Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Zusammenfassung

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Zusammenfassung

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii¹. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

Einleitung

Phänotypischen Charakterisierung der systematischen Mutant Sammlungen von Modellorganismen ist ein bewährtes Konzept für die zelluläre Komplexität zu sezieren. Die haploiden Einzeller Grünalge Chlamydomonas reinhardtii hat eine pflanzenähnliche Gen - Set, aber es wichen von Landpflanzen vor mehreren Genom Doppelungen in der Landpflanzen Linie ^2. Grundsätzlich Mangel an Gen-Duplikation und einer hauptsächlich haploiden Lebenszyklus erheblich erleichtert loss-of-function genetische Ansätze. Jedoch ist gezielte Zerstörung von Genen von Interesse fast unmöglich aufgrund des Fehlens von effizienten homologe genomische Integration. Eine zufällige insertionelle Störung Bibliothek befindet sich im Aufbau, kombiniert mit der Identifizierung der gestörten Stelle, so weit eine gruppierten Satz von 1.935 kartiert Störungen ergeben repräsentieren 1.562 Gene ^3. Doch dieser Ansatz (in der Regel erwartet, dass Null-Mutationen erzeugen) ist nicht anwendbar auf essentielle Gene. Temperaturempfindliche (ts) Mutationen können recovere werdend in essentiellen Genen, und die jüngsten Methoden ermöglichen eine effiziente Identifizierung des mutierten Gens und der ursächlichen Läsion. Die phänotypische Analyse bei hoher Temperatur liefert dann sofort Informationen über die Funktion des mutierten Gens. Wir berichteten über die Isolierung und Charakterisierung von ts Letalmutationen in ~ 70 essentielle Gene in Chlamydomonas, wobei der Schwerpunkt vor allem auf beteiligten Gene in der Progression des Zellzyklus und ^1,4 steuern.

Ts tödliche Bildschirme haben ^5,6 seit Jahrzehnten eine tragende Säule der genetischen Analyse in Mikroorganismen gewesen. Im Prinzip ist ein wünschenswertes Merkmal "Sättigung" zu nähern, was bedeutet, dass alle Gene mutiert fähig Letalität ts durch mindestens eine Mutante identifiziert werden, eine vollständige Analyse ermöglicht. Doch in der Praxis begrenzen mehrere Faktoren, die die Annäherung an die Sättigung. Erstens, während fast alle Gene können zu einem Verlust der Aktivität bei hoher Temperatur mutiert werden, ändert sich die Effizienz der Verwertung solcher Mutanten über mindestenseine Größenordnung ^7,8. Daher beginnt ein Zufallsbild rezidivierenden Treffer in "Vielflieger" abholen lange vor der Sättigung nähert. Zweitens, während ts-Mutationen in der Regel zu einer Verringerung der Funktion zur Folge haben, sie nicht wahr nulls bei einer restriktiven Temperatur sein kann (und umgekehrt, sind häufig nicht voll funktionsfähig bei einer permissiven Temperatur). Dieses Problem kann durch den Vergleich mit multiple Allele zu einem gewissen Grad behandelt werden; wenn sie alle einen gemeinsamen Phänotyp teilen, ist dies wahrscheinlich das Ergebnis einer einfachen Inaktivierung des Gens zu reflektieren. Multiple Allele sind auch sehr nützlich für die endgültige molekulare Identifizierung der ursächlichen Läsion ^1. Allerdings bedeutet die "Vielflieger" Problem, dass mehrere Allele in selten getroffen Gene schwierig sein kann, sich zu erholen.

Aus diesen Gründen wurden entwickeln wir eine verbesserte Pipeline zu isolieren und phänotypisch ts-Mutanten zu charakterisieren. Wir haben mehr als 3.000 ts-Mutanten bisher gesammelten, including etwa 200 neuen Kandidaten Zellzyklus-Mutationen. Molekulare und phänotypische Analyse dieser Sammlung, die wahrscheinlich bereits Mutationen in den meisten oder allen Zell wesentlicher Wege umfasst, sollten neue Erkenntnisse und Hypothesen in pflanzlichen Zellbiologie bereitzustellen. Wichtig ist, dass diese Pipeline zu jedem Mikroorganismus angewendet werden, die effizient auf Agar wächst auf ts Mutant Sammlungen aufzubauen.

Ein Hinweis auf Ausstattung: zwei Roboter sind sehr wichtig für die Effizienz in diesem Verfahren (eine Kolonie-Picker und eine Kombination Replik plater / Cherry Picker). Pickers haben in der Regel Metallstifte. Picked Kolonien werden in Luft auf diesen Stiften für einen gewissen Zeitraum gehalten (Sekunden bis Minuten, je nach Modell). Chlamydomonas stirbt in etwa 20 Sekunden auf einen Metallstift in der Luft. Dies schränkt Modellwahl für den Organismus. Genauigkeit Angelegenheiten. Unsere Kolonie-Picker ist ziemlich genau; ist es jedoch etwas gewalttätig in seiner Wirkung und hat eine gewisse Möglichkeit für Spray-basierte Kreuzkontamination. Es ist nicht bei hohen verwendeter ist als die 384 Dichte (4,5 mm Mitte-Mitte-Abstand); Bei dieser Dichte ist die Genauigkeit vollständig akzeptabel. Die Replika-Plattierung / Rosinenpickerei Roboter (verschiedene Aufsätze für diese Anwendungen verwendet) ist viel zu Kommissionierung langsamer, ist aber genau genug für die 1.536 Dichte (6144, ist eine Herausforderung, auch für diese sehr präzise Roboter, wir diese Dichte ausgewertet haben, aber nicht gewählt wegen seiner verschiedenen Schwierigkeiten, um es verwenden). Der Roboter wird nicht gut funktionieren , wenn Platten ungleichmäßig belastet werden, usw. Es ist wichtig zu erkennen, überprüfen Sie sicher sein, die richtigen Dinge geschehen; natürlich wird der Roboter laufen unbeaufsichtigt und in der Regel werden alle gut gehen, wenn die ersten Platten korrekt waren.

Protokoll

1. UV-Mutagenese

1. Bereiten Sie einen Stapel von 100-200 rechteckigen Agarplatten mit Tris-Acetat-Phosphat (TAP) Medium ^9,10. Bereiten Sie diese Platten ein paar Tage vor und halten sie auf der Bank eine schnelle Absorption der suspendierten Zellen in den nächsten Schritten, um sicherzustellen, um zu trocknen.
2. Kultur Chlamydomonas - Zellen bis zu von 0,2 bis 0,5 der optischen Dichte (OD _750; ~ 2 Tage) in 100 ml flüssigem TAP unter Licht bei 25 ° C und bei 100 Upm Schütteln.
   HINWEIS: UV - Mutagenese wird unabhängig in zwei genetischen Hintergründen durchgeführt: Mat- Hygro ^r (verleiht Resistenz gegen Hygromycin B) und Mat + Paro ^r (verleiht Resistenz gegenüber Paromomycin). Antibiotika-Wahl ist beliebig, sofern die beiden Paarungstypen komplementäre Wirkstoffresistenzen.
3. Überprüfen Sie eine Probe von jeder der Kulturen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen lebensfähig sind, gesund (Schwimmen und intakt) und ohne Kontamination.
   HINWEIS: Verwachsenen Kulturen "Crash" undverlieren die Lebensfähigkeit, als "Geister" in der Phasenkontrastmikroskopie erscheinen. Bewahren Sie keine Schüttler Kulturen gehen, sobald sie die Sättigung erreichen. Der "Geist" Phänomen ist in Schritt 1.3 leicht nachweisbar.
4. Verdünnen Sie die Kultur auf 0,003 OD _750. Wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie homogene Dichte zu gewährleisten, wie der Stamm motile ist und schwimmt direktional in Reaktion auf Licht.
   1. Passen Sie die Dichte der Suspension auf der geplanten UV - Dosis basiert, so dass für die Zelltötung Buchhaltung, 200-600 Überlebende Kolonien auf den Platten (Abbildung 1) bilden. Siehe Tabelle 1 für Informationen über UV - Belichtungszeiten.
5. Befestigen einer kleinen Rohrkassette, die einen Flüssigkeitsspender passt, und eine Reihe von Wäschen für die Sterilisation durchzuführen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers, eine Kontamination zu verhindern.
6. Mit einem 8 x 12 Flüssigkeitsspender, verzichtet werden 4 x 96 Tropfen von 2 ul jeweils auf rechteckigen Platten (Bild 1 ). Tippen Sie leicht auf den Rand der Platte die Verschmelzung aller Tropfen in einer dünnen Schicht von Flüssigkeit, um sicherzustellen, und decken sofort die Platten Lichteinwirkung zu verhindern.
   1. Um zu gewährleisten, sehr sogar einzelne Zelle Zerstreuung, verwenden Trockenplatten, wie oben erwähnt, und schnell die Platten bedecken, um die Zellen verhindern, dass als Reaktion auf Licht zu schwimmen. Halten Sie die Platten abgedeckt Ebene und im Dunkeln, bis die gesamte Flüssigkeit absorbiert wird.
7. Legen Sie die Platten unter einem keimtötende UV-Lampe (30 Watt keimtötende UV-Röhre) für Zeiträume bestimmt empirisch unter den Überlebenden eine optimale Ausbeute an ts- Mutanten zu geben. Hier verwenden Zeiten von 0,5 - 1,5 min in einem Abstand von 40 bis 99,9% Abtötung - 50 cm in 90 zu führen. Survivors enthalten 100 - 1000 UV-induzierte Punktmutationen, von denen ca. 10% Veränderung kodierenden Sequenzen.
   1. Um eine maximale Wirksamkeit von UV - Bestrahlung ohne Rückfall zu gewährleisten , aufgrund von Licht-abhängigen DNA ^11,12, die Arbeit in der Dunkelheit bei diesem Schritt zu reparieren und sofort packen dasPlatten in einem dunklen Kasten nach der Bestrahlung.
8. Halten die Platten im Dunkeln für 8-24 h bei Raumtemperatur.
9. Legen Sie die Platten in einem 21 ° C Inkubator mit Beleuchtung Kolonien zu bilden. Die Koloniebildung dauert ~ 10 Tage. Achten Sie darauf, die Platten mit Plastiktüten zu verpacken und fügen absorbierenden Papier Flüssigkeit im Inneren Kondenswasser auslöschen oben. Die Verdampfung und Kondensation Zyklen können sonst bieten Flüssigkeitsfilm Routen für Verunreinigungen, die Platten zu gelangen.
10. Laden der Platten in den jeweiligen Stapeln als Quellen für Roboterkolonieaufnahme (Abbildung 2). Pick Kolonien für 384-Arrays auf rechteckige Platten, und sie wachsen bei 21 ° C mit Beleuchtung (ca. 1 Woche).
11. Kondensieren die 384-Arrays zu einem 1.536-Arrays (4: 1) unter Verwendung einer Replika-Plattierung Roboter (3) und damit die Platten für ~ 3 Tage in dem 21 ° C Inkubator wachsen.
12. Replizieren Sie die 1.536-Arrays auf zwei Platten, die jeweils und legen eine in der 21 ° C-Inkubator (permissiveTemperatur) und die andere in einem 33 ° C-Inkubator (restriktive Temperatur). Nach 24 Stunden, replizieren die Platten in 33 ° C zu einem neuen Satz von vorgewärmten Teller, und legen Sie sie in der 33 ° C-Inkubator.
    HINWEIS: Der Grund für diese sekundäre Plattierung ist, dass ts tödliche Mutanten können in einigen Fällen erhebliche Biomasse sammeln, auch wenn die Zellen in der ersten Zellzyklus verhaftet werden nach der Plattierung. Das sekundäre Replikat eliminiert dieses Signal und erhöht erheblich die Empfindlichkeit.
13. Photographieren die Platten mit einer Digitalkamera 3 folgenden Tagen Wachstum bei 33 ° C und 5 Tagen Wachstum bei 21 ° C. Halten Sie die Platten in einem festen Rahmen. Verwenden Sie ein "Raster-Platte" markiert mit neun Ausrichtung Indikatoren, die zusammen mit den Kulturplatten fotografiert wird (Abbildung 4). Fotografie Kulturplatten als Wechsel paarigen 21 ° C und 33 ° C (21/33) Bilder.
    HINWEIS: Verschiedene Inkubationszeiten werden verwendet, Wachstum ausgleichen, da die Wildtyp wächst deutlichbei 33ºC schneller als bei 21ºC.

2. Identifizierung von ts Mutant Kandidaten: Erste Bildschirm

1. Verarbeiten Sie die paarigen 21/33 Platte Bilder mit einem benutzerdefinierten Matlab Bildanalyse-Software, um den Hintergrund zu beseitigen und zu segmentieren die Bilder in ein 1.536-Array. Das Programm wird die detektierte Biomasse (Gesamtpixelintensität) in jeder Position (Abbildung 5) bestimmen.
   HINWEIS: Die Software (im SI vorgesehen zusammen mit Anweisungen) wird die Gitterplatte Bild verwenden, um die Positionen der Zellen (einzelne Einträge) in einem 1.536-Array an der Vergrößerung und Plattenausrichtung verwendet, um zu bestimmen und die Gesamtpixelintensität in jeder Zelle berechnen . Diese Werte für jede Mutante werden dann gegen die einstellbaren Parameter im Vergleich zu erforderlichen Wachstum bei 21 ° C relativ zu einer ts + Standard und der Grad der Temperaturempfindlichkeit zu bestimmen, definiert als: S (Mut ₃₃₎ / S (WT ₃₃₎ / S (Mut ₂₁₎ / S (WT _21), wobei S - Signal (Pixel intensity nach Abzug des Hintergrunds), ist Mut eine einzelne Mutante und "WT" ist eine zufällig gewählte nicht-temperaturempfindlichen Kolonie (mutagenisierten Stamm, ts + Phänotyp hatte). Wachstum bei 21 ° C wird als S (Mut ₂₁₎ / S (WT ₂₁₎ definiert. In diesem ersten Bildschirm gelten entspannt Auswahlkriterien (so dass relativ geringe Wachstum bei 21 ° C und einen relativ niedrigen Grad der Temperaturempfindlichkeit), um die falsch-negative Rate niedrig zu halten.
2. Laden Sie die Liste der ausgewählten Kolonien, die durch die Software als Anweisungsdatei für die Einzelkolonieaufnahme Robotik (in der Regel in eine 384-Array). Bereiten Sie die Quell- und Zielplatten nach den Robotik Anweisungen und Kolonien zu Array (Abbildung 6) auszuwählen.
   HINWEIS: Herkömmliche Kommissionierer erfordern eine Anweisungsdatei in einem gewissen Format wie CSV, TXT oder .xls. Alle Kommissionierer haben die Kapazität, Datei angetrieben zu sein; verschiedene Formate werden kleinere Änderungen der MATLAB-Code (Quellcode zur Verfügung gestellt) erfordern.
3. Legen Sie die Zielplatten in dem 21 ° C Inkubator für ~ 5 Tage eine Aktie Platte zu wachsen.

3. Identifizierung ts Mutants: Zweiter Bildschirm

1. Wiederholen Sie Schritt 2,1 bis gepflückt Kolonien erneut testen. Typisch 30 - 50% der Kolonien wird als klar ts Letalgene erneut testen, mit einer Ausbeute von 2% - 5% ts Letalgene relativ zur ursprünglichen Kolonien UV-Mutagenese zu überleben.
2. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für den zweimal gescreent ts Letalgene Kommissionierung, aber mit einer modifizierten Anweisungsdatei ausgelegt Array Kolonien in Blöcke von 100 Kolonien auf rechteckigen Platten bei einer 384-Dichte. Das ist für eine bequeme mikroskopische Untersuchung in dem nächsten Schritt. Die Anweisung Dateiformat wird zur Laufzeit durch den MATLAB-Code angegeben.
3. Stellen Sie sicher, mehrere WT Kolonien als Kontrolle sind und die Platten bei 21 ° C für ~ 5 Tage statt.

4. Erste Phänotypisierung

1. Replizieren Sie die 100-Block angeordnet Platten in Schritt 3.2 und legen Sie sie in den 21 ° C incubator für ~ 2 Tage erhalten frisch wachsenden Kolonien.
2. Replizieren Sie die neue Kopie der 100-Blockplatten (4.1) bis zu drei Kopien. Legen Sie eine Kopie in dem 21 ° C Inkubator und einer in der 33 ° C-Inkubator als Kontrollen.
3. Legen Sie die dritte Kopie ( "Screening-Platten") in einem Roboter-Setup und vor Ort die Kolonien mit langen Stiften mit sterilisiertem Wasser berührt.
   HINWEIS: Chlamydomonas fixierten Zellen auf Agar robotically zunächst als ziemlich dicht Stelle von Zellen zu landen neigen, mit wenigen einzelnen verfügbaren Zellen für mikroskopische Untersuchung. Um die Kolonien für mikroskopische Untersuchung zu optimieren, vor Ort die zunächst mit einem Tropfen Wasser übertragen Zellen (das Volumen des Wassers durch die Roboter-lange Stifte übertragen ist ~ 100 nl). Dies führt zu einer Dispersion der Zellen in einem kleinen Radius (~ 1 mm) über die ersten Pinningzentrum, mit vielen isolierten Einzelzellen.
4. Nehmen Sie mikroskopische Aufnahmen einer Region von jeder Stelle der Abschirmbleche zum Zeitpunkt 0 (während noch einzelne, ungeteilten Zellen) (Abbildung 7) und legen Sie die Platten bei 33 ° C für die Inkubation. Bestimmen Sie Bildposition durch die manuelle Bühne Kontrolle eines tetrad Präpariermikroskop modifiziert gesetzt Anschläge geben am 4,5-mm Mitte-zu-Mitte-Abstand von einer 384-Dichte-Array.
5. Entfernen Sie die Screening-Platten aus dem 33 C-Inkubator ° und nehmen mikroskopische Aufnahmen, wie in Schritt 4.4, bei unterschiedlichen Zeitpunkten (10 h, 20 h, 48 h). Achten Sie auf die Bühne, die Plattenhalter und die Stufensteuerung präzise in jedem Zeitpunkt zu bekommen Bilder von den gleichen Zellen kalibriert. Führen Sie eine schnelle Mikrophotographie Erfassung (~ 10 min).
6. Verwenden Sie die zweite Kopie in den Inkubator 33 ° C, um den ts-Phänotyp zu überprüfen und sicher zu stellen, dass Temperaturschwankungen bei der Bildaufnahme auf Ts-Phänotyp keine große Wirkung haben.
   1. Analysieren mikroskopische Bilder und wählen Sie für die Mutanten auf der Basis der gewünschten Kriterien (Abbildung 8). Spot der letzte ausgewählte Satz in einer 96-Array-Agar-Platte. Stellen Sie sicher, dass jederPlatte enthält Mutanten des gleichen Paarungstyp und Medikamentenresistenz.
   2. Für jede Platte, übernehmen Sie die letzten beiden Spalten eine positive (Abfrage Mutation) und eine negative (WT) Steuerung für die Komplementierung Assays.

5. Komplementierung und Linkage Prüfung von New Mutants auf "Vielflieger"

1. Übertragen großer Mengen der angeordneten Kolonien stickstofffreien Gameten-Induktionsmedium ¹⁰ in 96-well Mikrotiterplatten (Dichte jeder Kolonie sollte etwa 0,2 OD sein). Inkubieren Sie die Platten unter Licht (13-20 W Quecksilber-Lampen) für ~ 5 Stunden gametogenesis zu ermöglichen.
   Hinweis: Dieser Schritt kann durchgeführt entweder mit einem replizierende Roboter-Setup oder manuell mit einem einfachen Plattierungsvorrichtung werden.
2. Suspend - Abfragen mit den entgegengesetzten Paarungstypen die alternativen Widerstand Kassetten in Rohren mit stickstofffreien Gameten-Induktionsmedium ¹⁰ für gametogenesis beherbergen.
3. Mischen Sie die Proben in einer Targetplatte in einer passenden mixture Volumen von 20 ul (Abbildung 9). Nach ~ 10 min unter dem Licht, Spot 5 ul aus jeder Vertiefung zweimal: einmal auf einem TAP Platte für die Verknüpfung Tests und einmal auf TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro für die Komplementierung Tests.
4. Inkubieren Sie die Verbindungsplatten in der C-Inkubator 21 ° über Nacht, und dann wickeln Sie sie in Folie. Halten Sie sie im Dunkeln für 5 Tage Zygospore Bildung zu ermöglichen.
5. Komplementierung-Testplatten für ~ 10 Tage im Licht bei 21 ° C inkubieren.
   HINWEIS: Die Arzneimittelmengen sind kalibriert Überleben zu ermöglichen, von doppelt heterozygoten Diploiden, aber sie sind immer noch genug, um die Paarung Haploiden zu beseitigen. Diese Beträge wurden für Standard-Resistenzkassette Integrationen kalibriert in diesem speziellen Projekt verwendet werden; mit neuen Integrationen sollten Dosen neu kalibriert werden. Die meisten Biomasse wird überprüft Diploide mittels Durchflusszytometrie (Figur 9), wobei eine variable Höhe der Haploiden (wahrscheinlich von Meiose und das Wachstum der doppelt beständig seinAbkömmlinge) ist in der Regel auch beobachtet.
6. Replizieren Sie die Komplementierung-Prüfung Platten in zwei Kopien für ts- Phänotyp Identifizierung. Legen Sie eine Kopie bei 21 ° C und eine Kopie bei 33 ° C für ~ 5 Tage.
7. Test - Kolonien für den ts- Phänotyp, wie in Abschnitt 2.1 (Abbildung 5) beschrieben. Kolonien, die mit der Abfrage nicht zu ergänzen sind wahrscheinlich repräsentieren Allelen des gleichen Gens, wie die Abfrage (diploiden Hetero-Allel für Mutationen im gleichen Gen).
8. Für die Bindung Prüfung nach Schritt 5.4, verschieben sich die Platten wieder ans Licht der Meiose und Auswachsen von haploiden Segreganten für ~ 7 Tage zu ermöglichen.
9. Replizieren Verknüpfung Testplatten TAP + 10 & mgr; M Paro und 10 uM Hygro für Doppelresistente Nachkommen zu wählen (vorhergesagt 25% der haploide Nachkommen zu sein, da die Kassetten nicht verknüpft sind) und Inkubation für eine Woche bei 21 ° C.
   HINWEIS: Erhöhen Sie die Medikamentendosis für doppelt resistent Haploiden.
10. Test-Kolonien für den ts- Phänotyp, wie ichn Schritt 2.1.
    HINWEIS: Ein ts- Phänotyp ist zu erwarten (und beobachtet) für Mutanten in der gleichen Komplementierungsgruppe wie die Abfrage. Zusätzlich ist ein ts- Phänotyp in der Verknüpfungs Assay für eine Mutante, die die Abfrage ergänzt, können enge Verknüpfung zwischen der Abfrage und der neuen Mutation reflektieren. Mutants, dass die getesteten Abfragen sind wahrscheinlich neue Gene zu ergänzen, die die Pipeline zur bioinformatischen Identifizierung der ursächlichen Läsion treten wird, und letztlich für die weitere phänotypische Analyse.

Ergebnisse

Wir zeigen eine beschleunigte Pipeline für ts-Mutanten in Chlamydomonas isoliert. Die Zellen werden auf Agar - Platten verteilt und kurz nach der schnellen Validierung unter dem Mikroskop für die Einzelzelldichte, Platten sind UV - Licht bestrahlt (Abbildung 1). Typische bestrahlte Kolonien identifiziert und aufgenommen in einem Array - Format nach 10 Tagen Wachstum bei einer permissiven Temperatur (Abbildung 2). Die so erhaltenen Platten im 384 - Format werden zu einer 1.536-array (Bild 3) zusammengefügt. so weit von diesen ersten Schritten der bestrahlten Kolonien zu sammeln, haben wir ~ 200.000 Kolonien angeordnet. Die Dichte der Suspension wird auf der Basis der geplanten UV-Dosis eingestellt, so daß zum Tod Buchhaltung, 200-600 Überlebende Kolonien auf den Platten bilden. Drei UV Belichtungszeiten (1,5 min, 1 min und 0,5 min) und drei Dichten wurden entsprechend (Tabelle 1) getestet. Empirisch ergab die 1,5 min Belichtungszeit die meisten der ts- Mutanten (~ 50%); jedoch mit Abstand, 1 min ergab die meisten der Zellzyklus-Kandidaten. Daher werden nur zukünftige UV-Mutagenese Runden wurden mit 1 min durchgeführt. Ein wichtiges Anliegen ist das Plätschern während der ersten Kommissionierung und der Kreuzkontamination (vor allem in den High-Density-Formate). Dies kann zweimal in der Vervielfältigung und weiteren Phänotypisierung der gleichen Mutante führen. Um die Wahrscheinlichkeit für ein solches Szenario zu minimieren, kümmern Kolonien auf die optimale Größe zu sammeln, und stellen Sie sicher, dass benachbarte Kolonien sind nicht in der ersten Test gepflückt.

Als nächstes wurden zwei aufeinanderfolgende ts- Phänotyp - Assays (Figur 5) durchgeführt wird , und um 3,000 ts- Mutanten wurden isoliert und phänotypisch durch Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 8) charakterisiert. Aufgrund der biologischen Fokus in den Zellzyklus von Interesse in Phänotypen studieren, die bestimmte Kriterien erfüllen, sind wir in jedem Ziel mehr als zwei Allele bei der Erhebung gen nicht interessierte. Daher führten wir Komplementierung und Verknüpfungsprüfung mit bereits charakterisierten Gene , die mit mehr als zwei Allele (Query) gegen neu gesammelten Kandidaten hoch rezidivierenden Gene von der stromabwärtigen Leitung (9) zu entfernen.

Abbildung 1: Uniform Verbreitung von nicht - mutagenisierten Zellen und UV - Mutagenese. (a) 384 x 2 & mgr; l Tropfen werden auf einer Agarplatte mit einem Reagenzspender verzichtet. (b) Zufällige Platten werden unter dem Mikroskop geprüft Einzelzelldichte zu überprüfen und sind UV mit einer 1-minütigen Exposition bestrahlt. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. UV-mutagenisierten Kolonien für die 384-Arrays gepflückt. (a) UV-bestrahlten Einzelzellen sind für ~ 10 Tage in sichtbare Kolonien gewachsen. Maßstabsbalken = 2 cm. (b) Bildanalyseprogramm erkennt trennbaren Kolonien auf bestimmte Parameter nach und robotically Arrays sie in 384 Platten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Merging auf die 1.536-Array. Vier 384-Format Platten sind an einer 1.536-Platte verschmolzen; einmal angebaut werden sie wieder repliziert für den ts- Phänotyp zu testen. Bitte klicken Sie hier anzuschauenGrößere Version der Figur.

Abbildung 4. Imaging für die Quantifizierung. (a) Die Platten werden in einem Rahmen unter einem Dokument photography Stand gehalten , so daß alle Platten in einer Reihe an identischen Vergrößerung und Positionierung fotografiert werden. (b) Das erste Bild ist von einer 1536-Well Mikrotiterplatte mit roten Punkten an den Ecken und Mittelpunkten platziert. Dieses "grid-plate" Bild definiert die Position des Arrays. (c) Beispiel für eine 1.536-Array nach Inkubation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Identifizierung des ts- Phänotyp von Semi-Automatische Bildanalyse. Plattenbilder werden durch benutzerdefinierte MATLAB-Software (sofern im SI) analysiert. Das Bild wird automatisch in den Zellenanordnungen segmentiert (96, 384 oder 1.536), und das Signal in jeder Zelle quantifiziert. Das Wachstum bei 21 ° C ist blau markiert, und das Wachstum bei 33 ° C ist gelb markiert. Kolonien deutlich höheres Wachstum bei 21 ° C im Vergleich zu 33 ° C aufweisen (standardisiert auf ts +) ausgewählt und in schwarzen Quadraten mit einem grünen Punkt markiert. Diese Entscheidungen können manuell bearbeitet werden. Endgültige Auswahl werden in eine Datei übertragen von der Kolonie-Picking-Roboter eingesetzt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Robotic Picking von Erstrunden-ts Lethal Kandidaten. Die kirsch Picking Roboter folgt Anweisungen aus einer Datei erzeugt, wie 2.1 in Schritt beschrieben Kandidaten für ein neues Array zu holen. Das obere Feld zeigt das Laden eines sterilisierten Nadel. Das untere Feld zeigt die genaue Kommissionierung aus einer bestimmten Kolonie in der Source-Platte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Zeitraffer-Screening für Initial Sortierung von ts Lethal Phänotypen. Klone , die zwei Runden des Screening - Protokoll in 5 veranschaulicht übergeben werden , um Platten in einer Zelldichte repliziert , so daß einzelne Zellen mikroskopisch aufgelöst werden kann. Eine modifizierte tetrad Präpariermikroskop wird verwendet, um Positionen zu identifizieren, bei denen mikroskopische Aufnahmen nach 0 h genommen werden, 10 h und 20 h Inkubationen ein t 33 ° C. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8: Die Chlamydomonas Cell Cycle Mutants Identifiziert durch Time-Lapse - Mikroskopie. (a) Darstellung der Chlamydomonas einzigartige Zellzyklus beschreibt die lange G1 - Phase durch das Zellwachstum gekennzeichnet, gefolgt von Spaltung SM - Zyklen, die mit dem Schlüpfen der neugeborenen Tochterzellen enden. (b) Mikroskopische Aufnahmen zeigen WT - Zellen während des Zellzyklus und der Identifizierung von typischen Zellzyklus - Mutanten, die Mitose nicht abgeschlossen. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Abbildung 9: Komplementierung und Linkage - Test. (a) Ein Antibiotikum resistent (beispielsweise Hygro) Abfrage mit einem häufig wiederholt mutiertes Gen wird in einer 96-Well - Platte mit einer Reihe von Mutanten des entgegengesetzten Paarungstyps gekreuzt , die ein zweites Antibiotikum - Resistenzkassette Harbor (zB Paro). Komplementierung Platten ergeben hohen Anteil an diploiden wie durch die Nukleinsäure-Färbung und Analyse in der Durchflusszytometrie (unten links in der a) gezeigt. (b) Die Paarungsgemisch wird sowohl in Diploiden für die Komplementierung getestet und für die Verknüpfung in Doppelfesten meiotischen Nachkommen. Die positive Kontrolle ist die Abfrage selbst in der entgegengesetzten Paarungstyp, und, wie erwartet, zeigt die ts- Phänotyp bei 33 ° C, wohingegen die negative Kontrolle ist WT und zeigt die ts + Phänotyp. Die eingekreisten Kolonien zeigen keine Komplementierung mit der Abfrage und sind daher new ts- Allele für die Abfrage-Gen. Diese werden im Allgemeinen von der weiteren Charakterisierung ausgeschlossen, da nur "Vielflieger" sind in der Komplementierung Test-Set. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zeit	OD	Kolonien aufgenommen (#)	Ts- Phänotyp	Zellzyklus - Kandidaten
1.5 '	0,012	6000 (Avg = ~ 200)	200 (3,3%)	7 (3,5%)
1 '	0,003	11.000	131 (1,19%)	15 (11,4%)
		(Avg = ~ 360)
0.5 '	6E-04	9000	40 (0,45%)	1 (2,5%)
		(Avg = ~ 300)

Tabelle 1: Kalibrierung von Bestrahlungszeiten die Ausbeute der Zellzyklus - Mutant Kandidaten zu maximieren. Drei Bestrahlungszeiten wurden getestet (30 Platten pro Stück) mit ODs entsprechenden überlebenden Koloniezahlen (200-600) zu gewährleisten.

Diskussion

Die Pipeline hier für High-Yield-Isolierung von ts letalen Mutanten beschrieben wird sichergestellt, dass vermutlich alle zellulären wesentlicher Bahnen des Chlamydomonas-Genom vertreten sind. Die beiden wichtigsten Schritte für eine effiziente Sammlung von Zellzyklusgene und für die Beseitigung von sich wiederholenden "Vielflieger" Allele sind: 1) die kohärente Definition des Anhaltens Phänotyp Merkmale für unvollständige Zellzyklen und 2) die parallele Komplementierung Assay gegen bereits identifizierte Abfrage Gene, die die Sammlung mit neu isolierten diejenigen zu vergrößern.

Wenn durch Hell-Dunkel - Zyklen synchronisiert, wächst Chlamydomonas photo während der Tagesstunden und steigt in Zellgröße> 10 - fach ohne DNA - Replikation oder der Zellteilung ^13. Etwa deckungsgleich mit dem Beginn der Nacht, dann Zellen durchlaufen mehrere Zyklen von alternierenden DNA - Replikation, Mitose und Zellteilung (Abbildung 8). Dieser Regulierungs scheme stellt eine natürliche Unterscheidung zwischen Genen, die für Zellwachstum und -integrität und Gene, vor allem erforderlich speziell für den Zellteilungszyklus erforderlich. Wir fanden heraus , dass die 10-Stunden und 20-Stunden - Zeitpunkten sehr informativ sind für eine erste grobe phänotypische ¹ geschnitten. Die breite Klassen von ts letalen Mutanten , die wir derzeit erkennen, auf der Grundlage dieser Bilder (siehe SI in Tulin und Cross, 2014) ^1, sind: Notch, Popcorn, Runde, Klein, Mittel, frühe Lyse und Multiple-Zyklus (Abbildung 8 ).

Die drei wichtigsten Kategorien konzentrieren wir uns auf sind Notch, Popcorn, und rund. Die "Notch" und "Popcorn" Phänotypen wurden zuvor gezeigt , von den meisten Zellzyklus-spezifischen Läsionen charakteristisch zu sein (beispielsweise mitotische cyclin-dependent kinase, DNA Replikationsmaschinerie und Topoisomerase II) ^1. Das Aussehen eines (Notch) oder mehrere (Popcorn) scheinbaren Ebenen der beginnenden, aber erfolglosen Zellteilung ist eine bequeme Morphollogischen Indikator der Zellzyklus-Initiation. Diese Mutanten weisen in der Regel keine oder nur geringe Wachstumsdefekte, mit einem Anstieg der Zellvolumen ähnlich wie WT an der 10-Stunden-Marke. Die Notch und Popcorn Phänotypen sind in 10 Stunden offensichtlich und werden von 20 Stunden vollständig entwickelt (häufig mit Zell-Lyse verbunden sind). "Rund" Zellen wachsen ähnlich wie bei WT aber mit stark reduzierten Produktion von scheinbaren anfänglichen Teilungsebenen, so groß, rund arretierten Zellen führt. Zurück Mutanten in dieser Kategorie sind in Komponenten der Anaphase fördernden Komplex ¹⁴ oder in Genen , die für Mikrotubuli - Funktion (Tubulin-Falten - Cofaktoren, Gamma-Tubulin - Ring - Komplex) ¹ erforderlich gefallen. Zu späteren Zeitpunkten zeigen diese Zellen häufig ausgeprägte Zelllyse.

"Klein" und "Medium" Zellen wachsen entweder vernachlässigbar (Small) oder deutlich weniger als WT (Medium). Viele dieser Mutanten bisher identifiziert haben Läsionen in Genen, deren Anmerkungen vorschlagen Rollen in grundlegenden cellular Wachstumsprozesse (Übersetzung oder Membran-Biogenese). Die wichtigste mikroskopische Unterscheidung zwischen Medium und Rund beruht auf der Menge des Wachstums bei 10 h (Runde: wie WT; Medium: reduziert). Da die kleinen und mittleren Kategorien recht groß sind und wahrscheinlich Läsionen in einem großen Bereich von zellulären Wege zu reflektieren, versuchen wir nicht, diese Kategorien zu sättigen; Allerdings wollen wir die Vertreter der Klasse molekular identifizieren Phänotypen von Verlust in verschiedene Wege zu verstehen. Zwei unstudied Kategorien sind: 1) die frühen Lyse-Mutanten, die Integrität (Verlust der grünen Farbe, Verlust von refractility verlieren) durch die 10-Stunden-Marke, mit wenig Indizien für eine vorherige Zellwachstum und 2) die mehrere Zyklen. Die Zellen vermehren sich in ähnlicher Weise bei 10 und 20 h WT, obwohl sie eine völlige Unfähigkeit zur Durchführung von längerfristigen Verbreitung aufweisen.

Wir charakterisieren meist "Kerbe", "Popcorn" und "rund" und kleine und mittlere Rundzellen auszuschließen, als auchwie undichte Mutanten, die komplette wenigen Zellteilungen. Dies ist vor allem, um sicherzustellen, daß grundlegende zelluläre Funktionen, wie das Wachstum und die Membranintegrität, sind funktionell und die Wahrscheinlichkeit für die Division-verwandte Gene zu bereichern. Dieser Ansatz wird gefunden empirisch effizient zu sein; jedoch kann es sein, dass ein Zellzyklus-Gens pleiotrope ist und früher zusätzliche Rollen in G1, vor der eigentlichen Division. Solche Fälle, die wir erwarten, selten zu sein, werden vermisst. Generell streben wir eine homogene Verhaftung, die durch eine ursächliche Mutation in hoher Wahrscheinlichkeit ist, dass ein völlig dysfunktionalen Protein ist. Jedoch aus dem gleichen Grund, wie gerade beschrieben, kann es mehrere Verhaftung Punkte sein und daher ist eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl ratsam Kandidaten.

Um die Sammlung mit neu identifizierten Gene zu bereichern, werden die ausgewählten Kandidaten für die Komplementierung getestet. Wir benötigen ts- in der Positivkontrolle (Abfrage für Abfrage Mutation) und ts + in der Negativkontrolle (query gegen WT). Neue Mutanten in der gleichen Komplementierungsgruppe wie die Abfrage sind ts-. Die Mitgliedschaft in der gleichen Komplementierungsgruppe spiegelt fast immer eine molekulare Läsion im gleichen Gen (dies war der Fall für jedes solches Gen wir getestet haben). Daher ist für "Vielflieger", ist dieses Kriterium für die weitere Charakterisierung ausschließe. Mutanten, die nicht an den gleichen Komplementationsgruppen wie die getesteten Abfragen sind Kandidaten für neue Gene und weiter gekennzeichnet durch Bioinformatik und experimentelle Werkzeuge waren. Sehr variable Rückgewinnung von TS- Allele in verschiedene Komplementierungsgruppen ist ein bekanntes Phänomen, das heißt, Variabilität als Rauschen Poisson deutlich größer ist, aufgrund der großen intrinsischen Variabilität der Veränderlichkeit zwischen verschiedenen Genen zu TS-. Ursachen könnten intrinsische Thermolabilitat Unterschiede umfassen; verschiedene Proteingrößen; das Vorhandensein eines Proteins als Monomer im Vergleich zu als große, komplexe stabilisiert; und mutagene Hot Spots. Dies ist eine fast reine Nuisance. eine resultierende positive Ergebnis ist jedoch, dass die "Vielflieger" Liste ist nicht lang (mit nur ein paar Ziele die meisten der Liste belegen), so dass die arbeitsintensive Komplementierung Prüfung ist nicht eine massive Unternehmen bis in die späteren Phasen des Projekts.

Als komplementärer Ansatz führten wir eine Verknüpfung Assay. In diesem Assay wird doppelt-resistenten Nachkommen werden ausgewählt und sind für die TS- Phänotyp getestet. Ein ts- Phänotyp ist zu erwarten (und beobachtet) für Mutanten in der gleichen Komplementierungsgruppe wie die Abfrage oder für eng verknüpfte Mutationen. Für jede der getesteten Gene wird ein WT Nachkommen (ts + Phänotyp) in einer gewissen Wahrscheinlichkeit auf der genetischen Distanz abhängig erscheinen erwartet. Wir schätzen, dass es etwa 100 Zygosporen für jede Paarung in diesen Punkten. Unter der Annahme 100% meiotischen Effizienz, wird dies dazu führen, um die 100 Doppelarzneimittelresistenten Nachkommen von den unverknüpften drug resistance Kassetten (25% der meiotischen Nachkommen, vier pro Meiose durch Mendelian Vererbung). Dies wäre auch der Fall für TS- Mutationen, wo 25% der Nachkommen werden Doppelmutante sein, und 25% WT sein, wenn die Abfrage und Test Mutationen unlinked sind. Daher aus dem Doppelarzneimittelresistenten Nachkommen derselben, 25% wt (etwa 25 Zellen) sein. Dies ist der Fall für völlig unverbundenen Mutationen; jedoch moderate Verknüpfung (innerhalb von ~ 20 cm, ca. 2 Mb oder 2% des Genoms ¹¹⁵⁾ wird stark reduzieren oder ts + Signal zu beseitigen. Im Fall der Bindung der getesteten Mutation zur antibiotischen Kassette, ts + Haploiden, die doppelt-drug-resistenten liegen in sehr geringen Mengen. Dies manifestiert sich als offensichtliche Versagen bei allen Mutanten zu rekombinieren getestet, trotz Ergänzung alle Mutanten getestet, ein anomales Ergebnis, das leicht festgestellt wird; in solchen Fällen wird Rückkreuzungs das Problem lösen.

Beide von Vorwissen und Sequenzanalyse erwarten wir , Zellzyklus - Gene in der Chlamydomonas etwa 500 Gene ² zu sein, obwohl most, aber wahrscheinlich nicht alle, sind wesentlich. Wir werden die Notwendigkeit für zusätzliche Mutagenese Runden zu bewerten, da mehr Mutanten und den Grad der Sättigung steigt gesammelt werden.

Dieses Verfahren ist einzigartig entworfen für wesentliche biologische Prozesse zu studieren und die Gene und Proteine, die sie durchführen. Andere Methoden zur Erzeugung Störungen in essentiellen Genen existieren (zB Umwandlung von zufällig mutagenisierten Allele ^16, bedingt transkribiert Allele ¹⁷ oder hypomorphen Allele ^18). Aber sie alle erfordern eine homologe Rekombination, die in vegetativen Chlamydomonas stark unterdrückt wird. Die gruppierte, regelmäßig kurze Palindrom Wiederholung (CRISPR) voneinander beabstandete / Cas9 System als ein mächtiges Werkzeug hergestellt wurde für Genveränderung ^19; jedoch ist es noch effizienter ²⁰ in Chlamydomonas zu arbeiten. Entscheidend ist, erfordern alle diese Methoden Vorwissen des Ziels. Dies ist eine schwerwiegende Einschränkungwenn man will, die Möglichkeit zu haben, um etwas Neues zu lernen! Unser Ansatz wird Mutationen zu identifizieren essentielle Gene, unabhängig von einem Vorwissen ergeben. Daher wird bei dem gegenwärtigen Stand der Technik, Isolation von Zufalls ts durch Gen-Identifizierung durch tiefe Sequenzierung Mutationen können die effizienteste Methode, um einen schnellen Einstieg in mikrobiellen Zellbiologie in der Anlage superkingdom sein.

Identifizierung von Mutationen verursachenden (unter ~ 100 codierende Sequenz verändernde Mutationen in jedem Klon) über den Rahmen dieses Papiers ist. Tief Sequenzierung von gebauschten segregant Schwimmbäder ¹ ist wirksam , aber arbeitsintensiv. Eine kombinatorische Pool Strategie für die Bestimmung aller Mutationen in einer großen Anzahl von Stämmen, nach einer kleinen Anzahl von Pools Sequenzierung, ist sehr kosten- und arbeitseffizient. Eine neue Strategie für kombinatorische gebauschten segregant Sequenzierung ist in der Entwicklung, die die Identifizierung der ursächlichen Mutationen in Dutzenden von Mutanten ermöglicht simultaneously in einer einzigen Sequenzierungslauf (in Vorbereitung). Diese Wirkungsgrade sind sehr wichtig, die kritische Genidentifizierung Schritt zu halten mit der sehr schnellen Anhäufung von Mutanten zu ermöglichen, die ermöglicht wird durch die hier beschriebenen Verfahren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
Hudson RapidPick colony picker	Hudson Robotics
MultiDrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small tube metal tip cassette	Thermo Scientific	24073295
Singer RotoR replica-plating robot	Singer Instruments		Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’)	Singer Instruments		Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7020