ARN Purification de Intracellulairement Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Dans les cellules macrophages

Résumé

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Résumé

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Introduction

Bactéries pathogènes intracellulaires ─ bactéries causant des maladies infectieuses et capables de croître et de reproduction des cellules à l' intérieur de l' hôte humain ─ sont un problème de santé majeur dans le monde entier ^5. Envahir et se répliquer dans une cellule de mammifère, les agents pathogènes intracellulaires ont acquis des mécanismes et des facteurs de virulence sophistiqués. Bien que ces mécanismes sont essentiels à la capacité de provoquer une maladie, nous savons peu de choses sur leur régulation et de la dynamique. Comme les profils d'expression des gènes de bactéries cultivées dans un milieu liquide ne reflètent pas l'environnement réel dans les cellules hôtes, il y a un besoin croissant de transcriptome analyses de bactéries cultivées dans leurs niches intracellulaires. Ces analyses permettront au déchiffrement des adaptations bactériennes spécifiques déclenchées par l'hôte et aidera à identifier de nouvelles cibles pour la conception thérapeutique. L'analyse du transcriptome de bactéries intracellulairement cultivées est très difficile puisque l'ARN mammifère sont plus nombreux que l'ARN bactérien par aumoins dix fois. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode expérimentale pour isoler l' ARN bactérien de la bactérie Listeria monocytogenes croissance à l' intérieur de cellules macrophages murins. L'ARN extrait peut être utilisé pour étudier des adaptations et des mécanismes intracellulaires de virulence de bactéries pathogènes, par diverses techniques d'analyse de la transcription, tels que la RT-PCR, l'ARN-Seq, puces à ADN et d'autres techniques à base d'hybridation.

L. monocytogenes est l'agent causal de la listériose chez l' homme, une maladie avec des manifestations cliniques ciblant principalement les personnes immunodéprimées, les personnes âgées et les femmes enceintes ^6. Il est un pathogène intracellulaire facultatif Gram positif qui envahit un large éventail de cellules de mammifères qui ont été utilisés pendant des décennies comme un modèle dans les interactions hôte-pathogène études ^7. Lors de l'invasion, il se trouve d'abord dans une vacuole ou le phagosome (dans le cas des cellules phagocytaires), à partir duquel il doit s'échapper en til accueille cytosol des cellules afin de répliquer. On a montré que plusieurs facteurs de virulence à la médiation du processus d'échappement, essentiellement la hémolysine formant des pores, listériolysine O (LLO) et deux autres phospholipases ^8. Dans le cytosol , les bactéries utilisent la machinerie de polymérisation de l' actine hôte pour se propulser sur les filaments d'actine au sein de la cellule et de se propager de cellule à cellule (Figure 1). Tous les principaux facteurs de virulence de L. monocytogenes impliqués dans l' invasion, la survie intracellulaire et la réplication, sont activés par le régulateur de transcription maître de virulence, PrfA. ^8-10.

Dans la dernière décennie, plusieurs études menées par nous et d' autres ont des méthodes d'analyse de transcriptome des bactéries intracellulairement cultivées appliquée avec succès à l' intérieur des cellules hôtes ^2,11-15. Deux approches principales sont utilisées pour séparer l'ARN bactérien de l'hôte-ARN qui sont basées sur: 1) l'enrichissement sélectif de l'ARN bactérien et 2) l'isolement de l'ARN par diffelyse cellulaire rentiel. La première approche repose sur l' hybridation soustractive d'extraits d'ARN totaux à des molécules d'ARN de mammifères (par exemple en utilisant des kits disponibles dans le commerce) ou la capture sélective de séquences transcrites bactériennes (Scots) ^11. La seconde approche est basée sur la lyse différentielle des bactéries et des cellules hôtes, dans lequel les cellules hôtes sont des cellules bactériennes lysées tandis que restent intactes. Les cellules bactériennes sont ensuite séparés du lysat des cellules hôtes, habituellement par centrifugation, et l'ARN est extrait en utilisant des techniques standard. Le principal problème avec cette approche est que, avec des bactéries intactes, des cellules hôtes sont également des noyaux isolés, ainsi les préparations d'ARN contiennent encore l'ARN mammifère. Une façon de surmonter ce problème est de séparer les bactéries intactes à partir des cellules hôtes noyaux par centrifugation différentielle, bien que cette procédure prend généralement du temps soulevant l'inquiétude des changements dans le profil d'expression génique lors de l'extraction. Dans cet article, nous présentons un ba amélioré et rapidecteria protocole d'extraction d'ARN, qui est basée sur la différence de l'approche de lyse cellulaire. Tout d' abord, L. monocytogenes infectées par les cellules macrophages sont lysés avec de l' eau froide. Ensuite, les noyaux macrophage sont éliminés par une brève centrifugation et bactéries intactes sont rapidement collectées sur les filtres, à partir de laquelle l'ARN est isolé par extraction phénol-SDS à chaud des acides nucléiques bactériens.

Protocole

Remarque: Au cours de toute l' expérience, les cellules macrophagiques sont mises en incubation à 37 ° C dans un CO ₂ par air pulsé incubateur à 5% et retirés de l'incubateur seulement pour des manipulations expérimentales, qui sont exécutées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II. Travailler avec L. bactéries monocytogenes est en fonction du niveau de sécurité biologique 2 règlements.

Préparation et infection bactérienne (Jour 1 et 2) 1. Cellule

1. jour 1
   1. Cellules de semences 2,0 x 10 ⁷ de la moelle osseuse dérivées de macrophages (BMDM) sur une boîte de 145 mm dans 30 ml BMDM + média Pen-Strep (tableau 2). Seed 3 plaques pour chaque souche bactérienne à analyser. Incuber une nuit à 37 ° C dans CO ₂ à air forcé incubateur à 5%.
   2. Lancer une culture bactérienne d'une nuit de type sauvage (WT) L. monocytogenes 10403S souche dans 10 ml de cerveau - coeur (BHI) moyenne, à 30 ° C dans un incubateur standard. tubes Lieu de culture inclinés sans agitation. Remarque:Ces conditions de croissance régulent à la hausse l'expression des gènes de flagelles, ce qui favorise une infection efficace.
2. Jour 2
   1. Moyen Préchauffer BMDM (sans antibiotiques Pen-Strep) (tableau 2) et du tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C.
   2. Laver monocouche macrophage deux fois avec 25 ml de pré-chauffé PBS pour éliminer les antibiotiques. Ajouter 30 ml de milieu de BMDM frais.
   3. Laver 1,5 ml de culture bactérienne pendant une nuit avec du PBS par centrifugation des bactéries à> 14 000 x g pendant 1 minute, élimination du surnageant et remise en suspension des bactéries doucement dans 1,5 ml de PBS par pipetage. Répéter deux fois.
   4. Infect chaque plaque macrophage avec 0,5 ml d'une culture d'une nuit lavée de type sauvage L. monocytogenes. Si vous utilisez plusieurs plaques, infecter chaque plaque 15 min d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de récolter chaque plaque individuellement à la fin de l'infection.
      Remarque: La multiplicité d'infection (MOI) est dosé par étalement des dilutions en séries de la culture bactérienne utilisée pour l'infection sur des plaques d'agar BHI et en comptant les unités formant colonie (UFC) après 24 heures d'incubation des plaques à 37 ° C. Utiliser 0,5 ml de WT L. monocytogenes souche résultats 10403S dans une MOI de ~ 100 (100 bactéries CFU par cellule de macrophage). Lors de l'analyse des mutants bactériens défectueux dans la croissance intracellulaire, un MOI plus élevé devrait être envisagée.
   5. Après 0,5 heures d'incubation à 37 ° C, laver les cellules infectées à deux reprises avec du PBS, pour éliminer les bactéries seules, et ajouter 30 ml de milieu BMDM préchauffé. bactéries attachées seront internaliser pendant 0,5 heure suivante.
   6. A 1 après l'infection h, ajouter 30 pl de gentamicine (1: 1000 pour atteindre une concentration finale de 50 pg / ml) pour tuer les bactéries extra-cellulaires.
   7. Assembler l'appareil de filtration en plaçant une tête de filtre sur un flacon collecteur de liquide avec un orifice de sortie de vide. Ensuite, placer un filtre (0,45 pm) sur une tête de filtre, suivie d'une ampoule à cylindre et fixer les différentes parties d'un métal clampe. Préparer l'eau sans RNase glacée.
   8. À 6 heures après l'infection, les bactéries de la récolte des cellules infectées comme suit. Traiter chaque plaque individuellement.
      Note: Habituellement, L. monocytogenes complète de 1 log de ​​la croissance pendant 6 heures de l' infection dans les cellules macrophages. incubations plus longues pourraient entraîner une prolifération bactérienne et la mort cellulaire des macrophages, alors que les périodes d'incubation plus courtes pourrait entraîner des charges bactériennes considérablement plus faibles. MOI et le moment de l'infection peuvent être modifiées pour atteindre des conditions optimales.
      1. Laver les cellules infectées par le PBS une fois. Ajouter 20 ml d'eau sans RNase glacée pour lyser les cellules macrophages. L'utilisation d'un racleur de cellules, racler les cellules de la plaque rapidement mais soigneusement.
      2. Recueillir les cellules lysées dans un tube conique de 50 ml. Vortex pendant 30 secondes. Centrifuger à 800 xg pendant 3 min à 4 ° C.
      3. Passer le surnageant à travers le dispositif de filtre à l'aide d'un système à vide. En utilisant une pince à épiler, rouler le filtre et le transférer à un 15 ml rapidement conile tube cal. Snap-geler les tubes avec les filtres dans de l'azote liquide.
      4. Assembler l'appareil de filtration avec un nouveau filtre pour l'échantillon suivant, comme décrit dans 1.2.7.
      5. Conserver les filtres congelés à -80 ° C pour le lendemain. Sinon, passez directement à l'extraction d'acide nucléique.

2. Nucleic Acids Extraction (Jour 3)

Remarque: Effectuez toutes les manipulations avec des solutions de phénol et de chloroforme dans une hotte.

1. Préparer un mélange 1: 1 de phénol acidifiés: le chloroforme, 400 ul de chaque échantillon. Mélanger dans des tubes séparés, puis de retirer la couche aqueuse résultante par aspiration. Ajouter 40 pl de SDS à 10%.
2. Décongeler les tubes contenant filtres sur la glace pour les garder froids. A chaque tube contenant un filtre à ajouter 650 ul d'acétate-EDTA (AE) tampon (tableau 2).
3. Effectuez les étapes suivantes le plus rapidement possible.
   1. Vigoureusement vortex le tube contenant le filtre de sorteque le filtre transporte vers la périphérie du tube et le tampon lave complètement le filtre. Toujours garder le froid du tube en le plaçant de retour sur la glace. Remarque: Il peut être nécessaire de vortex en outre le tube tout inversé pour laver complètement les bactéries hors du filtre.
   2. Répétez l'opération pour tous les tubes. Il peut être utile de tourner vers le bas de la suspension peu (1 min à 120 xg) à la fin du processus.
4. Transférer le tampon des bactéries contenant un tube de 1,5 ml contenant du SDS et du phénol / chloroforme mélange (tel que préparé à 2.1). Répétez l'opération pour tous les tubes. Il peut être nécessaire de faire tourner les filtres contenant des tubes (1 min à 120 x g) à nouveau pour obtenir un tampon résiduel du filtre.
5. Placer tous les tubes de 1,5 ml dans un dispositif à tourbillon multi-tubes, et vortex à pleine vitesse pendant 10 min.
6. Incuber les tubes dans un bloc chauffant à 65 ° C pendant 10 min. Centrifugeuse à vitesse maximale (> 14.000 xg) pendant 5 min.
7. Transférer la phase aqueuse (environ 400 pi) de chaque tube à un nouveau tube de 1,5 ml contenant 40 ul d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 1,0 ml d'éthanol à 100%. Vortex soigneusement chaque tube.
   Remarque: Le glycogène peut être ajouté à cette étape pour améliorer la visualisation de la pastille précipitée.
8. Incuber les échantillons à -80 ° C pendant 1 heure. Alternativement, incuber les échantillons à -20 ° C pendant la nuit. Ensuite, centrifuger les échantillons à 4 ° C pendant 20 min à vitesse maximale (> 14 000 x g).
9. Aspirer avec précaution de l'éthanol (couche supérieure) de chaque tube. Ajouter 500 ul d'éthanol froid à 70% à chaque échantillon et vortexer soigneusement. Centrifuger à 4 ° C pendant 20 min à vitesse maximale (> 1 4000 x g).
10. Aspirer délicatement de l'éthanol à partir de chaque tube. Sécher les échantillons pendant environ 2 minutes en utilisant un évaporateur sous vide sans chaleur. Ne pas trop sécher les échantillons.
11. Ajouter de l'eau sans RNase 25 pi à chaque échantillon. Incuber à température ambiante pendant 20 min. vortex soigneusement et spin-down.
12. Mesurer la concentration en ARN dans les til échantillons à l'aide d'un microvolume spectrophotomètre UV-Vis. Attendez-vous à extraire environ 0,5 à 1 pg d'acides nucléiques par plaque.
    Note: les répétitions techniques peuvent être combinées à ce stade.

3. Traitement de la DNase

1. Mettre en place la réaction selon le tableau 1 dans un tube de microcentrifugation. Incuber à 37 ° C pendant 45 min. Ajouter 450 l' eau libre de RNase-pi et 500 pi de phénol-chloroforme-IAA mélange (tableau 2), des phases séparées par centrifugation pendant 2 min à vitesse maximale (> 14.000 xg).
2. Transférer la couche aqueuse dans un nouveau tube et on ajoute 500 ul de chloroforme-IAA mélange (tableau 2), vortexer et des phases séparées par centrifugation à 2 minutes vitesse maximale (> 14 000 x g).
3. Transférer la couche aqueuse dans un nouveau tube et on ajoute 1 ml d'éthanol et 50 ul d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2). Vortex.
   Remarque: Le glycogène peut être ajouté à cette étape pour améliorer la visualisation de la pastille précipitée.
4. Incuber pendant 1 heure à -80 ° C. Alternativement, incuber les échantillons à -20 ° C pendant la nuit. Centrifuger à 4 ° C pendant 20 min à vitesse maximale.
5. Aspirer délicatement de l'éthanol à partir de chaque tube. Ajouter 500 ul d'éthanol froid à 70% à chaque échantillon et vortexer soigneusement. Centrifugeuse à 4 ° C pendant 20 min à vitesse maximale. Aspirer délicatement de l'éthanol à partir de chaque tube.
6. Sécher les échantillons pendant environ 2 minutes en utilisant un évaporateur sous vide sans chaleur. Ne pas trop sécher les échantillons.
7. Ajouter 12 ul d'eau sans RNase, incuber pendant 2 min à température ambiante, vortex et spin-down. Les échantillons contiennent l'ARN purifié, les garder sur la glace. En variante, on dissout l' ARN dans RNase H ₂ O avec 0,1 mM d' EDTA ou d'un tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
8. Mesurer la concentration d'ARN en utilisant un microvolume spectrophotomètre UV-Vis. Attendez-vous à ~ 100 ng d'ARN par échantillon (si les répétitions techniques sont combinées).
   Note: l'ARN extrait selon ce protocole est adapté for analyse de la transcription génique par des techniques multiples. Nous employons habituellement une analyse par RT-qPCR pour étudier L. monocytogenes transcription génique lors de l' infection des cellules macrophages ^1-4.

Résultats

Le système de modèle est représenté sur la figure 1 et comprend des cellules macrophages infectés par L. monocytogenes, des bactéries qui se répliquent dans le cytoplasme des macrophages. La figure 2 représente le schéma expérimental. La figure 3 représente des résultats typiques d' une telle analyse par RT-qPCR des gènes de virulence pendant WT L. monocytogenes croissance dans les macrophages par rappo...

Discussion

Le protocole décrit ici représente un procédé optimisé pour l' isolement de l' ARN bactérien de L. monocytogenes bactéries en croissance intracellulaire dans les cellules macrophages. Ce protocole est basé sur la lyse différentielle de cellules, et comprend deux grandes étapes d'enrichissement de l'ARN bactérien: macrophage noyaux sédimentation au moyen d'une centrifugation et d'une collecte rapide des bactéries par filtration. Ces étapes sont suivies par un procédé d'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen