JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Аннотация

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Введение

Внутриклеточные бактериальные патогены ─ бактерии , вызывающие инфекционные заболевания и способны расти и воспроизводить внутри клеток человека хозяев ─ являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире 5. Для того, чтобы вторгнуться и размножаться внутри клетки млекопитающих, внутриклеточные патогены приобрели сложные механизмы вирулентности и факторы. В то время как эти механизмы имеют основополагающее значение для способности вызывать заболевание, мы мало знаем о их регуляции и динамики знают. Так как профили экспрессии генов бактерий, выращенных в жидких средах, не отражают реальную среду внутри клеток-хозяев, существует растущая потребность в транскриптома анализа бактерий, выращенных в их внутриклеточных ниш. Такой анализ позволит расшифровку специфических бактериальных адаптаций сработавших хозяином и поможет определить новые цели для терапевтического дизайна. Транскриптом анализ внутриклеточно выращенных бактерий является весьма сложной задачей, поскольку РНК млекопитающих превышает число бактерий РНК вкак минимум в десять раз. В этой рукописи мы опишем экспериментальный метод для выделения бактериальной РНК из листерий бактерий , растущих внутри мышиных клеток макрофагов. Извлеченный РНК может быть использован для изучения внутриклеточных адаптации и вирулентность механизмов патогенных бактерий с помощью различных методик анализа транскрипции, таких как RT-PCR, РНК-Seq, микрочипов и других гибридизацией на основе технологий.

L. моноцитогенес является возбудителем листериоза у людей, заболевание с клиническими проявлениями , ориентированных в первую очередь лица с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин 6. Это является грамположительных факультативным внутриклеточным патогеном , который вторгается широкий спектр клеток млекопитающих , которые были использованы на протяжении десятилетий в качестве модели в хозяин-патоген взаимодействий изучает 7. После вторжения, он находится первоначально в вакуоли или фагосому (в случае фагоцитирующих клеток), из которых он должен уйти в тон пройдет цитозоль клетки для репликации. Несколько факторов вирулентности было показано, опосредует процесс утечки, в первую очередь в качестве порообразующего гемолизин, Listeriolysin O (ДСО) и два дополнительных фосфолипаз 8. В цитоплазме бактерии используют хозяина машины полимеризации актина , чтобы продвинуть себя на актиновых филаментов внутри клетки и передается от клетки к клетке (Рисунок 1). Все основные факторы вирулентности L. моноцитогенес , участвующие в инвазии, внутриклеточного выживания и репликации, активируются с помощью регулятора транскрипции мастер вирулентности, PrfA. 8-10.

В последнее десятилетие было проведено несколько исследований , проведенных нами и другие успешно применяются методы транскриптом анализа внутриклеточно выращенных бактерий внутри клеток хозяина 2,11-15. Два основных подхода используются для разделения бактериальной РНК из хозяина-РНК, которые основаны на: 1) селективное обогащение бактериальной РНК и 2) выделения РНК по сиситемахrential лизис клеток. Первый подход основан на субтрактивном гибридизации общих экстрактов РНК молекулы РНК млекопитающих (например , с использованием коммерчески доступных наборов) или селективного захвата бактериальных последовательностей транскрибируемых (шотландцы) 11. Второй подход основан на дифференциальном лизис бактерий и клеток-хозяев, в котором клетки-хозяева лизируют в то время как бактериальные клетки остаются нетронутыми. Бактериальные клетки затем отделяют от клетки-хозяина лизата, как правило, путем центрифугирования, и РНК экстрагируют с использованием стандартных методик. Основная проблема с использованием этого подхода является то, что вместе с интактной бактерии, клетки-хозяева ядра также изолированы, таким образом, препараты РНК по-прежнему содержат РНК млекопитающих. Один из способов решения этой проблемы заключается в разделении неповрежденные бактерии из клеток хозяина, ядер с использованием дифференциального центрифугирования, хотя эта процедура обычно занимает много времени поднимая беспокойство изменений в гене профиля экспрессии в процессе экстракции. В этой статье мы представляем улучшенный и быстрый баПротокол экстракции cteria РНК, которая основана на клеточной дифференциального лизиса подхода. Во- первых, Л. моноцитогенес инфицированные макрофаги клетки лизируют с холодной водой. Затем макрофаг ядра удалены кратковременным центрифугированием и неповрежденные бактерии быстро собирают на фильтрах, из которых РНК выделяют с помощью горячей экстракции фенолом-SDS бактериальных нуклеиновых кислот.

протокол

Примечание: В течение всего эксперимента, макрофаг клетки инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе и вынимали из инкубатора только для экспериментальных манипуляций, которые выполняются в кабинете биологической безопасности класса II. Работа с L. моноцитогенес бактерии в соответствии с биологическим уровнем безопасности 2 правил.

1. Сотовый Подготовка и бактериальные инфекции (день 1 и 2)

  1. 1 день
    1. Семенной 2,0 х 10 7 из костного мозга макрофаги (клетки BMDM) на 145 мм чашку в 30 мл BMDM + Pen-Strep средах (таблица 2). Семенной 3 пластины для каждого бактериального штамма, чтобы быть проанализированы. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 приточно-инкубаторе.
    2. Начало ночной бактериальной культуры дикого типа (WT) L. моноцитогенес штамм 10403S в 10 мл мозга и сердца вливание (BHI) среды, при температуре 30 ° C в стандартном инкубаторе. Место культуры трубки наклонены без встряхивания. Заметка:Эти условия роста вверх-регулируют экспрессию генов жгутиков, что способствует эффективной инфекции.
  2. День 2
    1. Предварительно теплая BMDM среда (без Пен-Strep антибиотиков) (Таблица 2) и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , при 37 ° С.
    2. Вымойте макрофагами монослой дважды 25 мл подогретого PBS для удаления антибиотики. Добавьте 30 мл свежей BMDM среды.
    3. Промыть 1,5 мл ночной бактериальной культуры с PBS при центрифугировании бактерии при> 14.000 х г в течение 1 мин, отбрасывая супернатант и ресуспендирования бактерий осторожно в 1,5 мл PBS с помощью пипетки. Повторите дважды.
    4. Infect каждую макрофага пластину с 0,5 мл промытого ночной культуры дикого типа L. моноцитогенес. При использовании нескольких пластин, заражает каждую пластину 15 минут друг от друга. Этот временной интервал позволит заготовки каждой пластины индивидуально в конце инфекции.
      Примечание: множественность инфекции (MOI) анализируют при посеве серийным разведениемс бактериальной культуры использовали для инфицирования на чашках с BHI и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) после 24 ч инкубации планшетов при 37 ° С. С использованием 0,5 мл WT L. моноцитогенес напрягать 10403S результаты в УМВД ~ 100 (100 бактерий КОЕ на макрофагальной клетки). При анализе бактериальных мутантов дефектные в внутриклеточного роста, выше MOI следует рассмотреть.
    5. После 0,5 ч инкубации при температуре 37 ° С, промыть инфицированные клетки дважды с PBS, чтобы удалить неприкрепленные бактерии, и добавляют 30 мл подогретого BMDM среды. Прикрепленные бактерии будут усваивать в течение следующего 0,5 ч.
    6. Через 1 ч после инфицирования, добавить 30 мкл гентамицина (1: 1000 до конечной концентрации 50 мкг / мл), чтобы убить внеклеточные бактерии.
    7. Сборка устройства фильтра путем размещения головки фильтра на накопительную колбу жидкости с вакуумным выпускным отверстием. Затем поместите фильтр (0,45 мкм) на головке фильтра, а затем с помощью цилиндра воронки и креплению различных частей с металлической Cлампа. Подготовьте ледяную РНКазы воду.
    8. Через 6 ч после инфицирования, урожай бактерий из инфицированных клеток следующим образом. Рассматривать каждую тарелку по отдельности.
      Примечание: Как правило, L. моноцитогенес завершает 1-журнал роста в течение 6 ч инфекции в клетках макрофагов. Более длинные инкубирование может привести к бактериальному росту и гибели клеток макрофагов, в то время как более короткие периоды инкубации может привести к значительно более низкие бактериальной нагрузки. MOI и время инфицирования могут быть изменены, чтобы достичь оптимальных условий.
      1. Промыть инфицированные клетки с PBS один раз. Добавьте 20 мл охлажденного на льду не содержащей РНКазы воды, чтобы лизировать клетки макрофагов. Использование сотового скребок, скрести клетки от пластины быстро, но осторожно.
      2. Сбор лизированных клеток в коническую пробирку на 50 мл. Vortex в течение 30 сек. Центрифуга при 800 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
      3. Пропускают супернатант через устройство фильтра с использованием вакуумной системы. С помощью пинцета, катить фильтр и быстро перенести его на 15 мл Coniкал трубки. Оснастка замерзают трубы с фильтрами в жидком азоте.
      4. Собирают устройство с фильтрующей новым фильтром для следующего образца, как описано в разделе 1.2.7.
      5. Хранить замороженные фильтры при температуре -80 ° С в течение следующего дня. В качестве альтернативы, перейдем непосредственно к экстракции нуклеиновой кислоты.

2. нуклеиновые кислоты экстракции (3-й день)

Примечание: Выполнить все манипуляции с фенолом и хлороформом растворов в вытяжном шкафу.

  1. Готовят смесь 1: 1 подкисленного фенол: хлороформ, 400 мкл каждого образца. Смешайте в отдельные пробирки, а затем вывести полученный водный слой с помощью аспирации. Добавьте 40 мкл 10% SDS.
  2. Растаяйте фильтров, содержащих пробирки на лед, чтобы держать их холодно. Для каждого фильтра , содержащего пробирку добавляют 650 мкл ацетатного-ЭДТА (АЭ) буфера (таблица 2).
  3. Выполните следующие шаги как можно быстрее.
    1. Энергично вихрь трубки, содержащей фильтр таким образом,что фильтр венчиков к периферии трубы и буфер полностью промывает фильтр. Всегда держите трубки с холодным, поместив его на льду. Примечание: Может возникнуть необходимость дополнительно вихревой трубки в то время как перевернутая, чтобы полностью вымыть бактерии из фильтра.
    2. Повторите эти действия для всех труб. Может быть полезным, чтобы спин-вниз подвеску коротко (1 мин при 120 х г) в конце процесса.
  4. Перенести бактерии-содержащий буфер в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ДДС и фенол / хлороформ смеси (полученного в 2.1). Повторите эти действия для всех труб. Это может быть необходимо, чтобы закрутить фильтр, содержащий трубы (1 мин при 120 х г) еще раз, чтобы получить остаточный буфер из фильтра.
  5. Поместите все в 1,5 мл трубки в вихревом устройстве с несколькими трубками и завихрение на полной скорости в течение 10 мин.
  6. Инкубировать пробирки в тепловой блок 65 ° C в течение 10 мин. Центрифуга на максимальной скорости (> 14 000 XG) в течение 5 мин.
  7. Перенести водный слой (около 400 мкл) из каждого тUbe к новой 1,5 мл пробирку, содержащую 40 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 1,0 мл 100% этанола. Vortex каждую пробирку тщательно.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  8. Инкубируйте образцы при -80 ° С в течение 1 часа. В качестве альтернативы, инкубировать образцов при -20 ° С в течение ночи. Затем, Центрифуга образцов при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  9. Тщательно аспирата от этанола (верхний слой) из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости (> 1 4000 XG).
  10. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  11. Добавьте 25 мкл РНКазы без воды к каждому образцу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Аккуратно вихря и спин-вниз.
  12. Измерение концентрации РНК в тон пробует, используя микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать добывать около 0,5 - 1 мкг нуклеиновых кислот на чашку.
    Примечание: Технические повторностях могут быть объединены на данном этапе.

3. ДНКазы Лечение

  1. Настройка реакции в соответствии с таблицей 1 , в пробирке. Инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин. Добавить 450 мкл РНКазы воды и 500 мкл фенолхлороформом-МАА смеси (таблица 2), отдельные фазы центрифугированием в течение 2 мин при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  2. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 500 мкл хлороформа-МАА смеси (таблица 2), вихревые и отдельные фазы 2 мин центрифугированием при максимальной скорости (> 14 000 XG).
  3. Передача водного слоя в новую пробирку и добавляют 1 мл этанола и 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2). Vortex.
    Примечание: Гликоген могут быть добавлены на данном этапе, чтобы улучшить визуализацию осажденного гранул.
  4. Выдержите в течение 1 ч при -80 ° С. В качестве альтернативы, инкубировать образцов при -20 ° С в течение ночи. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости.
  5. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки. Добавить 500 мкл холодного 70% этанола к каждому образцу и вихре тщательно. Центрифуга при 4 ° С в течение 20 мин при максимальной скорости. Тщательно аспирата от этанола из каждой пробирки.
  6. Сухие образцы в течение примерно 2 мин с использованием вакуумного испарителя без отопления. Не пересушивайте образцы.
  7. Добавьте 12 мкл РНКазы воды, инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре, вихревые и спин-вниз. Образцы содержат очищенный РНК, держать их на льду. В качестве альтернативы, растворить РНК в РНКазы H 2 O с 0,1 мМ ЭДТА или ТЕ - буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА).
  8. Измерение концентрации РНК с использованием микрообъем UV-Vis спектрофотометр. Ожидать ~ 100 нг РНК на образец (если технические повторности объединены).
    Примечание: РНК экстрагировали в соответствии с этим протоколом подходит FOг анализ транскрипцию генов несколькими способами. Как правило , мы используем анализ RT-КПЦР для изучения L. моноцитогенес транскрипцию генов при заражении клеток макрофагов 1-4.

Результаты

Система модель показана на фиг.1 , и включает в себя клетки макрофагов инфицированных L. моноцитогенес бактерии, которые копируют в цитоплазме макрофага. Рисунок 2 представляет собой схему эксперимента. На рисунке 3 представлены типичны?...

Обсуждение

Протокол , описанный здесь , представляет собой оптимизированный способ выделения бактериальной РНК из L. моноцитогенес бактерии растущих внутриклеточно в клетках макрофагов. Этот протокол основан на лизисе клеток дифференциального и включает в себя два основных шага для обогащ?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Listeria monocytogenes 10403S20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice21
H2O, RNAse freeThermo Scientific10977-015DEPC-treated water can be used
DMEMGibco41965039
GlutamineGibco25030081
Sodium pyruvateGibco11360-088
β-MercaptoethanolGibco31350010
Pen/StrepGibco15140-122
GentamicinSigma-AldrichG1397
FBSGibco10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBSSigma-AldrichD8537
Brain heart infusion (BHI)Merckmillipore1104930500
Phenol saturated pH 4.3FisherBP1751I-400
ChloroformFisherBP1145-1
Iso-amyl alcoholSigma-AldrichW205702
Sodium acetateSigma-AldrichW302406
EDTASigma-AldrichEDS
DNaseIFermentasEN0521
SDS 10%Sigma-AldrichL4522
Ethanol absoluteMerck Millipore1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubatorThermo ScientificModel 3111
Cell scrapersNunc179693
Kontes glass holder for 45 mm filtersFisherK953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µmMerck MilliporeHAWP04700
SpeedVac systemThermo ScientificSPD131DDA
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesModel G560E
NanoDropThermo Scientific
145 mm cell culture dishesGreiner639 160
1.7 ml tubes, RNase-freeAxygenMCT-175-C
30 °C incubatorThermo Scientific
65 °C heat blockThermo Scientific
4 °C table centrifugeEppendorf5417R
Sterile pipettes, 25 mlGreiner
Falcon tubes, 50 mlGreiner
Liquid nitrogen

Ссылки

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  6. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  7. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  8. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  9. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  10. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  11. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  12. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  13. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  14. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  15. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  16. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  17. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  18. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  19. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  20. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены