A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Resumo

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Resumo

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Introdução

Patógenos bacterianos intracelulares ─ bactérias que causam doenças infecciosas e capaz de crescer e reproduzir no interior das células de hospedeiros humanos ─ são um importante problema de saúde em todo o mundo ^5. Para invadir e replicar dentro de uma célula de mamífero, patogénios intracelulares adquiriram sofisticados mecanismos de virulência e factores. Embora estes mecanismos são fundamentais para a capacidade de causar uma doença, pouco sabemos sobre a sua regulação e dinâmica. Uma vez que os perfis de bactérias cultivadas em meio líquido de expressão de genes não reflectem o ambiente real dentro de células hospedeiras, existe uma necessidade crescente de transcriptoma análises de bactérias cultivadas nos seus nichos intracelulares. Tais análises permitirá a decifração de adaptações bacterianas específicas desencadeadas pelo anfitrião e vai ajudar a identificar novos alvos para o projeto terapêutico. A análise do transcriptoma de bactérias cultivadas intracelularmente é altamente desafiador, uma vez ARN de mamífero superam ARN bacteriana por pelomenos dez vezes. Neste artigo, nós descrevemos um método experimental para isolar RNA bacteriana de Listeria monocytogenes bactérias que crescem no interior das células de macrófagos de murino. O ARN extraído pode ser utilizado para estudar adaptações intracelulares e mecanismos de virulência de bactérias patogénicas através de várias técnicas de análise de transcrição, tais como RT-PCR, o RNA-Seq, microarray e outras tecnologias de hibridação baseada.

L. monocytogenes é o agente causador de listeriose em humanos, uma doença com manifestações clínicas dirigidas principalmente indivíduos imunocomprometidos, idosos e mulheres grávidas ^6. isto é um agente patogénico intracelular facultativo Gram-positiva que invade uma grande variedade de células de mamíferos que tenham sido utilizados durante décadas como um modelo em interacções hospedeiro-patogénio estuda ^7. Após a invasão, ele reside inicialmente em um vacúolo ou fagossoma (no caso de células fagocíticas), a partir do qual ele deve escapar para tele hospedar citosol da célula, a fim de se replicar. Vários factores de virulência foram mostrados para mediar o processo de escape, principalmente a hemolisina de formação de poros, listeriolisina O (LLO) e duas fosfolipases ⁸ adicionais. No citosol das bactérias utilizam a maquinaria a polimerização de actina hospedeiro para impulsionar-se em filamentos de actina dentro da célula e para espalhar a partir de uma célula para outra (Figura 1). Todos os principais fatores de virulência de L. monocytogenes envolvidas na invasão, a sobrevivência e a replicação intracelular, são activados pelo regulador da transcrição mestre virulência, PrfA. ^8-10.

Na última década, vários estudos realizados por nós e outros métodos para análise de transcriptoma de bactérias cultivadas intracelularmente aplicado com sucesso dentro das células hospedeiras ^2,11-15. Duas abordagens principais são usadas para separar o RNA de bactérias de hospedeiro-ARN que são baseadas em: 1) enriquecimento selectivo de ARN bacteriana e 2) de isolamento de ARN por diferential lise celular. A primeira abordagem depende de hibridização subtrativa de extratos de RNA total de moléculas de RNA de mamíferos (por exemplo, utilizando kits comercialmente disponíveis) ou a captura seletiva de sequências transcritas bacterianas (SCOTS) ^11. A segunda abordagem baseia-se na lise diferencial de bactérias e células hospedeiras, em que as células hospedeiras são lisadas, enquanto as células bacterianas permanecem intactos. As células bacterianas são em seguida separados a partir do lisado da célula hospedeira, geralmente por centrifugação, e o ARN é extraído por intermédio de técnicas convencionais. O principal problema com esta abordagem é que, juntamente com as bactérias intactas, as células hospedeiras núcleos também são isoladas, assim, as preparações de ARN ainda contêm ARN de mamífero. Uma maneira de ultrapassar este problema é separar as bactérias intactas a partir de células hospedeiras núcleos utilizando centrifugação diferencial, embora este processo normalmente leva tempo aumentar a preocupação de alterações no perfil de expressão de genes durante a extracção. Neste artigo apresentamos uma ba melhorada e rápidacteria protocolo de extracção de ARN, que é baseado no método de lise celular diferencial. Em primeiro lugar, L. monocytogenes infectados macrófagos são lisados ​​com água fria. Em seguida, os núcleos de macrófagos são removidos por uma breve centrifugação e bactérias intactas são rapidamente recolhidas em filtros, a partir do qual o ARN é isolado usando extracção com fenol quente SDS-de ácidos nucleicos bacterianos.

Protocolo

Nota: Durante toda a experiência, as células de macrófagos foram incubadas a 37 ° C numa incubadora de _CO2-ar forçado 5% e levado para fora da incubadora apenas para manipulações experimentais, que são realizadas numa câmara de segurança biológica de Classe II. Trabalhando com L. bactérias monocytogenes é de acordo com o nível de segurança biológica 2 regulamentos.

1. Preparação de células e infecção bacteriana (Dia 1 e 2)

1. Dia 1
   1. Semente de medula 2,0 x 10 ⁷ células de osso derivadas de macrófagos (BMDM) sobre um prato de 145 milímetros em 30 ml BMDM + meios Pen-Strep (Tabela 2). Seed 3 placas para cada estirpe bacteriana a ser analisado. Incubar durante a noite a 37 ° C numa incubadora de _CO2-ar forçado 5%.
   2. Iniciar uma cultura bacteriana durante a noite de tipo selvagem (WT) L. monocytogenes 10403S estirpe em 10 ml de meio de infusão de cérebro e coração (BHI), a 30 ° C numa incubadora padrão. Colocar os tubos de cultura inclinada sem agitação. Nota:Estas condições de crescimento sobre-regular a expressão dos genes de flagelos, que promove a infecção eficiente.
2. Dia 2
   1. Pré-forma quente BMDM (sem antibióticos Pen-Strep) (Tabela 2) e fosfato tamponado salino (PBS) a 37 ° C.
   2. Lavar monocamada de macrófagos duas vezes com 25 ml de PBS pré-aquecido para remover os antibióticos. Adicionar 30 ml de meio BMDM fresco.
   3. Lava-se 1,5 ml de cultura bacteriana durante a noite com PBS, as bactérias por centrifugação a> 14.000 xg durante 1 min, descartando o sobrenadante, e ressuspensão suavemente bactérias em 1,5 ml de PBS por pipetagem. Repita duas vezes.
   4. Infect cada placa de macrófagos com 0,5 ml de uma cultura durante a noite lavou-se de tipo selvagem L. monocytogenes. Se o uso de vários pratos, infectar cada placa 15 min de intervalo. Este intervalo de tempo irá permitir a colheita cada placa individualmente no final da infecção.
      Nota: A multiplicidade de infecção (MOI) é ensaiado por diluição em séries da cultura bacteriana utilizada para a infecção em placas de agar BHI e contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) após 24 horas de incubação das placas a 37 ° C. Utilizando-se 0,5 ml de WT L. monocytogenes estirpe resultados 10403S em um MOI de 100 ~ (100 cfu por bactérias celular de macrófagos). Ao analisar bactérias mutantes defeituosos no crescimento intracelular, uma MOI superior deve ser considerada.
   5. Após 0,5 horas de incubação a 37 ° C, lavar as células infectadas duas vezes com PBS, para remover as bactérias não ligadas, e adicionar 30 ml de meio pré-aquecido BMDM. bactérias aderidas vai internalizar durante a próxima 0,5 hr.
   6. À 1 h após a infecção, adicionar 30 uL de gentamicina (1: 1000 para atingir uma concentração final de 50 ug / ml) para matar bactérias extracelulares.
   7. Montar o aparelho de filtro, colocando uma cabeça do filtro sobre um balão de recolha de líquido com um orifício de saída de vácuo. Em seguida, colocar um filtro (0,45 mm) sobre uma cabeça do filtro, seguido de um funil e cilindro de garantir as diferentes partes com um metal clâmpada. Prepare água livre de RNase gelada.
   8. Às 6 h pós-infecção, as bactérias de colheita a partir de células infectadas como se segue. Trate cada placa individualmente.
      Nota: Normalmente, L. monocytogenes termina 1-log de ​​crescimento durante 6 hr de infecção em células de macrófagos. incubações mais longas poderia resultar numa proliferação bacteriana e a morte celular dos macrófagos, enquanto que períodos de incubação mais curtos pode resultar em cargas bacterianas consideravelmente inferiores. A MOI e o tempo de infecção pode ser modificado para se alcançar as condições óptimas.
      1. Lavar as células infectadas com PBS uma vez. Adicionar 20 ml de água livre de RNase gelada para lisar células de macrófagos. Usando um raspador de células, raspar as células da placa rapidamente, mas com cuidado.
      2. Recolha de células lisadas para um tubo cónico de 50 ml. Vortex durante 30 seg. Centrifuga-se a 800 xg durante 3 min a 4 ° C.
      3. Passar o sobrenadante através do aparelho de filtro, utilizando um sistema de vácuo. Com uma pinça, rolar o filtro e rapidamente transferi-lo para a 15 ml CONItubo de cal. Snap-congelar os tubos com os filtros em azoto líquido.
      4. Montar o aparelho de filtração com um filtro novo para a amostra seguinte, como descrito no 1.2.7.
      5. Armazenar os filtros congelados a -80 ° C durante o dia seguinte. Alternativamente, vá diretamente para a extração de ácidos nucléicos.

2. Ácidos Nucleicos Extraction (Dia 3)

Nota: Executar todas as manipulações com soluções de fenol e clorofórmio em um exaustor.

1. Prepara-se uma mistura 1: 1 de fenol acidificado: clorofórmio, 400 ul de cada amostra. Misturar em tubos separados, e em seguida, retirar a camada aquosa resultante por aspiração. Adicionar 40 ul de SDS a 10%.
2. Descongelar os tubos contendo filtro no gelo para mantê-los frio. Para cada tubo contendo o filtro de adicionar 650 ul de tampão de acetato-EDTA (AE) (Tabela 2).
3. Execute os seguintes passos tão rapidamente quanto possível.
   1. Vortex vigorosamente o tubo contendo o filtro paraque leva o filtro para a periferia do tubo e o tampão de lava completamente o filtro. Sempre mantenha o frio tubo, colocando-o de volta no gelo. Nota: Pode ser necessário Além disso vortex do tubo enquanto invertido para lavar completamente as bactérias fora do filtro.
   2. Repita o procedimento para todos os tubos. Pode ser útil para girar para baixo a suspensão breve (1 min a 120 x g), no final do processo.
4. Transferir o tampão de bactérias contendo a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo SDS e a mistura de fenol / clorofórmio (como foi preparada no ponto 2.1). Repita o procedimento para todos os tubos. Pode ser necessário para rodar os tubos de filtragem contendo (1 min a 120 x g) novamente para obter tampão residual do filtro.
5. Colocar todos os tubos de 1,5 ml em um dispositivo de vórtice multi-tubos, e agitar com vortex à velocidade máxima durante 10 min.
6. Incubar os tubos num bloco de calor a 65 ° C durante 10 min. Centrifuga-se a velocidade máxima (> 14.000 x g) durante 5 min.
7. Transferir a fase aquosa (cerca de 400 ul) de cada tUbe para um novo tubo de 1.5 ml contendo 40 ul de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 1,0 ml de etanol a 100%. Vortex cada tubo completamente.
   Nota: O glicogénio podem ser adicionados nesta etapa para melhorar a visualização do sedimento precipitado.
8. Incubar as amostras a -80 ° C durante 1 h. Alternativamente, incubar as amostras a -20 ° C durante a noite. Em seguida, centrifugar as amostras a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima (> 14.000 x g).
9. Aspirar cuidadosamente o etanol (camada superior) de cada tubo. Adicionar 500 ul de etanol frio a 70% a cada amostra e vórtice completamente. Centrifugar a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima (> 1 4000 xg).
10. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo. Secam-se as amostras durante cerca de 2 min, utilizando um evaporador sob vácuo sem aquecimento. Não excesso de secar as amostras.
11. Adicionar 25 mL de água livre de RNase para cada amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Cuidadosamente vórtice e spin-down.
12. Medir a concentração de ARN em tele amostras usando um microvolume UV-Vis. Esperar para extrair cerca de 0,5-1 mg de ácidos nucleicos por placa.
    Nota: repetições técnicas podem ser combinadas nesta fase.

3. DNase Tratamento

1. Defina-se a reacção de acordo com o Quadro 1 num tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 45 min. Adicionar 450 uL de água livre de RNase-e 500 ul de fenol-clorofórmio-IAA mistura (Tabela 2), as fases separadas por centrifugação durante 2 min a velocidade máxima (> 14.000 x g).
2. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 500 mL de clorofórmio-IAA mistura (Tabela 2), e as fases separadas vórtice por 2 minutos de centrifugação a velocidade máxima (> 14.000 x g).
3. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 1 ml de etanol e 50 uL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2). Vórtice.
   Nota: O glicogénio podem ser adicionados nesta etapa para melhorar a visualização do sedimento precipitado.
4. Incubar durante 1 hora a -80 ° C. Alternativamente, incubar as amostras a -20 ° C durante a noite. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min, a velocidade máxima.
5. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo. Adicionar 500 ul de etanol frio a 70% a cada amostra e vórtice completamente. Centrifugar a 4 ° C durante 20 minutos à velocidade máxima. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada tubo.
6. Secam-se as amostras durante cerca de 2 min, utilizando um evaporador sob vácuo sem aquecimento. Não excesso de secar as amostras.
7. Adicionar 12 ul de água livre de RNase, incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente, vórtice, e girar para baixo. As amostras contêm RNA purificado, mantê-los no gelo. Em alternativa, dissolve-se o ARN em RNase H ₂ O com 0,1 mM de EDTA ou tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
8. Medir as concentrações de ARN utilizando um microvolume UV-Vis. Esperar ~ 100 ng de RNA por amostra (se repetições técnicas são combinadas).
   Nota: RNA extraído de acordo com este protocolo é adequado foanálise de transcrição do gene r por várias técnicas. Nós geralmente empregam análise de RT-qPCR para estudar L. monocytogenes transcrição de genes durante a infecção de células de macrófagos ^1-4.

Resultados

O sistema de modelo é mostrado na Figura 1 e inclui células de macrófagos infectados com L. monocytogenes bactérias, que se replicam no citoplasma de macrófagos. A Figura 2 representa o esquema experimental. A Figura 3 representa os resultados típicos de tal análise de RT-qPCR de genes de virulência durante WT L. monocytogenes crescimento em macrófagos em comparação com o crescimento em meio laboratorial rico...

Discussão

O protocolo aqui descrito representa um método aperfeiçoado para o isolamento de ARN a partir de bactérias L. monocytogenes bactérias que crescem intracelularmente em células de macrófagos. Este protocolo baseia-se na lise diferencial de células e inclui duas etapas principais para enriquecimento de RNA bacteriana: sedimentação núcleos de macrófagos usando centrifugação e uma recolha rápida de bactérias por filtração. Estes passos são seguidos por um processo de extracção de ARN padrão. Emb...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen