RNA 정제는 세포 내에서 재배<em&gt; 리스테리아</em&gt; 식세포 세포에

요약

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

초록

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

서문

세포 내 세균 병원체 ─ 전염병 성장과 인간의 호스트의 내부 세포를 재생할 수있는 원인이 박테리아는 ─ 전세계 주요 건강 문제 ^5입니다. 침입 포유 동물 세포 내에서 복제하는 세포 내 병원체는 병원성 정교한 메커니즘 요인을 취득했다. 이러한 메커니즘은 질병을 일으킬 수있는 능력에 기초하지만, 우리는 그들의 규제와 역학에 대해 조금 알고있다. 액체 배지에서 자란 균의 유전자 발현 프로파일을 숙주 세포 내에서 실제 환경을 반영하지 않기 때문에, 이들의 세포 내 틈새에서 자란 균 사체 분석에 대한 필요가 커지고있다. 이러한 분석은 호스트에 의해 트리거 특정 세균 적응의 해독을 가능하게 할 것이다 및 치료 설계를위한 새로운 목표를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 포유 동물의 RNA가에 의한 세균의 RNA를 능가하기 때문에 세포 내 성장 세균의 사체 분석은 매우 도전최소 10 배. 이 논문에서 우리는 쥐의 대 식세포의 세포 안에 성장 리스테리아 박테리아에서 세균의 RNA를 분리하는 실험 방법을 설명합니다. 추출 된 RNA는 세포 적응 및 RT-PCR, RNA-SEQ 마이크로 어레이 혼성화 및 다른 기반 기술로서 전사 분석의 다양한 기술에 의해 병원균의 독성 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

리스테리아 모노 사이토 겐은 인간의 리스테리아 증의 원인이되는 에이전트, 주로 면역 개인, 노인과 임산부 ^{(6)를 대상으로} 임상 증상을 가진 질환이다. 이것 ⁷ 연구 호스트 병원체 상호 작용 모델로서 수십 년 동안 사용 된 포유 동물 세포의 다양한 침입 그람 양성 통성 세포 내 병원체이다. 침입하면, 그것은 t로 탈출 해야하는에서 액포 또는 (식세포의 경우) phagosome, 초기에 상주그는 복제하기 위해 세포의 세포질을 호스팅합니다. 여러 병원성 인자는 이스케이프 프로세스 주로 조공 용혈,리스 테리 오라 O (LLO) 및 포스 포 개의 추가 ^8을 중재하는 것으로 밝혀진 ^바있다. 세포질에서 박테리아 (그림 1) 세포 내에서 액틴 필라멘트에 자신을 추진 세포에 세포에서 확산 호스트 액틴의 중합 기계를 사용합니다. L.의 모든 주요 독성 요인 침략, 세포 생존과 복제에 관여하는 모노 사이토는, 마스터 독성 전사 조절에 의해 PRFA. ^8-10 활성화됩니다.

지난 10 년 동안 여러 연구는 우리가 수행 등을 성공적으로 숙주 세포 ^2,11-15 내부 세포 내 성장 세균의 사체 분석 방법을 적용했습니다. diffe에 의한 세균의 RNA의 1) 선택적 농축 및 2) RNA 분리 : 두 가지 주요 접근 방식을 기반으로 호스트 RNA에서 세균의 RNA를 분리하는 데 사용됩니다rential 세포 용해. 첫 번째 방법은 (시판 키트를 사용하여 예를 들어) 포유 동물의 RNA 분자에 총 RNA 추출물의 감산 하이브리드 또는 박테리아 전사 시퀀스 (SCOTS) ^(11)의 선택적 캡처에 의존합니다. 두 번째 방법은 균체 그대로 유지하면서 숙주 세포가 용해되어있는 박테리아 숙주 세포의 용해 차분에 의존한다. 세균 세포는 일반적으로 원심 분리에 의해, 숙주 세포 용 해물로부터 분리되고, RNA는 표준 기술을 이용하여 추출 하였다. 이 방법을 사용하는 가장 큰 문제는 그 본래의 박테리아가 숙주 세포의 핵은 또한 분리되어 함께, 따라서 RNA 제제가 여전히 포유류 RNA를 포함한다. 이러한 문제를 극복하는 한가지 방법은이 절차는 일반적으로 추출 동안 유전자 발현 프로파일의 변화의 관계를 상승 시간이 필요하지만, 차등 원심 분리를 이용하여 숙주 세포 핵에서 그대로 박테리아를 분리하는 것이다. 본 논문에서는 개선 및 신속한 바 제시셀 차동 용해 방식에 기초 cteria RNA 추출 프로토콜. 첫째, L. 대식 세포를 감염 모노 사이토 겐을 냉수로 용해된다. 다음으로, 대식 세포 핵에 대한 간단한 원심 분리하여 제거하고 그대로 박테리아가 빠르게하는 RNA에서 세균의 핵산의 뜨거운 페놀 SDS 추출을 사용하여 격리, 필터에 수집됩니다.

프로토콜

주 : 전체 실험 동안, 대식 세포는 5 % CO ₂ 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션 단지 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 수행되는 실험 조작을위한 인큐베이터 취출. L. 작업 모노 사이토 박테리아는 생물 안전 수준이 규정에 따라입니다.

1. 셀 준비 및 세균 감염 (주 1, 2)

1. 1 일
   1. 30 ml의 BMDM + 펜 연쇄상 구균 미디어 (표 2)에서 145mm 접시에 씨앗 2.0 × 10 ⁽⁷⁾ 골수 유래 대 식세포 세포 (BMDM). 각 균주에 대한 종자 3 판을 분석한다. 5 % CO ₂ 강제 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션.
   2. 야생형 (WT) L.의 하룻밤 세균 배양을 시작합니다 표준 인큐베이터에서 30 ° C에서 뇌 심장 주입 (BHI) 배지 10ml에 변형 10403S 모노 사이토 겐. 지역 문화 튜브는 흔들림없이 경사. 노트:이러한 성장 조건은 효율적인 감염을 촉진 편모 유전자의 발현을 상향 조절한다.
2. 2 일
   1. 37 ° C에서 사전 따뜻한 BMDM의 (펜 연쇄상 구균의 항생제없이) 매체 (표 2)와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS).
   2. 항생제를 제거하기 위해 미리 예열 PBS의 25 ㎖로 두 번 대식 세포 단층을 씻으십시오. 30 ml의 신선한 BMDM 매체를 추가합니다.
   3. 1 분> 14,000 XG에 박테리아를 원심 분리 상층 액을 폐기하고, 피펫 팅에 의해 PBS 1.5 ㎖에 부드럽게 박테리아를 재현 탁하여 PBS에 밤새 박테리아 문화의 1.5 ml를 씻으십시오. 두 번 반복합니다.
   4. 야생형 L.의 세척 하룻밤 문화의 0.5 ml의 각 식세포 판을 감염 모노 사이토. 여러 판을 사용하는 경우, 따로 따로 각 플레이트 15 분을 감염. 이 시간 간격은 감염​​의 끝에 개별적 플레이트를 수확있게된다.
      참고 : 감염 다중도 (MOI)가 직렬 희석 도금에 의해 분석된다세균 배양의 37 ° C에서 플레이트의 24 시간 배양 후 BHI 한천 플레이트와 계산 집락 형성 단위 (CFU)의 감염에 사용됩니다. WT L. 0.5ml를 사용 모노 사이토는 ~ 100 MOI에서 10403S 결과 (대식 세포 당 100 세균 CFU)을 변형. 세포 성장 결함 세균의 돌연변이를 분석 할 때, 높은 MOI 고려되어야한다.
   5. 37 ° C에서 0.5 시간 배양 후, 부착 균을 제거하고, PBS로 두 번 감염된 세포를 씻어, 30 ml의 미리 예열 BMDM 매체를 추가 할 수 있습니다. 첨부 박테리아는 다음 0.5 시간 동안 내면화한다.
   6. 세포 외 박테리아를 죽일 : (50 μg / ML의 최종 농도에 도달하는 1000 1) 1 시간 후 감염에서, 겐타 마이신의 30 μl를 추가합니다.
   7. 진공 배출구가있는 플라스크에 수집 액체 필터 헤드를 배치하여 필터 장치를 조립한다. 이어서 실린더 깔때기 다음 필터 헤드에 필터 (0.45 μm의)를 배치하고, 금속 코팅과 다른 부분을 확보램프. 얼음처럼 차가운의 RNase없는 물을 준비합니다.
   8. 다음과 같이 감염된 세포에서 6 시간 후 감염, 수확 박테리아에서. 개별적으로 각각의 판을 취급합니다.
      참고 : 일반적으로, L.를 모노 사이토는 대식 세포에서 감염 6 시간 동안 성장의 한 로그를 완료합니다. 짧은 배양 기간이 상당히 낮은 세균 부하를 초래할 수있는 동안 더 배양은 세균 증식 및 대 식세포의 세포 사망을 초래할 수 있습니다. MOI 및 감염 시간은 최적의 조건에 도달하기 위해 수정 될 수있다.
      1. 한 번 PBS에 감염된 세포를 씻으십시오. 대식 세포 용균 할 빙냉의 RNase가없는 물 20 ㎖를 추가한다. 셀 스크레이퍼를 사용하여, 신속하지만 신중 판 떨어져 세포를 긁어.
      2. 50 ML 원뿔 튜브에 용해 세포를 수집합니다. 30 초 동안 소용돌이. 4 ℃에서 3 분 800 XG에 원심 분리기.
      3. 진공 시스템을 이용한 필터 장치를 통해 상청액을 통과한다. CONI ml의 필터를 출시하고 신속하게 (15)로 전송, 핀셋을 사용하여칼 튜브. 액체 질소의 필터 튜브를 스냅 동결.
      4. 1.2.7에 설명 된 것처럼, 다음 샘플을 위해 새로운 필터로 여과 장치를 조립한다.
      5. 다음날 -80 ° C에서 냉동 필터를 저장합니다. 대안 적으로, 핵산 추출 진행할.

2. 핵산 추출 (3 일)

참고 : 흄 후드에서 페놀과 클로로포름 솔루션으로 모든 조작을 수행합니다.

1. 1 산성화 페놀의 혼합 : 클로로포름, 각 시료 400 ㎕의 1을 준비합니다. 별도의 튜브에 혼합 한 후 흡인에 의해 생성 된 수성 층을 철회. 10 % SDS 40 μl를 추가합니다.
2. 감기를 유지하기 위해 얼음에 필터 함유 튜브를 해동. 각 필터 함유 튜브에 아세테이트 - EDTA (AE) 버퍼 (표 2)의 650 μl를 추가합니다.
3. 가능한 빨리 다음 단계를 수행한다.
   1. 이렇게 적극적으로 필터를 포함하는 튜브를 와동상기 필터는 상기 튜브의 외주에 턴다 버퍼 완전 필터를 세척있다. 항상 얼음에 다시 배치하여 튜브 감기를 유지합니다. 참고 : 완전히 필터 떨어져 박테리아를 씻어 반전하면서 추가로 튜브를 와동하는 것이 필요할 수있다.
   2. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이는 스핀 다운하는 짧게 현탁액 (120 XG에서 1 분) 프로세스의 마지막에 유용 할 수있다.
4. SDS 및 (2.1 제조) 페놀 / 클로로포름 혼합물을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 박테리아 - 함유 버퍼를 옮긴다. 모든 튜브에 대해 반복합니다. 이 필터에서 잔류 버퍼를 얻기 위해 다시 필터를 포함하는 튜브 (120 XG에 1 분) 회전 할 필요가있다.
5. 10 분 동안 전속력으로 모든 1.5 ml의 다중 튜브 소용돌이 장치의 튜브 및 소용돌이를 놓습니다.
6. 10 분 동안 65 ℃로 가열 블록에서 튜브 부화. 5 분 동안 최대 속도 (> 14,000 XG)에서 원심 분리기.
7. 각 t로부터 수층 (약 400 μL)을 전송3M 아세트산 나트륨 (pH5.2) 및 1.0 ml의 100 % 에탄올 40 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 새로운 튜브 우베. 철저하게 각 튜브를 소용돌이.
   참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다.
8. 1 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 인큐베이션. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 그런 다음, 최대 속도 (> 14,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기.
9. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올 (상위 계층)을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도 (> 1 4,000 XG)에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기.
10. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오.
11. 각 샘플 25 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가합니다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. 조심스럽게 소용돌이와 스핀 다운.
12. t에서 RNA의 농도를 측정microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 그 샘플. 접시 당 핵산의 1 μg의 - 약 0.5를 추출 할 전망이다.
    참고 기술 복제는이 단계에서 결합 될 수있다.

3. DNase의 치료

1. 의 microfuge 튜브 표 1에 따라 반응을 설정합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어. 450 μL의 RNase없는 물과 최대 속도 (> 14,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 페놀 - 클로로포름-IAA 믹스 (표 2), 별도의 단계 500 μl를 추가합니다.
2. 새로운 튜브로 수층을 전송 및 최대 속도 (> 14,000 XG)에서 2 분간 원심 분리하여 500 ㎕의 클로로포름을 IAA 혼합물 (표 2), 와류 분리 단계를 추가한다.
3. 새로운 튜브로 수층을 전송 및 에탄올 1 ㎖ 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2)의 50 μL를 추가한다. 와동.
   참고 글리코겐 침전 된 펠렛의 시각화를 향상시키기 위해이 단계에서 첨가 될 수있다.
-80 ° C에서 1 시간 동안 품어. 또한, C 하룻밤 -20 °에서 샘플을 품어. 최대 속도로 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기.
4. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음. 철저하게 각 샘플 및 와동 500 μL 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 최대 속도에서 20 분 동안 4 ° C에서 원심 분리기. 조심스럽게 각 튜브에서 에탄올을 대기음.
5. 전혀 열을 진공 증발기를 이용하여 약 2 분 동안 샘플을 건조. 샘플을 지나치게 건조하지 마십시오.
6. 실내 온도, 소용돌이, 스핀 다운에서 2 분 동안 품어의 RNA 분해 효소가없는 물을 12 μl를 추가합니다. 샘플은, 정제 된 RNA를 포함 얼음에 보관하십시오. 대안 적으로, RNA에 용해 된 RNase가없는 H ₂ O를 0.1 mM의 EDTA 또는 TE 완충액 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA)와.
7. microvolume UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정한다. (기술 복제가 결합 된 경우) 샘플 당 RNA의 ~ 100 NG를 기대합니다.
   참고 : RNA 추출이 프로토콜에 따른 FO 적합여러 기술에 의해 R 유전자 전사 분석. 우리는 일반적으로 L.을 연구하는 RT-qPCR에 분석을 사용 식세포 ^1-4 감염시 유전자 전사 모노 사이토 겐.

결과

모델 시스템은도 1에 도시 L. 감염 대 식세포를 포함 대 식세포의 세포질에서 복제 박테리아, 모노 사이토 겐. (2) 실험 방식을 나타내는 그림. 그림 3은 WT L. 동안 독성 유전자의 예 RT-qPCR에 분석의 전형적인 결과를 나타냅니다 풍부한 실험실 매체 BHI의 성장에 비해 식세포의 성장 모노 사이토 겐....

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 L.에서 세균 RNA의 분리를위한 최적의 방법을 나타냅니다 대식 세포에서 세포 내 성장 세균 모노 사이토 겐. 이 프로토콜은 세포 용해 차분에 기초하여 세균 RNA의 농축을위한 두 가지 주요 단계를 포함한다 : 원심 분리 및 여과에 의해 박테리아의 신속한 수집을 사용하여 대 식세포 핵 침강. 이 단계는 표준 RNA 추출 과정 뒤 따른다. 이 프로토콜은 listerial RNA?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen