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Zusammenfassung

Dies ist ein Protokoll zur intrazellulären Proteinprotein Interaktionen basierend auf Biotin-Avidin Pulldown-System mit der Neuheit kombinieren Zelle eindringen Sequenzen zu studieren. Der Hauptvorteil ist, dass die Zielsequenz mit lebenden Zellen statt Zelle Lysates inkubiert wird und daher die Interaktionen im Zusammenhang mit zellulären auftreten werden.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Protokoll zur intrazellulären Proteinprotein Interaktionen zu untersuchen, die auf das weit verbreitete Biotin-Avidin Pulldown-System basiert. Die Modifikation präsentiert umfasst die Kombination dieser Technik mit Zelle eindringen Sequenzen. Wir schlagen Zelle eindringen Köder zu entwerfen, die mit lebenden Zellen statt Zelle Lysates inkubiert werden können und daher die Wechselwirkungen gefunden werden diejenigen, die im Zusammenhang mit intrazellulären auftreten widerspiegeln. Connexin43 (Cx43), ein Protein, das Gap Junction Kanäle und Hemichannels Formen ist in hochwertigen Gliome nach unten geregelt. Die Cx43-Region, bestehend aus Aminosäuren 266-283 ist verantwortlich für die Hemmung der onkogenen Aktivität von c-Src in Gliom Zellen. Hier verwenden wir TAT als der Zelle eindringen Sequenz, Biotin als Pulldown-Tag und in der Region von Cx43 zwischen Aminosäuren 266-283 als Ziel, intrazelluläre Interaktionen in den menschlichen Gliom zu transfizieren Stammzellen zu finden. Eine Einschränkung des vorgeschlagenen Verfahrens ist, dass das Molekül als Köder scheitern könnte, um richtig und somit Falten verwendet, die Wechselwirkungen gefunden nicht den Effekt zugeordnet sein könnte. Jedoch kann diese Methode besonders interessant für die Interaktionen Signal Transduction Bahnen beteiligt sein, denn sie in der Regel von intrinsisch ungeordneten Regionen durchgeführt sind und daher, sie keine, eine geordnete Falten benötigen. Darüber hinaus ist einer der Vorteile der vorgeschlagenen Methode, dass die Relevanz von jedem Rückstand auf die Interaktion einfach untersucht werden kann. Dies ist ein modulares System; Daher können andere Zelle eindringen Sequenzen, anderen Tags und andere intrazelluläre Ziele eingesetzt werden. Schließlich der Umfang dieses Protokolls ist weit über Protein-Protein Wechselwirkung, weil dieses System angewendet werden kann, zu anderen bioaktiven Ladungen wie RNA-Sequenzen, Nanopartikel, Viren oder jedes Molekül, das mit Zelle eindringen Sequenzen ausgestrahlt werden kann und verschmolzen mit Pulldown-Tags, deren intrazelluläre Wirkmechanismus zu studieren.

Einleitung

Protein-Protein-Interaktionen sind essentiell für eine Vielzahl von zellulären Prozessen. Um diese Prozesse zu verstehen, sind Methoden zur Identifizierung von Protein-Interaktionen innerhalb der komplexen intrazellulären Umgebung erforderlich. Eines der am häufigsten verwendeten Methoden zur Ermittlung der Interaktionspartner eines Proteins ist dieses Protein oder eine mimetische Peptid eines Teils dieses Protein als in Affinität Pulldown-Experimenten gefolgt von Erkennung von Bindeproteine Köder zu verwenden. Das Avidin-Biotin-System dient häufig wegen der hohen Affinität, Spezifität und stabile Wechselwirkung zwischen Avidin und Biotin1,2. In der Regel Biotin an den Köder (Protein oder Peptid) kovalent gebunden ist und nach einer Inkubation mit der Zelle Lysates ermöglichen die Einrichtung von Interaktionen, die biotinylierte Köder gebunden an die intrazelluläre Partner mit Avidin oder Avidin abgerissen Derivate konjugiert mit Unterstützung Perlen. Dann sind Köder-Protein-Wechselwirkungen durch Denaturierung Elektrophorese gefolgt von Western-Blot nach dem Waschen, Elution und Analyse erkannt. Eines der Probleme dieser Technik ist, dass die Wechselwirkungen zwischen Proteins des Interesses und seiner intrazellulären Partner außerhalb der zellulären Kontext stattfinden. Dies ist besonders wichtig für die Interaktionen Signal Transduction Bahnen beteiligt, da sie in bestimmten intrazellulären Orten statt, sie vergänglich sind und sie in der Regel durch nicht reichlich Proteine erfolgt. Daher können innerhalb der Zelle Lysates diese Interaktionen maskiert werden durch andere reichlich Proteine oder Proteine, die in der Regel nicht in der Nähe sind.

Zelle eindringen Peptide (CPPs) sind kurze Peptide (≤40 Aminosäuren), bestehend aus meist kationische Aminosäuren, die in der Lage, eine Vielzahl von Molekülen in fast jeder Zelle3zu transportieren. Ladungen wie Proteine, Plasmid-DNA, SiRNA, Viren, bildgebenden Agenten und verschiedenen Nanopartikeln haben CPPs und effizient verinnerlichten4,5konjugiert. Wegen dieser Transport Fähigkeit sind sie auch bekannt als Protein Transduktion Domains (PTDs), Membran translocating Sequenzen (MTSs) und Trojan Peptide. Unter der CPPs untersucht das TAT Peptid aus dem HIV Transaktivator Protein TAT6 wurde eine der am häufigsten 7,8,9. TAT ist ein Nonapeptide, das enthält 6 Arginin und 2 Lysin Rückstände und ist daher stark kationischen. Ersatz-Studien haben gezeigt, dass positive Nettoladung von TAT für elektrostatische Wechselwirkungen mit den Plasmamembranen der eukaryotischen Zellen und seine anschließende Internalisierung10notwendig ist. In ähnlicher Weise bindet an anderen CPPs positiv geladenen TAT stark elektrostatisch auf verschiedenen negativ geladene Artenvielfalt an der extrazellulären Oberfläche der Zelle Membranen, einschließlich Lipid Kopfgruppen, Glykoproteinen und Proteoglykanen3 , 10. die bioaktiven Ladungen transportiert durch TAT werden sofort frei im Zytosol, deren intrazelluläre Partner zu erreichen.

Hier präsentieren wir eine Methode, die die TAT CPP mit Biotin kombiniert zu intrazelluläre Interaktionen zu untersuchen. Ziel ist es, Zelle eindringen Köder zu entwerfen, durch die Fusion des Ziel Biomolekül TAT und Biotin. Der Hauptvorteil dieses Vorschlags ist, dass die Wechselwirkungen zwischen den Köder und seinen Partnern im Rahmen seiner zellulären stattfinden werden. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu zeigen haben wir als eine kleine Sequenz des Proteins Cx43 Köder, die intrazellulär Interaktion mit der Protoonkogenproduktes c-Src11,12,13gemeldet wurde. Cx43 ist eine integrale Membranprotein, die ist weit verbreitet in Astrozyten14ausgedrückt und ist Down-reguliert in hochgradige Gliome, die häufigste maligne Tumor des zentralen Nervensystems15,16,17 ,18. Es wurde bereits gezeigt, dass die Cx43-Region, die Interaktion mit c-Src (Aminosäuren 266-283 in menschlichen Cx43; PubMed: P17302) verschmolzen, (TAT-Cx43266-283) TAT die Onkogene Aktivität von c-Srcin Gliom Zellen hemmt und Gliom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen)19,20,21. Um den intrazellulären Köder zu entwerfen, hat Cx43266-283 fusioniert TAT am N-Terminus (TAT-Cx43266-283) und Biotin am C-Terminus (TAT-Cx43266-283- B). Diese Strategie hat erfolgreich in der Ratte Gliom C6-Zell-Linie zur c-Src, c-terminale Src-Kinase (CSK) und Phosphatase und Homolog (PTEN) als intrazelluläre Partner dieser Region von Cx4320tensin zu identifizieren. Hier beschreiben wir diese Methode testen seine Wirksamkeit in der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen, die sehr relevant für Gliom Therapie aber viel härter sind, als nicht-Stamm Gliom Zellen zu transfizieren.

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der Universität von Salamanca.

(1) Zellen

  1. Zwei Tage vor Beginn des Verfahrens Platte die Zellen an der erforderlichen Dichte konfluierende am Tag des Experiments sein. Die Zellen in Flaschen oder Teller Platte. Allerdings wird die Proteingewinnung einfacher von Platten. Es eignet sich zur Vorbereitung mindestens 4 Platten 78 cm2 oder 2 Fläschchen 150 cm2 pro Zustand pro Experiment, um sicher zu sein, dass die Ergebnisse konsistent sind.
  2. In dieser Studie Platte menschlichen G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen in 4 Fläschchen 150 cm2, kultiviert in RHB-A Stammzell-Medium ergänzt mit 2 % B27, 1 % N2, 20 ng/mL EGF und b-FGF wie Pollard Et Al.22beschrieben. Prozess als Zusammenfluss erreicht wurde. Zum Beispiel wenn 5 x 106 G166 Zellen in einem 150 cm2 Kolben überzogen waren, wurden sie 2 Tage nach der Beschichtung verarbeitet.

(2) biotinylierte CPPs

  1. Drehen Sie die Fläschchen mit der gefriergetrockneten biotinylierte CPPs (BCPPs) bei 8200 X g für 30 s, um etwas von dem Pulver auf den Deckel zu vermeiden. Sind Sie ein Steuerelement BCPP sicher sein, dass die Wechselwirkungen gefunden der Zielsequenz spezifisch sind. In dieser Studie wurde das Steuerelement BCPP TAT-Biotin (TAT-B) und die Behandlung BCPP war TAT-Cx43266-283- B. Wie TAT verschmolzen, Rührei oder mutierten Fragmente Bindung an Biotin können andere Steuerelemente verwendet werden.
  2. Lösen Sie die BCPPs in dem entsprechenden Kulturmedium, die vom Hersteller angegebene Stammlösung; zum Beispiel um eine Stammlösung von 2 mg/mL zu erhalten BCPP zur Behandlung der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen hinzufügen 0,5 mL Kulturmedium GSC eine Durchstechflasche enthält 1 mg der BCPP. Wirbel und sicherstellen, dass das Peptid ist gut gelöst.

(3) Schläuche

Hinweis: Bereiten Sie mindestens zwölf 1,5 mL Röhrchen pro Bedingung im Abschnitt 7.

  1. Markieren Sie die ersten 3 Tuben pro Zustand. Sie werden das Gesamtvolumen der zellulären Lysates in Schritt 6.4 erhalten haben.
  2. Markieren Sie einen A in 3 Tuben pro Zustand. Diese Rohre werden die ersten Überstände nach lyse und Spinnen die zelluläre Lysates Schritt 7.2 erhalten haben.
  3. Markieren Sie einen B in 3 Tuben pro Zustand. Diese Rohre haben eine kleine aliquoten die ersten Überstände. Diese Lysates dient als der Western-Blot-Proben im Schritt 7.3.
  4. Markieren Sie eine C in 3 Tuben pro Zustand. Diese Rohre werden die Überstände nach dem Pulldown-Menü mit NeutrAvidin, Schritt 7,7 erhalten haben.
    Hinweis: Dies ist wichtig für den Fall, dass der Western-Blot zeigte kein Signal für Proteine, also Proteine wurden nicht abgerissen oder wurden bei einigen Schritt des Verfahrens verloren. Wenn dies die Situation waren, wiederholen Sie den Vorgang, pull-down-Proteine.

(4) cellular Treatment mit der BCPPs

  1. Aspirieren Sie das Kulturmedium.
  2. Ersetzen Sie den entsprechenden Datenträger frisches Medium erforderlich, um der BCPPs in das kleinste Volumen des Mediums entsprechend der Inkubationszeiten zu inkubieren. Es ist sehr wichtig, dass in jedem Fall das Medium vollständig die gesamte Oberfläche der Platte/Küvette abdeckt, so dass die Zellen nicht aus, zum Beispiel 6 mL pro 150 cm2 für ein 30 min Inkubation trocken.
  3. Fügen Sie das Volumen der Vorratslösung der BCPP hinzu, Zellkulturen, die Konzentration zu erreichen, die bewiesen hat, um wirksam zu sein. In dieser Studie 50 µM TAT-Cx43266-283erwies -B, um GSC Verbreitung zu reduzieren.
    1. Aus diesem Grund hinzufügen 92,8 µL von 2 mg/mL TAT-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/Mol) pro mL Kulturmedium zu einer Endkonzentration von 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Wenn das Volume hinzugefügt werden für Kontrolle Peptide, komplett mit Kulturmedium bis zu der gleichen Endvolumen unterscheidet. Zum Beispiel 49.1 µL TAT-B (MW = 1914.31 g/Mol) plus 43,7 µL GSC Medium pro mL Kulturmedium, eine Endkonzentration von 50 µM zu erhalten hinzugefügt wurden TAT-B.
  4. Legen Sie die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min um sicherzustellen, dass die Wechselwirkungen zwischen den BCPP und den intrazellulären Partnern stattfinden. Wenn die Interaktion länger dauert, inkubieren Sie für längere Zeit oder einstellen Sie Zeiten, für den Fall, dass das Experiment bestand aus einen zeitlichen Verlauf. Darüber hinaus kann das Zusammenspiel von Interesse gefördert oder durch anregende verschiedene intrazelluläre Signalwege verhindert werden.

(5) Puffer und Lösungen.

  1. Bereiten Sie PBS pH-Wert 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
  2. Bereiten Sie Protein Lyse Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1 % IGEPAL, Prior zu verwenden, fügen Sie die folgenden: 1/100 (V/V) Protease Inhibitor Cocktail, Natriumfluorid, 1 mM 1 mM Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,1 mM Natrium Orthovanadate.
  3. Bereiten Sie Laemmli-Puffer: (4 X: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M Glycerin; 3,7 % SDS (p/V); 0,6 M β-Mercaptoethanol oder 9 mM DTT; 0,04 % (V/V) Bromophenol blue (BB)).

6. Proteingewinnung

Hinweis: Proteingewinnung wurde als zuvor beschriebenen20,23durchgeführt. Tragen Sie in diesem ganzen Abschnitt des Verfahrens bei 4 ° C.

  1. Das Kulturmedium vollständig abzusaugen.
  2. Waschen 3 x 10 mL mit eiskalten Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (PBS) pro 150 cm2 sehr sorgfältig um Ablösung der Zelle zu vermeiden.
  3. Um die Zelle lysate zu erhalten, fügen Sie 3 mL Lyse Puffer pro 150 cm2 und kratzen Sie die Oberfläche gründlich mit einer Zelle Schaber. Die Platte/Kolben auf etwa 45 Grad kippen wird die Zelle Lysates in ihre entsprechenden Röhren sammeln erleichtern.
  4. Gießen Sie 1 mL der zellulären lysate pro Röhre in drei 1,5 mL-Tuben. Diese Rohre werden mit den Zustand und die Replikation gemäß Schritt 3.1 gekennzeichnet.

(7) Pull-down

  1. Zentrifugieren Sie die 1,5 mL Röhrchen bei 11.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
  2. Übertragen Sie die Überstände auf neue Röhren (A).
  3. Nehmen Sie eine aliquote dieser überstand pro Zustand nach verschiedenen Rohre (B), d. h. 50 µL pro Röhre. 4 X Laemmli-Puffer (16,6 µL für 50 µL lysate) hinzufügen und frieren bei-20 ° C. Diese Lysates wird wie gewohnt Western-Blot Proben dienen.
  4. Homogenisieren Sie sehr gut NeutrAvidin Agarose durch sanftes Schütteln. Schneiden Sie die Spitzen der Pipettenspitzen zu erhöhen ihres Durchmessers und Pipettieren der Perlen.
Fügen Sie 50 µL NeutrAvidin Agarose pro mL Zelle lysate in den Rohren (A).
  • Inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit sehr sanft schütteln damit NeutrAvidin mit BCPPs verpflichtet, ihren intrazellulären Partnern interagieren können.
  • Zentrifugieren Sie bei 3.000 X g für 1 min bei 4 ° C, den Komplex der NeutrAvidin mit Proteinen zu sammeln.
  • Nehmen Sie die Überstände vorsichtig und übertragen Sie sie auf saubere Rohre (C). Halten Sie sie, um sie zu verwenden, für den Fall, dass das Pulldown-Menü nicht erfolgreich ist.
  • Waschschritte: die Pellets (Röhrchen A) frischen Lyse Puffer hinzu, Aufschwemmen durch Umkehrung und wiederholen Sie die Schritte 7,6) und 7,7) für 5 weitere Male. Diese Überstände können verworfen werden.
  • Entfernen Sie der Überstände und 2 X Laemmli-Puffer in das gewünschte Endvolumen (40 µL pro 1,5 mL-Tube für Pellets aus 150 cm2 Fläschchen konfluierende Zellen gewonnen).
  • Eluieren bei 100 ° C für 5 min zu distanzieren von den Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Zentrifuge für 30 s bei 8.200 X g , pellet-NeutrAvidin Perlen.
  • Nehmen Sie die Überstände, die dissoziierten Proteine mit Kapillare Tipps, neue Rohre (D) enthalten. Die Perlen können gehalten werden, für den Fall, dass sich wiederholt Elution Schritte erforderlich.
    Hinweis: Die Überstände (Röhrchen D) können jetzt im Western-Blot geladen werden oder bei-20 ° c Einfrieren

    • (8) Western-Blot

    Hinweis: Western blotting wurde als zuvor beschriebenen24durchgeführt.

    1. Gleichwertigem Umfang jeder Probe pro Lane auf Bis-Tris (4-12 %) Midigels in einem Midi-Cell-Elektrophorese-System zu laden.
    2. Transblot Proteine mit einem trockenen befleckende System in einen regulären Nitrozellulose-Stapel.
    3. Färben Sie die Membran mit 10 % Ponceau für 10 Minuten.
    4. Waschen Sie die Membranen 3 x 5 Minuten mit 5 mL der TTB.
    5. Blockieren Sie die Membranen mit 7 % Milch in TTB für 1 h mit sanft schütteln in Rohren oder kleinen Boxen. Stellen Sie sicher das Volumen verwendet genug, um die Membranen zu decken ist und, dass sie nicht trocken, d.h. 40 mL pro ganze MIDI-Membran.
    6. Waschen Sie 3 x 5 Minuten mit 5 mL der TTB.
    7. Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit dem primären Antikörper gegen das Protein des Interesses mit sanft schütteln.
    8. Waschen Sie 3 x 5 Minuten mit 5 mL der TTB.
    9. Inkubieren Sie die Membran bei Raumtemperatur mit der entsprechenden Peroxidase konjugierten Sekundärantikörper in TTB für 1 h.
    10. Waschen Sie 3 x 5 Minuten mit 5 mL der TTB.
    11. Entwickeln Sie mit einem chemiluminescent Substrat in einem Chemilumineszenz-System.

    (9) Problemlösung

    1. Wenn nach der Entwicklung der Western die Beispiele zeigten kein Signal überhaupt für Proteine Blot, überprüfen Sie die Ponceau.
      Hinweis: Die Membran in Ponceau sollten nicht definiert und zahlreiche Bands entlang der Gassen geladen. Wenn die Bänder nicht sehr auffällig sind, die Menge der Proteine geladen nicht ausreichen oder die Übertragung möglicherweise nicht falsch gegangen. Betrachten Sie die Wiederholung des Western-Blot.
    2. Wenn es kein Fleck überhaupt in die Ponceau-Membran in jeder Spur, wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 7.4 in den Rohren (C).
    3. Wenn nach der Entwicklung des Western-Blot ein Protein-Signal sehr schwach ist, aber die Ponceau Proteine zeigte, die Membran mit dem primären Antikörper wieder für längere Zeit inkubieren. Wenn das Signal noch eher schwach ist, wieder bei Raumtemperatur inkubieren.

    10. andere Techniken verwendet in diesem Artikel

    1. Immunocytochemistry von BCPPs
      1. Zellen in 4 % Paraformaldehyd (0,2 mL pro cm2) für 20 min zu beheben.
      2. 3 x 5 min. mit PBS (0,2 mL pro cm2) waschen.
      3. Anwenden des entsprechenden Antikörpers (mindestens 0,15 mL pro cm2) verdünnt in Antikörperlösung in des Herstellers angegebenen Konzentration gegen Ihr Protein des Interesses über Nacht bei 4 ° c
      4. Mit einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (0,15 mL pro cm2) für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 10.1.2-10.1.4 mit anderen Antikörper gegen die Proteine des Interesses. Achten Sie darauf, dass Sie nicht derselben Art für verschiedene primäre Antikörper oder gleichen Wellenlänge Fluorophore für sekundäre Antikörper zu verwenden.
      6. Montieren Sie die Zellen mit antifade Reagenz (0,005 mL pro cm2).
      7. Analysieren Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer digitalen Kamera verbunden.
    2. MTT-assay
      1. Kultur der Zellen bei 37 ° C in 24-Well-Platten.
      2. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 75 min. mit 0,15 mL Kulturmedium pro cm2 enthaltend 0,5 mg/mL MTT.
      3. Aspirieren Sie das Medium und inkubieren Sie die Zellen für 10 min in der Dunkelheit mit Dimethyl Sulfoxid (0,25 mL pro cm2) mit leichten Schütteln.
      4. Messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 570 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.

    Ergebnisse

    Vor der Verwendung BCPPs, um intrazelluläre Interaktion zu studieren, ist es wichtig, die Auswirkungen von BCPP Vs CPP zur Validierung der Ergebnisse mit BCPP zu vergleichen. Folglich um zu prüfen, ob die Aufnahme von Biotin die Aktivität der Zielsequenz ändert, wir zunächst analysiert die Auswirkungen der TAT-Cx43266-283- B verglichen mit TAT-Cx43266-283 auf G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Morphologie. Hierzu haben wir einige Immunfluoreszenz Analysen zweier Zellskelett Proteine, F-Aktin und α-Tubulin nach 24 Stunden nach der Behandlung durchgeführt. Abbildung 1 zeigt, dass G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen in Anwesenheit von 50 µM TAT-Cx43266-283 oder TAT-Cx43266-283- B erwerben eine rundere Form im Vergleich zu den verlängerten und erweiterten zellularen Verlängerungen gezeigt in den Steuerelementen (TAT oder TAT-B). In der Tat Abbildung 1 b zeigt, dass Actinfilamente meist als Aktin Netzwerke montiert werden, wenn die Zellen mit TAT-Cx43266-283 oder TAT-Cx43266-283behandelt wurden -B, während sie weitere Actin-Bündel in der Kontrollzellen bilden (behandelt mit TAT oder TAT-B)25. Im Gegensatz dazu schwankt α-Tubulin Verteilung nicht zwischen den verschiedenen Bedingungen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit von Biotin nicht die Wirkung der Zielsequenz auf die Morphologie der G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen geändert. In früheren Studien20,21haben wir gezeigt, dass TAT-Cx43266-283 G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Verbreitung reduziert. In dieser Studie untersuchten wir ob TAT-Cx43266-283- B übt die gleiche Wirkung in das Wachstum als TAT-Cx43266-283. Dazu analysierten wir die Verbreitung der G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen von MTT-Assay nach 72 h Behandlung. Die MTT-Assay ist ein farbmetrischen Assay für die Beurteilung der metabolischen Aktivität der Zellen. MTT wird von NAD (P) H Oxidoreductase Enzyme in den Mitochondrien spiegelt die Anzahl der lebensfähigen Zellen verstoffwechselt. Abbildung 2 zeigt, dass der Rückgang der Zellviabilität G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen nicht wesentlich anders ist, wenn Zellen mit 50 µM TAT-Cx43266-283 oder 50 µM TAT-Cx43266-283behandelt wurden - B. In der Tat schränkte beide G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Verbreitung im Vergleich zu der Kontrolle, TAT oder TAT-B.

    Sobald wir bestätigt, dass die Wirkung von unseren Zielsequenz in G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen (TAT-Cx43266-283) durch die Aufnahme von Biotin am C-Terminus nicht geändert wurde (TAT-Cx43266-283- B), untersuchten wir die intrazelluläre Partner dieser Sequenz nach dem Protokoll beschrieben in dieser Studie (Abbildung 3). Weil dabei in den Mechanismus der TAT Internalisierung26beteiligt, analysierten wir die Anwesenheit von Caveolin-1 (Cav-1) in der Pulldown-Menüs. Western-Blot Analyse (Abbildung 4) zeigte, dass TAT-B und TAT-Cx43266-283- B interagieren mit Cav-1. Jedoch die Fähigkeit des TAT-Cx43266-283- B c-Src, PTEN und CSK zu rekrutieren ist stärker als die gefunden mit TAT-B. Fokale Adhäsion Kinase (FAK) ist ein Substrat von c-Src, die nicht gezeigt worden, um mit Cx43 interagieren. In der Tat FAK zeigte keine signifikante Interaktion mit TAT-B oder TAT-Cx43266-283- B.

    Das Zusammenspiel von TAT-Cx43266-283bestätigen -B und c-Src, G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen inkubiert wurden mit 50 µM TAT-Cx43266-283- B für 30 min und ihrer Lokalisation folgte mit fluoreszierenden Streptavidin konfokalen Mikroskopie (Abbildung 5 ). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die intrazelluläre Verteilung von TAT-Cx43266-283- B liegt in der Nähe der Plasmamembran (dargestellt von Phosphatidylserin Färbung) und entspricht damit der c-Src. In der Tat Co Lokalisierung Analysen ergaben einige Punkte der Co Lokalisierung (weiß) zwischen TAT-Cx43266-283- B und c-Src im Bild zusammenführen. Konfokale Mikroskopie Studien bestätigt die Ergebnisse mit den in dieser Studie beschriebenen BCPP Pulldown-Protokoll.

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    Abbildung 1: Wirkung von BCPP und CPP auf GSC Morphologie.
    G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen wurden bei einer geringen Dichte vernickelt (2 x 104 Zellen / cm2) und nach 24 Stunden waren sie mit 50 µM Kontrolle CPP (TAT) inkubiert, Steuern, BCPP (TAT-B), CPP (TAT-Cx43266-283) oder eine Behandlung BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . (a) F-Aktin (rot), α-Tubulin (grün) und fusionierte + DAPI Immunostaining desselben Feldes G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Morphologie zeigt. Balken = 50 µm. b) F-Aktin Immunostaining zeigt die unterschiedliche Verteilung von F-Aktin in G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen nach Inkubation für 24 h mit 50 µM CPP (TAT) zu steuern oder zu kontrollieren, BCPP (TAT-B) im Vergleich zu 50 µM Behandlung CPP (TAT-Cx43266-283) oder BCPP (TAT-Cx43 266-283-B). Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    figure-results-6019
    Abbildung 2: Auswirkungen von BCPP und CPP auf GSC Lebensfähigkeit.
    G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen wurden bei 5500 Zellen/cm2 24-Multiwell-Platten beschichtet und inkubiert mit 50 µM Kontrolle Peptide, CPP (TAT) oder BCPP (TAT-B), oder 50 µM Behandlung Peptide, CPP (TAT-Cx43266-283) oder BCPP (TAT-Cx43266-283- B). Die Zellviabilität wurde analysiert mit einem MTT-Assay nach 72 h. Die Ergebnisse werden als MTT Absorptionswerte ausgedrückt und sind der Mittelwert ± s.e.m mindestens 3 Experimente (++ P˂0.01 Vs Kontrolle. ** P˂0.01, *** P˂0.001 Vs TAT oder TAT-B; One-Way ANOVA WithTukey Post-Test). Beachten Sie, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Wirkungen der CPPs Vs BCPPs sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    figure-results-7096
    Abbildung 3: Protokoll Diagramm.
    Schritt für Schritt grafische Darstellung des Verfahrens wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll", von der Inkubation von BCPPs bis obtained.1 der eluierten BCPPs und ihre interagierenden Proteine waren) inkubieren Zellkulturen mit BCPPs auf die gewünschte Konzentration für die erforderliche Zeit. (2) während der Inkubation der BCPPs verinnerlicht und interagieren sie mit ihren intrazellulären Partnern. (3) Waschen Sie die Zellen dreimal auf Eis mit eiskaltem PBS. (4) lyse der Zellen, um Proteine zu extrahieren. (5) übertragen Sie Zelle Lysates auf Röhren.(6) drehen Sie sich mit 11000 X g für 10 min bei 4 ° C. (7) übertragen, die die Überstände auf neue Röhren (A) und halten eine kleine aliquoten Lysates zu verarbeiten als normale Western blot Proben in Rohr (B). (8) die NeutrAvidin Agarose Korne Aufschwemmen und jedes Rohr eine mit einem Schnitt Pipettenspitze 50 µL hinzufügen. (9) inkubieren Sie mit sanft schütteln für 12 h bei 4 ° C die NeutrAvidin Agarose Korne Interaktion mit BCPPs und ihren Partnern zu ermöglichen. (10) Spin für 1 min bei 3000 X g , die Perlen mit dem biotinylierte pellet Köder und ihre interagierenden Proteine gebunden. (11) übertragen Sie Überstände auf neue Rohre (C) und halten sie für den Fall das Pulldown-Menü muss wiederholt werden. 12) Waschen Sie die Pellets fünfmal mit frischen Lyse Puffer, Aufschwemmen durch Umkehrung, Spin für 1 min bei 3000 X g und den Überstand verwerfen. (13) entfernen Sie den Überstand vorsichtig. (14) fügen Sie das gewünschte Volumen von 4 x Laemmli-Puffer und die Proteine bei 100 ° C für 5 min. 15 eluieren) Spin bei 8200 X g für 30 s, um die Perlen zu Pellets. (16) übertragen der eluierten Proteine in der Überstand mit Kapillare Tipps, neue Rohre (D). (17) laden Sie auf Gele für Western-Blot Analyse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Abbildung 4: Studium der intrazellulären Interaktionen von TAT-Cx43266-283- B in G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen von Pulldown-gefolgt von Western-Blot.
    G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen inkubiert mit 50 µM TAT-B oder TAT-Cx43266-283- B. Nach 30 min, die die Zellen lysiert wurden und TAT-B oder TAT-Cx43266-283- B befestigt, deren intrazelluläre Partner abgerissen mit NeutrAvidin Perlen. Die eluierten Proteine wurden geladen und analysiert von Western-Blot, die Ebenen von FAK, c-Src, CSK, studieren PTEN und Cav-1. Beachten Sie, dass Cav-1 mit beiden TAT-B interagiert und TAT-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN und CSK interagieren bevorzugt mit TAT-Cx43266-283- B und FAK zeigte keine Interaktion mit TAT-B oder TAT-Cx43266-283-B. Bitte Klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Abbildung 5: Bestätigung der TAT-Cx43266-283- B intrazellulären Interaktionen in G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen von konfokalen Mikroskopie.
    G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen inkubiert mit 50 µM TAT-Cx43266-283- B. Nach 30 min waren Zellen fixiert und verarbeitet, um die TAT-Cx43266-283lokalisieren -B mit Cy2-Streptavidin (grün), c-Src durch Immunfluoreszenz (rot) und Phosphatidylserin mit annexin V (blau). Beachten Sie einige Punkte der Co Lokalisierung (weiß) zwischen TAT-Cx43266-283- B und c-Src in der Nähe der Plasmamembran in der Seriendruck-Bilder. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Diskussion

    Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein Interaktionen zu untersuchen. In dieser Studie vorgestellten Methode basiert auf das weit verbreitete Biotin-Avidin Pulldown-System in dem biotinylierte Köder mit Zelle Lysates ermöglichen die Einrichtung von Interaktionen ausgebrütet wird. Die Änderung in dieser Studie vorgestellt umfasst die Kombination dieser Technik mit Zelle eindringen Sequenzen. Schlagen wir Zelle eindringen Köder zu entwerfen, die mit lebenden Zellen statt Zelle Lysates inkubiert werden können und daher die Wechselwirkungen gefunden werden diejenigen, die im Zusammenhang mit zellulären aufgetreten widerspiegeln.

    Hier verwenden wir TAT als der Zelle eindringen Sequenz, Biotin als Pulldown-Tag und in der Region von Cx43 zwischen Aminosäuren 266-283 als Ziel, intrazelluläre Interaktionen in der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen zu finden. Die strukturelle Grundlage für die Interaktion zwischen Cx43 und c-Src ist bekannt11,12. Dies ist eine wichtige Aktivität, denn es die Onkogene Aktivität von c-Src in Gliom Zellen24,13 hemmt. In der Tat imitieren CPPs, enthält dieser Region (TAT-Cx43266-283) die antioncogenic Eigenschaften von Cx43 auf Gliom Zellen19,20,21. In Ratten Gliom C6 Zellen enthält der Mechanismus durch den TAT-Cx43266-283 c-Src hemmt die Rekrutierung von c-Src sowie die endogene Inhibitoren CSK und PTEN20. Es sollte erwähnt werden, dass die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen sind sehr interessant als Ziel in Gliom-Therapie, weil sie eine Subpopulation bilden, die resistent gegen herkömmliche Behandlungen und damit verantwortlich für das Wiederauftreten von diesem bösartigen Gehirn Tumoren27ist. Darüber hinaus sind sie schwer zu transfizieren Zellen und daher die Untersuchung der intrazellulären Wechselwirkungen wird immer schwieriger. CPPs sind rasch und effizient in den vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen19 Begünstigung ihrer Verwendung für das Studium der intrazellulären Interaktionen internalisiert. In dieser Studie, mit CPPs verschmolzen zu Biotin bestätigen wir das Zusammenspiel der Cx43-266-283 -Sequenz mit c-Src zusammen mit seiner endogenen Inhibitoren CSK und PTEN in der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen.

    Diese Methode ist sehr mächtig, um den intrazellulären Mechanismus der bioaktiven Substanzen zu studieren. Allerdings ist es sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die biologische Wirkung des biotinylierte Zelle durchdringende Köder nicht mit der nicht-biotinylierte einer erhaltenen unterscheidet. Dieser Schritt ist erforderlich, um die Wechselwirkungen mit dem Effekt der bioaktiven Substanz gefunden zu verbinden. Darüber hinaus sollte die Stabilität der Verbindung, seine möglichen Abbau durch Proteasen sowie die mögliche Toxizität, sorgfältig geprüft und berücksichtigt vor der Planung des Experiments. Im Beispiel vorgestellt wurde die Anti-proliferative Wirkung von TAT-Cx43266-283 auf G166 menschlichen vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen zuvor dokumentierten20. In dieser Studie bestätigen wir, dass die Anti-proliferative Wirkung von TAT-Cx43266-283- B und der TAT-Cx43266-283 ist sehr ähnlich. Darüber hinaus ergab die Analyse der zellulären Morphologie, dass α-Tubulin und F-Aktin-Verteilung ist sehr ähnlich in G166 vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen behandelt mit TAT-Cx43266-283- B oder mit TAT-Cx43266-283. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Aufnahme von Biotin am c-Terminus des TAT-Cx43266-283 nicht die Auswirkungen dieser Verbindung auf der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen geändert. Jedoch wenn Biotin die Auswirkungen des bioaktiven Moleküls ändern würden, können andere Tags für Proteinreinigung, wie die Flagge Octapeptide (DYKDDDDK)28, das humane Influenza Hämagglutinin-abgeleitete Tag HA (YPYDVPDYA) oder Glutathion getestet werden S-Transferase (GST)29. Ebenso, wenn TAT nicht die Zell-Population von Interesse gerichtet ist, andere Zelle durchdringende Sequenzen, wie penetratin, MPG (für ein Review, s.30) oder Zelle spezifische Sequenzen können gebrauchte31.

    Neben der Studie Proteine, die spezifisch mit der Zielsequenz interagieren, sollte im Idealfall das Vorhandensein, die sowohl die Steuerung und die Zielsequenz interagieren und Proteine, die als positive und negative Kontrollen, nicht mit ihnen interagieren angesprochen. In diesem Sinne wir fanden Cav-1 in der Steuerung und behandelt Situation darauf hindeutet, dass der Mechanismus der Verinnerlichung, die Caveolae beteiligt gewesen, wie es zuvor26gezeigt hat. Darüber hinaus fehlte FAK, die interagiert mit c-Src, aber soll nicht mit der c-terminalen Cx43 interagieren, bei der Kontrolle und behandelte Situation. Diese Ergebnisse untermauern die Spezifität des Zusammenwirkens von TAT-Cx43266-283- B, c-Src, CSK und PTEN. Um die Ergebnisse mit diesem Protokoll bestätigen, konfokale Mikroskopie, die Verteilung der interagierenden Proteine zu visualisieren und Co Lokalisierung zu studieren einsetzbar. So fanden wir, dass TAT-Cx43266-283- B und c-Src Ausstellung eine ähnliche intrazelluläre Verteilung mit einigen Punkten der Co Lokalisierung bestätigen die Ergebnisse mit der Drop-Down-Experimenten gewonnen. In der Tat, TAT-Cx43266-283- B ist in der Nähe der Plasmamembran, die darauf hindeutet, dass die Ladung in dieser Studie Cx43266-283, das Molekül an die intrazelluläre Partner leitet verteilt.

    Eine Einschränkung des vorgeschlagenen Verfahrens ist, dass das Molekül als Köder scheitern könnte, um richtig zu Falten und die zu erwartenden Effekte nicht gefunden werden würde. In diesem Fall konnte die Wechselwirkungen gefunden nicht dahingehend verknüpft werden. Jedoch kann diese Methode besonders interessant für die Interaktionen Signal Transduction Bahnen beteiligt sein, denn sie in der Regel von intrinsisch ungeordneten Regionen32 durchgeführt sind und daher sie nicht, eine geordnete Falten erfordern. Darüber hinaus ist einer der Vorteile der vorgeschlagenen Methode, dass der zeitliche Verlauf der Interaktion verfolgt werden kann, das gilt insbesondere für vorübergehende Interaktionen. Darüber hinaus kann die Relevanz jeder Rückstand auf die Interaktion problemlos untersucht werden. In der Tat ist es möglich, die Relevanz der posttranslationale Modifikationen auf Protein-Protein-Interaktion, z. B. durch Phosphomimetic Substitution von Glutamat für Serin oder Threonin zu studieren. Ebenso ermöglicht die Substitution von Serin oder Threonin für Alanin und Tyrosin für Phenylalanin testen die Wirkung von nicht-phosphorylatable Serin, Threonin oder Tyrosin.Phospho-Tyrosin zu imitieren, ist die genaueste Methode die Substitution von Tyr für p-Tyr-33.

    Schließlich ist der Umfang dieses Protokolls weit über Protein-Protein Wechselwirkung, weil dieses System kann, zu anderen bioaktiven Ladungen wie RNA-Sequenzen, Nanopartikel, Viren oder andere Moleküle, die mit Biotin verschmolzen und mit CPP angewendet werden studieren ausgestrahlt werden Ihre intrazellulären Wirkmechanismus.

    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Wir danken M. Morales und J. Bravo für ihre Hilfe bei der Gestaltung von CPPs und j.c. Arévalo für seine Hilfe mit dem Pull-Down-Protokoll. Wir sind dankbar für die technische Hilfeleistung des T. del Rey. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien; FEDER BFU2015-70040-R, Junta de Castilla y León, Spanien; FEDER SA026U16 und Fundación Ramón Areces. M. Jaraíz-Rodríguez und A. González-Sánchez sind Empfänger ein Stipendium von der Junta de Castilla y León und den Europäischen Sozialfonds.

    Materialien

    NameCompanyCatalog NumberComments
    G166 GSC lineBioRep
    RHB-A stem cell mediumTakaraY40001
    Laminin Mouse ProteinInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific23017-01510 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17504-0442%
    N-2 Supplement (100x)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17502-0481%
    Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-1520 ng/ml
    Recombinant Human b-FGFPeprotechAF-100-18B20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    AccutaseSigmaA6964
    Cryostor CS10 cryopreservation mediumStemCell Technologies7930
    TATGenScript-Custom made
    TAT-BGenScript-Custom made
    TAT-Cx43266-283GenScript-Custom made
    TAT-Cx43266-283-BGenScript-Custom made
    Alexa Fluor 594 PhalloidinMolecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA12757371/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibodySigma-AldrichT90261/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ AgaroseThermoFisher Scientific29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-FreeCalbiochem, Bionova5391341/100 (v/v)
    Sodium FluoridePanReac AppliChem1416751 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP76261 mM
    Sodium orthovanadateSigma-AldrichS65080.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) .1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis SystemLife Technologies, ThermoFisher ScientificWR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%Life Technologies, ThermoFisher ScientificWG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)Life Technologies, ThermoFisher ScientificNP00011X
    NuPAGE Transfer Buffer 20xLife Technologies, ThermoFisher ScientificNP00061X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes)Life Technologies, ThermoFisher ScientificIB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer deviceLife Technologies, ThermoFisher ScientificIB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in waterSigmaP7170
    FAK polyclonal rabbit antibodyLife Technologies, ThermoFisher ScientificAHO05021/500
    Src polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Csk polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)49801/500
    PTEN polyclonal mouse antibodyCell Signalling (WERFEN)95521/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibodyAbcamab29101/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibodyQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySc-20051/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibodyQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySC-20301/5000
    Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz BiotechnologySC-2048
    Src polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgGInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA110291/1000
    Cy2-conjugated streptavidinJackson ImmunoResearch016-220-0891/500
    MicroChemi Luminescence systemDNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificV132411/500
    SlowFade Gold antifade reagentLife Technologies, ThermoFisher ScientificS36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)Sigma-AldrichM2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC)Honeywell41641-1L
    Appliskan 2001Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    Referenzen

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