mit PBS durch Bakterien bei> 14,000 × g für 1 min, Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren Bakterien sanft in 1,5 ml PBS durch Pipettieren Zentrifugieren. Zweimal wiederholen.
   4. Infect jede Makrophagen Platte mit 0,5 ml einer gewaschen Nacht - Kultur von Wildtyp L. monocytogenes. Wenn mehrere Platten verwenden, infizieren auseinander jede Platte 15 min. Dieses Zeitintervall ermöglicht jede Platte einzeln am Ende der Infektion erntet.
      Hinweis: Die Vielzahl der Infektion (MOI) durch Plattierung serielle Verdünnung getestet wirds Bakterienkultur für eine Infektion auf BHI-Agarplatten und Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) nach 24-stündiger Inkubation der Platten bei 37 ° C verwendet. Mit 0,5 ml WT L. monocytogenes Stamm 10403S Ergebnisse in einer MOI von ~ 100 (100 Bakterien KBE pro Makrophagen - Zelle). Bei bakteriellen Mutanten in das intrazelluläre Wachstum zu analysieren, sollte eine höhere MOI in Betracht gezogen werden.
   5. Nach 0,5 Stunden Inkubation bei 37 ° C, waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit PBS, ungebunden Bakterien zu entfernen, und 30 ml vorgewärmten BMDM Medium. Befestigt Bakterien werden bei der nächsten 0,5 Stunden internalisieren.
   6. Bei 1 h nach Infektion, fügen Sie 30 ul Gentamicin (1: 1000 bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml erreichen) extrazelluläre Bakterien zu töten.
   7. Bauen Sie die Filtervorrichtung durch einen Filterkopf auf einem Sammelflüssigkeit Kolben, der mit einem Vakuumaustrittsöffnung platzieren. Dann legen Sie einen Filter (0,45 & mgr; m) auf einem Filterkopf, durch einen Zylinder Trichter gefolgt und sichern die verschiedenen Teile mit einem Metall-cLampe. Bereiten Sie eiskalten RNase-freies Wasser.
   8. Nach 6 Stunden nach der Infektion, Ernte Bakterien aus infizierten Zellen wie folgt. Behandeln Sie jeden einzeln Platte.
      Hinweis: In der Regel L. monocytogenes abgeschlossen 1-log des Wachstums während 6 Stunden der Infektion in Makrophagenzellen. Längere Inkubationen in bakterielle Überwucherung und Zelltod der Makrophagen führen könnte, während kürzere Inkubationszeiten deutlich niedriger Bakterienbelastungen führen könnte. Die MOI und die Zeit der Infektion kann modifiziert werden, um optimale Bedingungen zu erreichen.
      1. Waschen infizierten Zellen einmal mit PBS. 20 ml eiskaltem RNase-freies Wasser zu Makrophagenzellen lysieren. Mit einem Zellschaber abkratzen die Zellen von der Platte schnell, aber sorgfältig.
      2. Sammeln lysierten Zellen auf eine 50 ml konischen Röhrchen. Vortex für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 800 × g für 3 min bei 4 ° C.
      3. Führen Sie den Überstand durch das Filtergerät über ein Vakuumsystem. Mit einer Pinzette, den Filter rollen und es schnell übertragen zu einem 15 ml conical Rohr. Snap-gefrieren die Rohre mit den Filtern in flüssigem Stickstoff.
      4. Bauen Sie die Filtrationsvorrichtung mit einem neuen Filter für die nächste Probe, wie in 1.2.7 beschrieben.
      5. Lagern Sie die gefrorenen Filter bei -80 ° C für den nächsten Tag. Alternativ gehen Sie direkt zur Nukleinsäure-Extraktion.

2. Nucleic Acids Extraction (Tag 3)

Hinweis: Führen Sie alle Manipulationen mit Phenol und Chloroform-Lösungen in einem Abzug.

1. Bereiten Sie eine 1: 1-Mischung aus angesäuerten Phenol: Chloroform, 400 & mgr; l für jede Probe. Mischen Sie in getrennten Röhren, und dann ziehen Sie die resultierende wässrige Schicht durch Absaugen. In 40 ul 10% SDS.
2. Tauen Sie die Filter enthaltenden Röhrchen auf Eis sie kalt zu halten. Jedem Filter enthaltende Röhre fügen 650 ul Acetat-EDTA (AE) Puffer (Tabelle 2).
3. Führen Sie die folgenden Schritte so schnell wie möglich.
   1. Energisch verwirbeln das Rohr den Filter so enthältdass der Filter Handrührer zum Umfang des Rohres und der Puffer voll wäscht den Filter. Halten Sie das Rohr kalt, indem sie es wieder auf Eis gestellt. Hinweis: Es kann notwendig sein, um zusätzlich das Rohr verwirbeln, während umgekehrt, um vollständig die Bakterien aus dem Filter zu waschen.
   2. Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen. Es kann nützlich sein, kurz die Suspension auf Spin-down (1 min bei 120 xg) am Ende des Prozesses.
4. Übertragung der bakterienhaltigen Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die SDS und Phenol / Chloroform-Mischung, enthaltend (hergestellt wie in 2.1). Wiederholen Sie dies für alle Röhrchen. Es kann notwendig sein, die Filter enthalten, Rohre (1 min bei 120 · g) wieder zu spinnen Restpuffer aus dem Filter zu erhalten.
5. Legen Sie alle 1,5-ml-Röhrchen in einem Mehrrohrwirbelvorrichtung und Wirbel bei voller Geschwindigkeit für 10 min.
6. Inkubieren der Röhrchen in ein 65 ° C Heizblock für 10 min. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 x g) für 5 min.
7. Übertragen Sie die wässrige Schicht (etwa 400 ul) von jedem tube in ein neues 1,5-ml-Röhrchen 40 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 1,0 ml 100% Ethanol enthält. Vortex jedes Röhrchen gründlich.
   Hinweis: Glycogen kann in diesem Schritt zugegeben werden Sichtbarmachung des ausgefällten Pellet zu verbessern.
8. Inkubieren der Proben bei -80 ° C für 1 Stunde. Alternativ brüten Proben bei -20 ° C über Nacht. zentrifugieren Dann werden die Proben bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 xg).
9. absaugen vorsichtig die Ethanol (obere Schicht) aus jedem Röhrchen. In 500 & mgr; l kaltem 70% Ethanol zu jeder Probe und Vortex gründlich. Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit (> 1 4,000 xg).
10. absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen. Trocknen Sie die Proben für ca. 2 min einen Vakuumverdampfer ohne Wärme. Nicht zu trocknen die Proben.
11. Zugeben von 25 & mgr; l RNase-freies Wasser zu jeder Probe. für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Sorgfältig Wirbel und Spin-down.
12. Messen Sie RNA-Konzentration in ter Proben unter Verwendung eines Mikrovolumens UV-Vis-Spektralphotometer. Erwarten Sie etwa 0,5 zu extrahieren - 1 ug Nukleinsäuren pro Platte.
    Anmerkung: Technical Replikaten kann auf dieser Stufe kombiniert werden.

3. DNase-Behandlung

1. Eingerichtet , um die Reaktion gemäß Tabelle 1 in einem Mikrozentrifugenröhrchen. für 45 min bei 37 ° C inkubieren. In 450 & mgr; l RNase-freiem Wasser und 500 ul Phenol-Chloroform-IAA - Mix (Tabelle 2), getrennte Phasen von 2 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert (> 14.000 xg).
2. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen und fügen 500 ul Chloroform-IAA - Mix (Tabelle 2), Wirbel und getrennte Phasen von 2 min Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (> 14.000 xg).
3. Übertragen die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und Zugabe von 1 ml Ethanol und 50 ul 3 M Natriumacetat (pH 5.2). Wirbel.
   Hinweis: Glycogen kann in diesem Schritt zugegeben werden Sichtbarmachung des ausgefällten Pellet zu verbessern.
4. Inkubieren für 1 Stunde bei -80 ° C. Alternativ brüten Proben bei -20 ° C über Nacht. Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit.
5. absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen. In 500 & mgr; l kaltem 70% Ethanol zu jeder Probe und Vortex gründlich. Zentrifuge bei 4 ° C für 20 min bei maximaler Geschwindigkeit. absaugen vorsichtig das Ethanol aus jedem Röhrchen.
6. Trocknen Sie die Proben für ca. 2 min einen Vakuumverdampfer ohne Wärme. Nicht zu trocknen die Proben.
7. In 12 ul RNase-freies Wasser, Inkubation für 2 min bei Raumtemperatur, Wirbel und Spin-down. Die Proben enthalten gereinigte RNA, halten sie auf dem Eis. Alternativ lösen sich RNA in RNase-freiem H ₂ O mit 0,1 mM EDTA oder TE - Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
8. Messen Sie RNA-Konzentrationen mit Hilfe eines Mikrovolumens UV-Vis-Spektralphotometer. Erwarten Sie ~ 100 ng RNA pro Probe (wenn technische Replikate kombiniert werden).
   Anmerkung: RNA extrahiert gemäß diesem Protokoll ist geeignet for Gen-Transkription Analyse von mehreren Techniken. Wir in der Regel RT-qPCR - Analyse beschäftigen L. zu studieren monocytogenes Gen - Transkription während der Infektion von Makrophagen - Zellen ^1-4.

Ergebnisse

Das Modellsystem ist in Figur 1 und enthält Makrophagenzellen mit L. infiziert gezeigten monocytogenes Bakterien, die in den Makrophagen Cytosol replizieren. 2 sind die Versuchsschema darstellt. Abbildung 3 stellt typische Ergebnisse solcher RT-qPCR - Analyse von Virulenzgenen bei WT L. monocytogenes Wachstum in Makrophagen im Vergleich zum Wachstum in den reichen Labor Medium BHI. Die Ergebnisse zeigen die Tr...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll stellt ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von bakteriellen RNA aus L. monocytogenes Bakterien intrazellulär in Makrophagen - Zellen wachsen. Dieses Protokoll basiert auf Zell Differential-Lyse und umfasst zwei Hauptschritte zur Anreicherung von bakterieller RNA: Makrophagen-Kerne Sedimentation mittels Zentrifugation und eine schnelle Ansammlung von Bakterien durch Filtration. Diese Schritte werden durch eine Standard-RNA-Extraktionsverfahren gefolgt. Während dieses Protok...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen