АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это протокол для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий, основанная на системе выпадающее биотин авидин с новинкой комбинирования последовательностей, проникая в клетки. Главным преимуществом является, что последовательности целевых объектов инкубировали с живых клеток вместо lysates клетки и поэтому взаимодействие будет происходить в пределах сотовой связи.

Аннотация

Здесь мы представляем протокол для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий, основанный на широко используемых биотин авидин выпадающее системы. Модификация представил включает в себя сочетание этой техники с последовательностями, проникая в клетки. Мы предлагаем дизайн проникает клетки приманки, которые могут быть инкубирован с живых клеток вместо lysates клетки и поэтому взаимодействия нашли будет отражать те, которые происходят в контексте внутриклеточных. Connexin43 (Cx43), белков, который образуется разрыв соединения каналов и hemichannels вниз регулируется в полноценное глиомы. Cx43 регион, включающий аминокислоты 266-283 отвечает за торможение онкогенного действия c-Src в клеток глиомы. Здесь мы используем ТАТ как последовательность, проникая в клетки, биотин как тег выпадающего и региона Cx43, между аминокислоты 266-283 как target, чтобы найти внутриклеточных взаимодействий в жестком transfect глиомы человека стволовых клеток. Один из недостатков предлагаемого метода является, что молекулы, как приманка может не сложить правильно и, следовательно, нашли взаимодействия не может быть связан с эффектом. Однако этот метод может быть особенно интересна для участвующих в сигнальных путей взаимодействия потому что они обычно проводятся по сути неупорядоченных регионам и, таким образом, они не требуют упорядоченный складывания. Кроме того одним из преимуществ предлагаемого метода является, что актуальность каждого остатка на взаимодействие можно легко изучить. Это модульная система; Таким образом могут использоваться другие последовательности, проникая в клетки, другие теги и другие внутриклеточные цели. Наконец, сфера охвата этого протокола находится далеко за пределами взаимодействия протеин протеина, потому что эта система может применяться для других биоактивных грузов таких как РНК последовательности, наночастицы, вирусы или любые молекулы, которые могут быть преобразованы с последовательностями, проникая в клетки и плавкий предохранитель в раскрывающемся списке Теги для изучения их внутриклеточный механизм действий.

Введение

Белок белковых взаимодействий важны для разнообразных клеточных процессов. Чтобы полностью понять эти процессы, требуются методы для выявления белковых взаимодействий в рамках сложных внутриклеточной среды. Один из наиболее часто используемых методов для определения взаимодействия партнеров белка является использование этого белка или подражательный пептид частью этого белка как приманку в экспериментах выпадающее сродство следуют обнаружения связывания белков. Благодаря высоким сродством, специфика и стабильного взаимодействия между авидином и биотин1,2часто используется система авидин биотин. Обычно биотин ковалентно связан приманки (белка или пептида) и после периода инкубации с lysates клетки разрешить создание взаимодействий, биотинилированным приманки, обязан ее внутриклеточного партнеров является потянул вниз с авидин или авидин производные конъюгированных с поддержкой бисером. Затем приманки белковых взаимодействий обнаруживаются после мытья, элюирование и анализа Денатурирующий электрофорез, следуют Западная помарка. Одна из проблем этой техники является, что взаимодействия протеина интереса и ее внутриклеточного партнерами проводятся за пределами сотовой связи. Это особенно важно для взаимодействия участвующих в сигнальных путей, потому что они происходят в определенных местах внутриклеточных, они являются временными, и обычно они осуществляются не обильные протеины. Таким образом в пределах lysates клетки эти взаимодействия может быть замаскирована, другие более обильные протеины или белков, которые обычно не находятся в непосредственной близости.

Ячейки проникая пептидов (ПКЮТО) являются короткие пептиды (≤40 аминокислоты), главным образом составленный Катионный аминокислоты, которые способны транспортировки широкий спектр молекул в почти любой ячейки3. Грузов, таких как белки, ДНК плазмиды, siRNA, вирусов, изображений агентов и различных наночастиц были конъюгированных CPPs и эффективно интернализированных4,5. Благодаря возможности транспортировки они также называются трансдукции доменов протеина (PTDs), мембраны translocating последовательности (MTSs) и троянских пептиды. Среди CPPs ТАТ пептид от ВИЧ transactivator белка TAT6 был одним из наиболее широко изучены 7,8,9. TAT-это nonapeptide, содержащий 6 аргинина и 2 остатков лизина и следовательно очень Катионный. Замещение исследования показали, что чистый положительный заряд ТАТ необходима для электростатического взаимодействия с плазменных мембран эукариотических клеток и его последующее интернализации10. Аналогично для других CPPs, положительно заряженных ТАТ сильно связывает электростатически различных отрицательно заряженные видов присутствующих на поверхности внеклеточного клеточных мембран, включая головной группы липидов, гликопротеинов и протеогликаны3 , 10. Биоактивный грузы, перевозимые ТАТ сразу освободится в цитозоль для достижения их внутриклеточного партнеров.

Здесь мы представляем метод, который сочетает в себе TAT CPP биотина для изучения внутриклеточных взаимодействий. Цель заключается в разработке проникает клетки приманки путем сплавления целевой биомолекулы ТАТ и биотин. Основным преимуществом этого предложения является, что взаимодействия между приманку и его партнерами будет проходить в рамках своей сотовой связи. Чтобы показать эффективность этого метода мы использовали как приманку небольшой последовательности белка Cx43, что было сообщено внутриклеточно взаимодействовать с протоонкоген c-Src11,12,13. Cx43 — интегральный мембранный белок, что широко выражается в астроциты14и вниз регулируется в полноценное глиомы, наиболее распространенных злокачественных опухолей центральной нервной системы,1516,17 ,18. Это было показано ранее, что Cx43 региона, который взаимодействует с c-Src (аминокислоты 266-283 в человека Cx43; PubMed: P17302) сливается с ТАТ (ТАТ-Cx43266-283) препятствует онкогенных активность клеток глиомы c-Srcin и глиомы стволовых клеток (GSCs)19,,2021. Дизайн внутриклеточных приманку, Cx43266-283 был снаряжен ТАТ в N-terminus (ТАТ-Cx43266-283) и биотина в C-terminus (ТАТ-Cx43266-283- B). Эта стратегия успешно используется в крыса глиомы С6 клеточной линии для идентификации Src киназы (ЦСК) c-Src, c терминала и фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN) как внутриклеточных партнеров этого региона Cx4320. Здесь мы опишем этот метод тестирования его эффективность в человека GSCs, которые являются весьма актуальными для терапии глиомы, но гораздо труднее для transfect чем глиомы не стволовых клеток.

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в университете Саламанки.

1. клетки

  1. За два дня до начала процедуры, плиты клетки на необходимые плотности быть вырожденная день эксперимента. Пластина клеток в колбах или пластины. Однако экстракции белков будет легче от плиты. Это удобно подготовить по крайней мере 4 пластины 78 см2 или 2 фляги2 150 см на условие на эксперимент, чтобы быть уверенным что результаты согласуются.
  2. В этом исследовании тарелка человека G166 GSCs в 4 колбы 150 см2, культивируемых в среде RHB-A стволовых клеток с 2% B27, 1% N2, 20 нг/мл EGF и b ФБП, как описано в Поллард et al.22. Процесс, когда слияние было достигнуто. Например при G166 5 x 106 клеток были покрытием в колбе2 150 см, они были обработаны через 2 дня после покрытия.

2. биотинилированным ПКЮТО

  1. Спиновые флаконах, содержащих лиофилизированный биотинилированным ПКЮТО (BCPPs) на g 8200 x 30 сек, чтобы избежать некоторых из порошка, оставаясь на крышке. Включите элемент управления BCPP чтобы убедиться, что взаимодействия нашли конкретной последовательности целевого объекта. В этом исследовании, управления BCPP ТАТ биотин (ТАТ-B) и лечение BCPP ТАТ-Cx43266-283- B. Другие элементы управления могут использоваться как TAT плавленого омлет или мутировавших фрагменты облигаций биотин.
  2. Растворяют BCPPs в соответствующей культуры среднесрочной Стоковый раствор, указанных заводом-изготовителем; Например чтобы получить раствор 2 мг/мл BCPP для лечения GSCs добавить 0,5 мл GSC питательной среды один флакон, содержащий 1 мг BCPP. Вортекс и убедитесь, что пептид хорошо растворяется.

3. трубы

Примечание: Подготовьте по крайней мере двенадцать 1,5 мл трубки на условие, необходимо в разделе 7.

  1. Марк первые 3 пробки в условие. Они будут иметь общий объем сотовой лизатов, полученного на шаге 6.4.
  2. Марк В 3 пробки в условие. Эти трубки будет иметь первый supernatants, полученные после лизировать и спиннинг сотовой лизатов шаг 7.2.
  3. Марк B 3 пробирки в условие. Эти трубки будет иметь небольшой Алиготе первого supernatants. Эти лизатов будет служить в качестве образцов западной помарки на шаге 7.3.
  4. Марк C 3 пробирки в условие. Эти трубки будет иметь supernatants, полученные после pull-down с NeutrAvidin, шаг 7.7.
    Примечание: Это имеет важное значение в случае, если иммуноблоттинга показал отсутствие сигнала для белков, белки не были снесены или были потеряны на некоторых этапах процедуры. Если это положение, повторите процесс тянуть вниз белки.

4. сотовый лечение с BCPPs

  1. Аспирационная питательной среды.
  2. Замените соответствующий объем свежей среды, необходимые для инкубации BCPPs в наименьший возможный объем среднего по инкубации раз. Это очень важно, что в любом случае, средство охватывает полностью всю поверхность пластины/колба так что клетки не высыхает, к примеру, 6 мл на 150 см2 для инкубации 30 мин.
  3. Добавьте объем Стоковый раствор BCPP клеточных культур для достижения концентрации, что доказано, чтобы быть эффективным. В этом исследовании по 50 мкм ТАТ-Cx43266-283- B доказано, уменьшить распространение GSC.
    1. Таким образом, 92,8 мкл 2 мг/мл ТАТ-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 г/моль) мл питательной среды для получения конечной концентрации 50 мкм ТАТ-Cx43266-283- B. Если объем добавляемого отличается для управления пептиды, в комплекте с питательной среды до же конечный объем. К примеру, 49,1 мкл ТАТ-B (МВт = 1914.31 г/моль) плюс 43.7 среднего GSC мкл были добавлены на мл питательной среды для получения конечной концентрации 50 мкм ТАТ-B.
  4. Место клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 за 30 минут, чтобы убедиться, что взаимодействия между BCPP и ее внутриклеточного партнеров занять место. Если взаимодействие занимает больше времени, Проинкубируйте больше времени или настроить раз в случае, если эксперимент состоял из времени курс. Кроме того взаимодействие интерес может быть повышен или предотвратить путем стимулирования различных внутриклеточных сигнальных путей.

5. буферов и решения.

  1. Подготовить PBS рН 7,4: 136 мм NaCl; 2,7 мм KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 мм х2PO4.
  2. Подготовка буфера lysis белка: 20 мм трис-HCl (рН 8,0), 137 NaCl, 1% IGEPAL, предварительного использовать, добавьте следующее: 1/100 (v/v) ингибитор протеазы коктейль, 1 мм фторид натрия, 1 мм Phenylmethanesulfonyl фторид (PMSF) и Ортованадат натрия 0,1 мм.
  3. Подготовить буфер Лэмли: (4 x: 0,18 М трис-HCl pH 6.8; 5 M глицерина; 3,7% SDS (p/v); 0,6 М β-меркаптоэтанол или 9 мм DTT; 0,04% (v/v) бромфеноловый синий (BB)).

6. белка добычу

Примечание: Белка Экстракцию проводили как описано в20,23. Выполнять этот целый раздел процедуры на 4 ° C.

  1. Аспирационная питательной среды полностью.
  2. Мыть 3 x 10 мл с ледяной фосфат буфер солевой раствор (PBS) за 150 см2 очень тщательно избежать мобильный отряд.
  3. Чтобы получить lysate клетки, добавить 3 мл буфера lysis за 150 см2 и тщательно очистите поверхность с помощью скребка ячейки. Наклона пластины/колба около 45 градусов будет сделать легче собрать lysates клетки в их соответствующие трубы.
  4. Наливайте 1 мл сотовых lysate за трубу в трех 1.5 мл пробирок. Эти трубы будут отмечены состояние и повторить, как указано в шаге 3.1.

7. pull-down

  1. Центрифуга для 1.5 мл пробирок на 11000 x g 10 мин при 4 ° C.
  2. Передать supernatants новые трубы (A).
  3. Принять Алиготе этой супернатант за состояние различных труб (B), то есть 50 мкл в трубку. Добавьте 4 x Laemmli буфера (16,6 мкл для 50 мкл lysate) и заморозить при температуре-20 ° C. Эти лизатов будет служить как обычно иммуноблоттинга образцы.
  4. Однородный очень хорошо NeutrAvidin агарозы мягкий встряхивания. Вырежьте советы наконечники для повышения их диаметр и закупорить бисер.
Добавьте 50 мкл NeutrAvidin агарозы мл ячейки lysate в тюбиках (A).
  • Инкубируйте на 4 ° C на ночь с очень мягкий встряхивания разрешить NeutrAvidin взаимодействовать с BCPPs, обязан их внутриклеточного партнеров.
  • Центрифуга на 3000 x g 1 мин при температуре 4 ° C для сбора комплекс NeutrAvidin с белками.
  • Осторожно удалите supernatants и передавать их на чистой трубок (C). Держите их использовать их в случае, если выпадающее не успешным.
  • Стиральная шаги: добавить свежие литического буфера в гранулы (трубы A), Ресуспензируйте инверсии и повторите шаги 7.6) и 7.7) в 5 раз больше. Все эти supernatants может быть удален.
  • Удаление supernatants и добавить 2 x Laemmli буфер в нужный конечный объем (40 мкл на 1,5 мл трубки для окатыши, полученные из 150 см2 фляги вырожденная клеток).
  • Элюировать при 100 ° C на 5 минут, чтобы отделить взаимодействия белков и центрифуги для 30 s на 8200 x g Пелле NeutrAvidin бусины.
  • Возьмите supernatants, содержащий диссоциированных белков, с капиллярной советы для новых труб (D). Бисер может храниться в случае повторения элюции шаги требуется.
    Примечание: Supernatants (трубы D) теперь готовы для загрузки в западной помарке или заморозить при температуре-20 ° C.

    • 8. Западная помарка

    Примечание: Западный blotting была выполнена как описано24.

    1. Загрузить эквивалентный объем каждого образца в Лейн на бис-трис (4-12%) midigels в системе электрофореза Midi-Cell.
    2. Transblot белки с помощью сухого слоя ватмановской системы в регулярные стек нитроцеллюлозы.
    3. Пятно мембраны с 10% Понсо за 10 мин.
    4. Вымойте мембраны 3 x 5 мин с 5 мл TTBS.
    5. Блокировать мембраны с 7% молока в TTBS за 1 ч с нежным тряски в трубы или небольшие коробки. Убедитесь, что объем используется достаточно для покрытия мембраны и что они не сухие, т.е. 40 мл в целом midi мембраны.
    6. Вымойте 3 x 5 мин с 5 мл TTBS.
    7. Инкубируйте на ночь при 4 ° C с основное антитело против протеина интереса с нежным встряхивания.
    8. Вымойте 3 x 5 мин с 5 мл TTBS.
    9. Проинкубируйте мембрану при комнатной температуре с корреспондентских конъюгированных с пероксидазой вторичное антитело в TTBS за 1 час.
    10. Вымойте 3 x 5 мин с 5 мл TTBS.
    11. Разработка с Хемилюминесцентный субстрат в системе хемилюминесценции.

    9. решение проблем

    1. Если после разработки западной помарке любого из образцов показал отсутствие сигнала на всех для белков, проверьте Понсо.
      Примечание: Мембрану в Понсо должен показать неопределенным и многочисленных полос вдоль полосы загрузки. Если не очень заметны полосы, количество белков загрузки не может быть достаточно или передача может пошли неправильно. Рассмотрим, повторяя западную помарку.
    2. Если есть не пятно на всех в Понсо мембрану в любом Лейн, повторите всю процедуру от шага 7.4 трубок (C).
    3. Если после разработки Западная помарка белков сигнал очень слабый, но Понсо показан белки, снова Проинкубируйте мембрану с основного антитела на длительное время. Если сигнал все еще довольно слаба, снова инкубации при комнатной температуре.

    10. другие методы, используемые в этой статье

    1. Immunocytochemistry BCPPs
      1. Исправьте клетки в параформальдегида 4% (0,2 мл / см2) 20 мин.
      2. Вымойте 3 x 5 мин с PBS (0.2 мл / см2).
      3. Применять соответствующие антитела (по крайней мере 0,15 мл / см2), разбавленный раствор антител на производителя показанную концентрацию против вашего протеина интереса на ночь при 4 ° C.
      4. Проинкубируйте с конъюгированных Флюорофор вторичное антитело (0,15 мл / см2) за 2 ч при комнатной температуре.
      5. Повторите шаги 10.1.2-10.1.4 с другими антителами против ваших протеинов интереса. Будьте осторожны, чтобы не использовать те же виды для различных первичных антител или же волны флуорофоров для вторичных антител.
      6. Смонтируйте клетки, с помощью antifade реагента (0,005 мл / см2).
      7. Анализировать на микроскопе флуоресценции, подключенных к цифровой фотоаппарат.
    2. MTT пробирного
      1. Культура клетки при 37 ° C в 24-ну пластины.
      2. Инкубируйте клетки в темноте для 75 мин с 0,15 мл питательной среды на см2 , содержащий 0,5 мг/мл МТТ.
      3. Аспирационная среднего и инкубировать и клетки для 10 минут в темноте с диметилсульфоксида (0,25 мл / см2) с мягкий встряхивания.
      4. Измерять поглощение на длине волны 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов.

    Результаты

    Перед использованием BCPPs для изучения внутриклеточного взаимодействия, важно сравнить эффекты BCPP против CPP для проверки результатов, полученных с BCPP. Следовательно, для изучения ли включение биотина изменяет действие последовательности целевых объектов, мы сначала проанализировал влияние ТАТ-Cx43266-283- B по сравнению с266-283 ТАТ-Cx43 на G166 GSCs морфологии. Чтобы сделать это, мы провели некоторые иммунофлюоресценции анализ двух белков цитоскелета, F-актина и α-тубулина после 24 часов лечения. Рисунок 1 показывает, что G166 GSCs в присутствии 50 мкм ТАТ-Cx43266-283 или ТАТ-Cx43266-283- B приобретать более округлой формы, по сравнению с удлиненные и расширенной сотовой продолжений, показано в элементах управления (зуб или ТАТ-B). В самом деле, на рисунке 1b показывает, что филаментов актина основном собраны как актин сети, когда клетки обрабатывали ТАТ-Cx43266-283 или ТАТ-Cx43266-283- B, пока они образуют более актина связки в ячейках элемента управления (с ТАТ или TAT-B)25. В противоположность этому α-тубулина распределения не изменяются между различных условий. Эти результаты показали, что присутствие биотина не изменять действие последовательности целевых объектов на словотолковании G166 GSCs. В предыдущих исследованиях20,21мы показали, что ТАТ-Cx43266-283 уменьшили распространение G166 GSCs. В этом исследовании, мы исследовали ли ТАТ-Cx43266-283- B оказывает тот же эффект в росте как ТАТ-Cx43266-283. Чтобы сделать это, мы проанализировали G166 GSCs распространения путем анализа МТТ после 72 ч лечения. MTT assay является колориметрического анализа для оценки метаболической активности клеток. MTT метаболизируется ферментами Оксидоредуктазы H NAD (P) в митохондриях, отражающие количество жизнеспособных клеток. Рисунок 2 показывает, что снижение жизнеспособности клеток G166 GSCs не значительно отличается когда клетки обрабатывали 50 мкм ТАТ-Cx43266-283 или 50 мкм ТАТ-Cx43266-283- B. Действительно оба значительно уменьшились G166 GSCs распространения по сравнению с элемента управления, ТАТ или ТАТ-B.

    После того как мы подтвердили, что эффект нашей последовательности целевых объектов в G166 GSCs (ТАТ-Cx43266-283) не было изменено путем включения биотина в C-terminus (ТАТ-Cx43266-283- B), мы исследовали внутриклеточных партнеров этой последовательности После протокола описаны в этом исследовании (рис. 3). Потому что Кавеола участвовали в механизме ТАТ интернализации26, мы проанализировали присутствие Кавеолин-1 (Cav-1) в тянуть Даунс. Западный анализ помаркой (рис. 4) показал, что ТАТ-B и ТАТ-Cx43266-283- B взаимодействовать с Cav-1. Однако способность ТАТ-Cx43266-283- B призывать c-Src, PTEN и CSK сильнее, чем с ТАТ-B. Киназы фокуса адгезии (ФСП) является субстрат c-Src, что не было показано, чтобы взаимодействовать с Cx43. Действительно, ФСП не показывают каких-либо существенного взаимодействия с ТАТ-B или ТАТ-Cx43266-283- B.

    Для подтверждения взаимодействие между ТАТ-Cx43266-283- B и c-Src, G166 GSCs инкубировали с 50 мкм ТАТ-Cx43266-283- B для 30 мин и их локализация последовал с флуоресцентные стрептавидина confocal микроскопии (Рисунок 5 ). Наши результаты показали, что внутриклеточного распределения ТАТ-Cx43266-283- B близка к плазматической мембраны (показано путем пятнать фосфатидилсерина) и совпадает с этим из c-Src. В самом деле, Сопредседатель локализации анализы показали некоторые моменты, Сопредседатель локализации (белый) между ТАТ-Cx43266-283- B и c-Src в изображении слияния. Следовательно confocal микроскопии исследования подтверждают результаты, полученные с протоколом тянуть вниз BCPP, описанные в данном исследовании.

    figure-results-4371
    Рисунок 1: Влияние BCPP и CPP на GSC морфологии.
    G166 GSCs были покрытием на низкой плотности (2 x 104 клеток / cm2) и после 24 часов, они были инкубировали с 50 мкм управления CPP (ТАТ), контролировать BCPP (ТАТ-B), лечение CPP (ТАТ-Cx43266-283) или лечение BCPP (ТАТ-Cx43266-283- B) . ) F-актина (красный), α-тубулина (зеленый) и Объединенные + DAPI иммуноокрашивания же поля показаны морфология G166 GSCs. Бары = 50 µm. b) F-актина иммуноокрашивания показаны различные распределения F-актина в G166 GSCs после инкубации в течение 24 ч с 50 мкм управления КПП (ТАТ) или управления BCPP (ТАТ-B) по сравнению с 50 мкм лечения CPP (ТАТ-Cx43266-283) или BCPP (ТАТ-Cx43 266-283-B). Бары = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-5461
    Рисунок 2: Влияние BCPP и CPP на жизнеспособность GSC.
    G166 GSCs были покрытием на 5500 клеток/см2 в 24-multiwell пластины и инкубировали с 50 мкм управления пептиды, CPP (ТАТ) или BCPP (ТАТ-B), или 50 мкм лечения пептиды, CPP (ТАТ-Cx43266-283) или BCPP (ТАТ-Cx43266-283- B). Жизнеспособность клеток была проанализирована с помощью MTT пробирного после 72 ч. Результаты выражаются в виде МТТ absorbances и среднее ± s.e.m. по крайней мере 3 экспериментов (++ p˂0.01 против управления. ** p˂0.01, *** p˂0.001 против ТАТ или ТАТ-B; одностороннюю после теста ANOVA withTukey). Обратите внимание, что не существуют значительные различия между последствиями ПКЮТО против BCPPs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-6497
    Рисунок 3: Протокол диаграмма.
    Шаг за шагом графическое описание процедуры как описано в разделе «Протокол», от инкубации BCPPs до тех пор, пока их взаимодействия белков и eluted BCPPs были obtained.1) Инкубируйте культуры клеток с BCPPs в нужной концентрации для требуемое время. 2) во время инкубации внутреннюю BCPPs и они взаимодействуют с их внутриклеточного партнеров. 3) Вымойте клетки три раза на льду с ледяной PBS. 4) Лизируйте клетки для извлечения белков. 5) передавать lysates клетки трубы.6) спина на 11000 x g 10 мин при 4 ° C. 7) передача, которую supernatants новые трубы (A) и сохранить небольшой Алиготе лизатов для обработки как очередной западной помарки образцов в метро (B). 8) Ресуспензируйте бусы NeutrAvidin агарозы и добавьте 50 мкл в каждую пробирку, используя кончик отрезока пипеткой. 9) Инкубируйте с нежно встряхивания в течение 12 ч при 4 ° C, чтобы позволить агарозы бусы NeutrAvidin взаимодействовать с BCPPs и их партнеров. 10) спин 1 мин на 3000 x g Пелле бусины с биотинилированным приманки и их взаимодействия белков привязан к ним. 11) передать supernatants новых трубок (C) и сохранить их для использования в случае, если выпадающее необходимо будет повторить. 12) помыть лепешка пять раз с свежими литического буфера, Ресуспензируйте инверсии, спина за 1 мин на 3000 x g и удалить супернатант. 13) тщательно удалите супернатант. 14) добавить желаемый объем 4 x буфер Лэмли и элюировать белков при 100 ° C за 5 минут 15) спина на 8200 x g 30 s для пеллет бисер. 16) передача eluted белков, обнаруженных в надосадке с капиллярной советы для новых труб (D). 17) загрузить гели для Западный анализ помаркой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-8508
    Рисунок 4: Изучение внутриклеточных взаимодействий ТАТ-Cx43266-283- B в G166 GSCs в раскрывающемся списке следуют Западная помарка.
    G166 GSCs инкубировали с 50 мкм ТАТ-B или ТАТ-Cx43266-283- B. После 30 мин, которые были лизированы клетки и ТАТ-B или ТАТ-Cx43266-283- B, придает их внутриклеточного партнеров были снесены с NeutrAvidin бисером. Eluted белки были загружены и анализирует западную помарку для изучения уровней фак, c-Src, ЦСК, PTEN и Cav-1. Обратите внимание, что Cav-1 взаимодействует с обеих ТАТ-B и ТАТ-Cx43266-283- B, c-Src, PTEN и CSK преференциально взаимодействуют с ТАТ-Cx43266-283- B и фак не показывают какого-либо взаимодействия с ТАТ-B или ТАТ-Cx43266-283-б. пожалуйста Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-9589
    Рисунок 5: Подтверждение ТАТ-Cx43266-283- B внутриклеточных взаимодействий в G166 GSCs на confocal микроскопии.
    G166 GSCs инкубировали с 50 мкм ТАТ-Cx43266-283- B. После 30 мин, клетки были фиксированной и обрабатываются для локализации ТАТ-Cx43266-283- B с Cy2-стрептавидина (зеленый), c-Src иммунофлюоресценции (красный) и фосфатидилсерина с annexin V (синий). Обратите внимание, некоторые моменты, Сопредседатель локализации (белый) между ТАТ-Cx43266-283- B и c-Src близко к плазматической мембране в слияния изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Обсуждение

    Есть много методов для изучения взаимодействия протеин протеина. Метод, представленный в настоящем исследовании основана на широко используемых биотин авидин выпадающее системы, в котором биотинилированным приманку инкубировали с lysates клетки разрешить создание взаимодействий. Изменения, представленные в настоящем исследовании включает в себя сочетание этой техники с последовательностями, проникая в клетки. Мы предлагаем дизайн проникает клетки приманки, которые могут быть инкубирован с живых клеток вместо lysates клетки и поэтому взаимодействия нашли будет отражать те, которые произошли в пределах сотовой связи.

    Здесь мы используем ТАТ как последовательность, проникая в клетки, биотин как тег выпадающего и региона Cx43, между аминокислоты 266-283 как target, чтобы найти внутриклеточных взаимодействий в человека GSCs. Структурной основой для взаимодействия между Cx43 и c-Src-хорошо известно11,12. Это важное взаимодействие, потому что он подавляет онкогенных активность c-Src в клетки глиомы24,13. В самом деле CPPs, содержащие этот регион (ТАТ-Cx43266-283) имитировать antioncogenic свойства Cx43 глиомы клетки19,,2021. В клетках С6 глиомы крысы механизм, по которому ТАТ-Cx43266-283 подавляет c-Src включает набор c-Src вместе с его эндогенные ингибиторы ЦСК и PTEN20. Следует отметить, что GSCs очень интересно, как целевой объект в терапии глиомы, потому что они представляют собой субпопуляции, устойчивы к стандартным способам лечения и поэтому отвечает за повторения этого мозг злокачественных опухолей27. Кроме того они трудно transfect клеток и поэтому исследования внутриклеточных взаимодействий становится более сложным. ПКЮТО быстро и эффективно внедрено в GSCs19 в пользу их использования для изучения внутриклеточных взаимодействий. В это исследование, используя ПКЮТО сливается с биотина мы подтверждаем взаимодействия Cx43266-283 последовательности с c-Src вместе с его эндогенных ингибиторов ЦСК и PTEN в человека GSCs.

    Этот метод является очень мощным, чтобы изучить внутриклеточный механизм биоактивных соединений. Однако очень важно подтвердить, что биологический эффект биотинилированным клеток проникающего приманки не отличается от полученных с не биотинилированным, один. Этот шаг необходим для связи взаимодействия, нашел с эффектом биоактивные соединения. Кроме того стабильность соединения, его возможной деградации протеаз, а также его возможную токсичность, следует тщательно проверены и приняты во внимание до планирования эксперимента. В этом примере представлены анти Пролиферативная эффект ТАТ-Cx43266-283 на G166 человека GSCs был ранее документально20. В этом исследовании, мы подтверждаем, что анти Пролиферативная эффект ТАТ-Cx43266-283- B и ТАТ-Cx43266-283 является очень похожи. Кроме того, анализ клеточной морфологии показал, что α-тубулина и распределения F-актина очень похож на G166 GSCs, относились с ТАТ-Cx43266-283- B или с ТАТ-Cx43266-283. Вообще эти результаты показывают, что включение биотина в c-terminus ТАТ-Cx43266-283 не изменить последствия этого соединения на человека GSCs. Однако если биотина бы изменить эффекты биологически активные молекулы, другие теги для очищение протеина могут быть проверены, как флаг octapeptide (DYKDDDDK)28, человеческого гриппа гемагглютинин, полученных тег га (YPYDVPDYA) или глутатион S-трансферазы (GST)29. Аналогично Если зуб не целевой популяции клеток интерес, другие клетки проникающего последовательности, такие как penetratin, MPG (для обзора, см30) или специфические последовательности ячеек может быть используемые31.

    Помимо исследования белков, которые непосредственно взаимодействуют с последовательности целевых объектов в идеале должно быть наличие белков, которые взаимодействуют с элементом управления и последовательности целевых объектов и белков, которые не взаимодействуют с ними, как позитивные и негативные элементы, рассмотрены. В этом смысле мы нашли Cav-1 в элементе управления и рассматриваются ситуации, предполагая, что Кавеола были вовлечены в механизме интернализации, как это ранее было показано26. Кроме того, отсутствовал фак, который взаимодействует с c-Src, но не предполагается взаимодействовать с Cx43 c терминала, как управления, так и обработанные ситуации. Эти результаты подтверждают специфики взаимодействия между ТАТ-Cx43266-283- Б, c-Src, ЦСК и PTEN. Чтобы подтвердить результаты, полученные с настоящим Протоколом, конфокальная микроскопия может использоваться для визуализации распределения взаимодействия белков и изучения их совместного локализации. Таким образом мы обнаружили, что ТАТ-Cx43266-283- B и c-Src экспонат аналогичные внутриклеточного распределения с некоторыми пунктами Сопредседатель локализации, подтверждающие результаты, полученные с раскрывающемся экспериментов. В самом деле, ТАТ-Cx43266-283- B распределяется близко к плазматической мембране, предполагая, что груз, в этом исследовании Cx43266-283, направляет молекулы внутриклеточных партнерам.

    Один из недостатков предлагаемого метода является, что молекулы, как приманка может не правильно складывать и ожидаемый эффект не будет найдено. В этой ситуации нашли взаимодействия не может быть связано с эффектом. Однако этот метод может быть особенно интересна для участвующих в сигнальных путей взаимодействия потому, что они обычно осуществляется по сути неупорядоченных регионов32 и поэтому они не требуют упорядоченный складывания. Кроме того одним из преимуществ предлагаемого метода является, что время курс взаимодействия может следовать, что особенно актуально для переходных взаимодействий. Кроме того актуальность каждого остатка на взаимодействия могут быть легко изучены. Действительно это возможно для изучения актуальность Посттрансляционная модификаций на взаимодействия протеин протеина, например, путем замены phosphomimetic глутамата Серина или треонин. Аналогичным образом замена Серина или треонин аланина или тирозина для фенилаланина позволяет тестирование эффект не phosphorylatable Серин, треонин или тирозин.Чтобы имитировать фосфо тирозин, наиболее точным способом является замена Tyr для p-Tyr33.

    Наконец сфера охвата этого протокола находится далеко за пределами взаимодействия протеин протеина, потому что эта система может применяться для других биоактивных грузов таких как РНК последовательности, наночастицы, вирусов или других молекул, которые могут быть слиты биотина и преобразованы с CPP учиться их внутриклеточный механизм действий.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Мы благодарим м. Моралес и J. Браво за их помощь с дизайном CPPs и J.C. Аревало за его помощь в раскрывающемся списке протокол. Мы благодарны за технической помощи т.-дель-Рей. Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию, Испания; ФЕДЕР BFU2015-70040-R, хунта-де-Кастилья и Леон, Испания; ФЕДЕР SA026U16 и Фонд Ramón Аресес. М. Хараис-Родригес и а. Гонсалес Санчес являются получателями стипендий от Junta de Castilla y León и Европейского социального фонда.

    Материалы

    NameCompanyCatalog NumberComments
    G166 GSC lineBioRep
    RHB-A stem cell mediumTakaraY40001
    Laminin Mouse ProteinInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific23017-01510 µg/ml
    B-27 Serum free Supplement (50X)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17504-0442%
    N-2 Supplement (100x)Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific17502-0481%
    Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-1520 ng/ml
    Recombinant Human b-FGFPeprotechAF-100-18B20 ng/ml
    PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4·2H2O ; 1.7 mM KH2PO4
    AccutaseSigmaA6964
    Cryostor CS10 cryopreservation mediumStemCell Technologies7930
    TATGenScript-Custom made
    TAT-BGenScript-Custom made
    TAT-Cx43266-283GenScript-Custom made
    TAT-Cx43266-283-BGenScript-Custom made
    Alexa Fluor 594 PhalloidinMolecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA12757371/20
    Monoclonal α-tubulin mouse antibodySigma-AldrichT90261/500
    4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific1.25 mg/ml
    Pierce™ NeutrAvidin™ AgaroseThermoFisher Scientific29200
    Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA
    Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-FreeCalbiochem, Bionova5391341/100 (v/v)
    Sodium FluoridePanReac AppliChem1416751 mM
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP76261 mM
    Sodium orthovanadateSigma-AldrichS65080.1 mM
    Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M β-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) .1X
    Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis SystemLife Technologies, ThermoFisher ScientificWR0100
    NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%Life Technologies, ThermoFisher ScientificWG1402box
    NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)Life Technologies, ThermoFisher ScientificNP00011X
    NuPAGE Transfer Buffer 20xLife Technologies, ThermoFisher ScientificNP00061X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
    iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes)Life Technologies, ThermoFisher ScientificIB23001
    iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer deviceLife Technologies, ThermoFisher ScientificIB21001
    10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in waterSigmaP7170
    FAK polyclonal rabbit antibodyLife Technologies, ThermoFisher ScientificAHO05021/500
    Src polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Csk polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)49801/500
    PTEN polyclonal mouse antibodyCell Signalling (WERFEN)95521/500
    Caveolin-1 polyclonal rabbit antibodyAbcamab29101/1000
    Goat anti-mouse IgG-HRP antibodyQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySc-20051/5000
    Goat anti-rabbit IgG-HRP antibodyQuimigen, Santa Cruz BiotechnologySC-20301/5000
    Western Blotting Luminol ReagentSanta Cruz BiotechnologySC-2048
    Src polyclonal rabbit antibodyCell Signalling (WERFEN)2108S1/500
    Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide
    Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgGInvitrogen, Life Technologies, ThermoFisher ScientificA110291/1000
    Cy2-conjugated streptavidinJackson ImmunoResearch016-220-0891/500
    MicroChemi Luminescence systemDNA Bio-Imaging Systems
    Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor® 488 & Propidium Iodide (PI)Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher ScientificV132411/500
    SlowFade Gold antifade reagentLife Technologies, ThermoFisher ScientificS36936
    Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)Sigma-AldrichM2128
    Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, >=99.8% (GC)Honeywell41641-1L
    Appliskan 2001Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific

    Ссылки

    1. Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem J. 89, 599-609 (1963).
    2. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 184, 14-45 (1990).
    3. Herce, H. D., Garcia, A. E., Cardoso, M. C. Fundamental molecular mechanism for the cellular uptake of guanidinium-rich molecules. J Am Chem Soc. 136 (50), 17459-17467 (2014).
    4. Ramsey, J. D., Flynn, N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol Ther. 154, 78-86 (2015).
    5. Fominaya, J., Bravo, J., Rebollo, A. Strategies to stabilize cell penetrating peptides for in vivo applications. Ther Deliv. 6 (10), 1171-1194 (2015).
    6. Vives, E., Brodin, P., Lebleu, B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem. 272 (25), 16010-16017 (1997).
    7. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
    8. Brooks, H., Lebleu, B., Vives, E. Tat peptide-mediated cellular delivery: back to basics. Adv Drug Deliv Rev. 57 (4), 559-577 (2005).
    9. Cuesto, G., et al. Phosphoinositide-3-kinase activation controls synaptogenesis and spinogenesis in hippocampal neurons. J Neurosci. 31 (8), 2721-2733 (2011).
    10. Schmidt, N., Mishra, A., Lai, G. H., Wong, G. C. Arginine-rich cell-penetrating peptides. FEBS Lett. 584 (9), 1806-1813 (2010).
    11. Sorgen, P. L., et al. Structural changes in the carboxyl terminus of the gap junction protein connexin43 indicates signaling between binding domains for c-Src and zonula occludens-1. J Biol Chem. 279 (52), 54695-54701 (2004).
    12. Giepmans, B. N., Hengeveld, T., Postma, F. R., Moolenaar, W. H. Interaction of c-Src with gap junction protein connexin-43. Role in the regulation of cell-cell communication. J Biol Chem. 276 (11), 8544-8549 (2001).
    13. Tabernero, A., Gangoso, E., Jaraíz-Rodríguez, M., Medina, J. M. The role of connexin43-Src interaction in astrocytomas: A molecular puzzle. Neuroscience. 323, 183-194 (2016).
    14. Giaume, C., Koulakoff, A., Roux, L., Holcman, D., Rouach, N. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions. Nat Rev Neurosci. 11 (2), 87-99 (2010).
    15. Shinoura, N., et al. Protein and messenger RNA expression of connexin43 in astrocytomas: implications in brain tumor gene therapy. J Neurosurg. 84, 839-845 (1996).
    16. Soroceanu, L., Manning, T., Sontheimer, H. Reduced expression of connexin-43 and functional gap junction coupling in human gliomas. Glia. 33, 107-117 (2001).
    17. Pu, P., Xia, Z., Yu, S., Huang, Q. Altered expression of Cx43 in astrocytic tumors. Clin Neurol Neurosurg. 107 (1), 49-54 (2004).
    18. Crespin, S., et al. Expression of a gap junction protein, connexin43, in a large panel of human gliomas: new insights. Cancer Med. 5 (8), 1742-1752 (2016).
    19. Gangoso, E., Thirant, C., Chneiweiss, H., Medina, J. M., Tabernero, A. A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype. Cell Death & Disease. 5, (2014).
    20. Gonzalez-Sanchez, A., et al. Connexin43 recruits PTEN and Csk to inhibit c-Src activity in glioma cells and astrocytes. Oncotarget. 7 (31), 49819-49833 (2016).
    21. Jaraíz-Rodríguez, M., et al. A short region of connexin43 reduces human glioma stem cell migration, invasion and survival through Src, PTEN and FAK. Stem Cell Reports. , (2017).
    22. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
    23. Yu, T., et al. In vivo regulation of NGF-mediated functions by Nedd4-2 ubiquitination of TrkA. J Neurosci. 34 (17), 6098-6106 (2014).
    24. Herrero-Gonzalez, S., et al. Connexin43 inhibits the oncogenic activity of c-Src in C6 glioma cells. Oncogene. 29 (42), 5712-5723 (2010).
    25. Cooper, G. M. . The Cell: A Molecular Approach. , (2000).
    26. Fittipaldi, A., et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem. 278 (36), 34141-34149 (2003).
    27. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol Oncol. 4 (5), 420-430 (2010).
    28. Hopp, T. P., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Nat Biotech. 6 (10), 1204-1210 (1988).
    29. Benard, V., Bokoch, G. M. Assay of Cdc42, Rac, and Rho GTPase activation by affinity methods. Methods Enzymol. 345, 349-359 (2002).
    30. Guidotti, G., Brambilla, L., Rossi, D. Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics. Trends Pharmacol Sci. 38 (4), 406-424 (2017).
    31. Hu, Q., et al. Glioma therapy using tumor homing and penetrating peptide-functionalized PEG-PLA nanoparticles loaded with paclitaxel. Biomaterials. 34 (22), 5640-5650 (2013).
    32. Babu, M. M., van der Lee, R., de Groot, N. S., Gsponer, J. Intrinsically disordered proteins: regulation and disease. Curr Opin Struct Biol. 21 (3), 432-440 (2011).
    33. Anthis, N. J., et al. Beta integrin tyrosine phosphorylation is a conserved mechanism for regulating talin-induced integrin activation. J Biol Chem. 284 (52), 36700-36710 (2009).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

    Запросить разрешение

    Смотреть дополнительные статьи

    130Pull downIntracellular

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

    РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

    НОВОСТИ JoVE

    Исследования

    Образование

    АВТОРЫ

    Библиотекарь

    О JoVE

    Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены