Probiotische Studien an neugeborenen Mäusen mit Magensonde

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt den Prozess der Gavaging genauen Mengen von Probiotika mit Neugeborenen Mäusen. Der Versuchsaufbau wurde optimiert, um gehören aber nicht beschränkt auf probiotische Dosierung, Methoden der Verwaltung und Quantifizierung der Bakterien im Darm.

Zusammenfassung

Erwachsenen Maus-Modellen haben am meisten benutzt, um den Mechanismus hinter der Progression der Erkrankung beim Menschen verstehen. Die Anwendbarkeit der Studien bei Erwachsenen Mausmodellen für neonatale Krankheiten beschränkt. Zum besseren Verständnis der Krankheitsprogression, Host Antworten und langfristige Auswirkungen von Interventionen beim Neugeborenen ist eine neonatale Mausmodell wahrscheinlich besser geeignet. Die spärliche Verwendung von Neugeborenen Maus-Modellen kann die technischen Schwierigkeiten der Arbeit mit diesen kleinen Tieren teilweise zugeschrieben werden. Einem Neugeborenen Maus-Modell wurde entwickelt, zu bestimmen, die Auswirkungen der probiotischen Verabreichung in den ersten Lebensjahren und speziell die Möglichkeit zur Besiedlung in den Neugeborenen Maus-Darm-Trakt Einrichtung beurteilen. Insbesondere wurde um probiotische Kolonisation in der Neugeborenen Maus zu beurteilen, Lactobacillus Plantarum (LP) direkt in den Gastrointestinaltrakt Neugeborenen Maus geliefert. Zu diesem Zweck wurde LP Mäuse durch die Fütterung durch Intra-und Speiseröhrenkrebs (IE) Magensonde verabreicht. Eine hoch reproduzierbare Methode wurde entwickelt, um den Prozess des IE Magensonde zu standardisieren, die eine genaue Verwaltung von probiotischen Dosierungen bei gleichzeitiger Minimierung der Trauma, ein Aspekt besonders wichtig angesichts der Fragilität des neugeborenen Mäusen ermöglicht. Einschränkungen dieses Prozesses umfassen Möglichkeiten der ösophageale Reizung oder Schaden und streben, wenn gavaged nicht falsch. Dieser Ansatz entspricht einer Verbesserung auf aktuelle Praktiken, weil IE Magensonde in der distalen Speiseröhre die Chancen der Aspiration verringert. Nach Magensonde wurde die Besiedlung Profil der probiotischen verfolgt LP spezifische Primer quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Darm extrahierte DNA mit. Verschiedene Wurf Einstellungen und Käfig-Techniken wurden verwendet, um das Potenzial für Kolonisation verbreitete bewerten. Das Protokoll beschreibt die Feinheiten des IE Neugeborenen Maus Magensonde und nachfolgende Besiedlung Quantifizierung mit LP.

Einleitung

Bei Säuglingen wurde frühen probiotische Exposition mit immunmodulatorischen Effekten führt zu reduzierter Inzidenz von Krankheiten wie nekrotisierende Enterokolitis, atopische Dermatitis und Sepsis^{1,2,3, 4 , 5}. jedoch der Mechanismus hinter dieser immunmodulatorische Reaktion ist eine Herausforderung, erkunden angesichts der Begrenzung zum Sampling in Neugeborenen Studien am Menschen (d.h., sequentielle Blut zieht und Biopsien). Neonatale Mausmodellen können helfen, den Wirkmechanismus von Neugeborenen Immunregulation Verbindung mit probiotischen Nutzung und Änderungen in der intestinalen Mikrobiota beteiligt zu studieren. Leider haben die meisten Mausmodelle für Probiotika weitgehend auf Erwachsenen Mäusen konzentriert; die Wirkung von Probiotika ist jedoch wahrscheinlich höchsten früh im Leben, was darauf hindeutet, dass Modelle speziell für diese Altersgruppe werden nützliche^3,6. Darüber hinaus eignen sich Neugeborenen Maus-Modellen besser zu studieren, Krankheiten und Interventionen für Anwendung in den ersten Lebensjahren von menschlichen Säuglingen gedacht, da sie voraussichtlich stärker entwickelnden immun- und mikrobielle System^{7,8 imitieren ,9,10}. Ziel war es, das Ausmaß und die Muster von probiotischen Besiedlung des Neugeborenen Mäuse mit einem Fokus auf die mechanistische Interaktion zwischen dem Host und seine Mikrobiom zu studieren. Passende Beschreibungen der Neugeborenen Modelle in der Literatur nicht gefunden wurden, und daher eine Notwendigkeit für die Entwicklung von robusten und standardisierte Methode behandelt wurde.

Bewährte Methoden der oralen Verabreichung verschiedener Verbindungen, Neugeborene Mäuse gehören mütterlichen Übertragung der gewünschten Verbindungen durch Milch durch Behandlung von der Wasserquelle für Schwangere Dämme¹¹ oder Fütterung Nadeln um die Verwaltung zu erleichtern gewünschten Verbindungen in den Mund-Rachenraum¹². Diese Methoden eignen sich für Experimente, die präzise Dosierungsanforderungen haben und wo wird die Behandlung ohne weiteres von der Empfänger Maus aufgenommen. Probiotika sind oft verabreicht, in Verbindung mit einem Präbiotikum wie Galactooligosaccharide und Fructooligosaccharide (FOS), die als Nahrungsquelle für probiotische Bakterien dienen; Diese additive Verbindungen machen die Lösung Viskose und schwierig zu verwalten über die oben genannten Methoden. Entwicklung einer Methode zum Verwalten von genauer Mengen von Probiotika und Prebiotika, Neugeborene Mäuse beginnen bereits am ersten Tag des Lebens (DOL) notwendig war. Bei der Entwicklung der Magensonde Technik, die Möglichkeit der Kolonisation verbreitete (wie in anderen probiotischen Studien zwischen der Behandlung und der Arme^13,14,15,16) wurde getestet und die relative Häufigkeit der kolonisierten Lactobacillus Plantarum (LP) im Darm der Welpen mit verschiedenen Magensonde Zeitpläne bewertet wurde. In den Experimenten verwendeten probiotische-Präparat bestand aus 10⁹ Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Magensonde LP (ATCC-202195-Stamm), gemischt mit FOS (Präbiotikum) und Maltodextrin (Hilfsstoff), wie in den letzten menschlichen Studie³beschrieben. Die probiotische Lieferung erfolgte mit IE Magensonde und der Prozess ist ausführlich im Protokoll unten. Die Kolonisation-Profil der probiotischen war mit Echtzeit Amplifikation von DNA extrahiert aus dem gesamten Darm mit spezifischen Primer LP ausgewertet.

Protokoll

Alle Verfahren wurden im Zusammenhang mit den Richtlinien der Support-Mitarbeiter bei der Animal Care Facility an der University of British Columbia durchgeführt und alle Verfahren wurden von der UBC Animal Care Committee genehmigt.

1. Quantifizierung von Probiotika verabreicht

Hinweis: Dieser Schritt wird empfohlen, den genauen Betrag der probiotischen KBE bestimmen, die in einer einzigen Dosis verabreicht werden kann. Die Menge von Probiotika und Fahrzeug (FOS und Maltodextrin) bestimmen die Sättigung Bedingungen der Lösung. Aus Erfahrung kann nicht mehr als 30 µL (~ 20 mL / kg) der Flüssigkeit Mäuse auf DOL 2 verabreicht werden wie jeder größere Lautstärke Aspirationsrisiko erhöht.

1. Verdünnungsreihen bereiten Sie sechs 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit jedem Röhrchen mit 180 µL steriler 5 % Traubenzucker Kochsalzlösung vor.
2. Wiegen ein 0,2 g aliquoten eine probiotische Präbiotikum Mischung und in 1 mL 5 % Traubenzucker Kochsalzlösung in einer sterilen Weise auflösen.
3. Vortex für 30 Sekunden und Pipette, um Klumpen zu brechen. Wiederholen Sie, bis keine sichtbaren Klumpen eingehalten werden.
   Hinweis: Maltodextrin, macht die Lösung Viskose und tragen zur Lösung Sättigung.
4. Führen Sie eine serielle Verdünnung mit Röhren im Schritt 1.1 vorbereitet. Vortex mischen.
5. 40 µL jeder Verdünnung auf einem markierten Quadranten der MRS-Agar-Platte-Platte. Platte jeder Verdünnung in zweifacher Ausfertigung.
6. Inkubieren Sie unter anaeroben (oder mikroaerophil) Bedingungen bei 37 ° C für 48 h in einem Vakuum Glas mit einem Gas-Pack.
7. Zählen Sie jede Platte in einem Umkreis von 20-70 Kolonien pro Quadrant. Durchschnittliche Platte verfügt über die gleichen Verdünnung und zurück auf die gewünschten Einheiten berechnen.

2. Vorbereitung von Probiotika und Prebiotika Magensonde

Hinweis: Die korrekte Auflösung der probiotische und präbiotische ist notwendig, die glatte Injektion von Flüssigkeit durch die Fütterung Nadel während Magensonde zu gewährleisten.

1. Kombinieren Sie die erforderliche Menge an gefriergetrockneten probiotische Organismus mit den gewünschten Mengen von Präbiotika und Fahrzeug in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch.
2. Fügen Sie entsprechende Mengen an Lösungsmittel (5 % Traubenzucker Kochsalzlösung) die probiotischen Präbiotikum Mischung auflösen.
   Hinweis: Die Kapazität der Auflösung ist begrenzt durch die prebiotische und Fahrzeug verwendet. Aus Erfahrung erreicht die Synbiotic Kombination (mit FOS und Maltodextrin) Sättigung bei ca. 0,3 g/mL bei der Auflösung in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL Lösungsmittel.
3. Wirbel, mischen, bis alle Feststoffe aufgelöst werden. Verwenden Sie ein Pipettieren aufzubrechen Globuli von festen Partikeln in das Lösungsmittel durch Pipettieren rauf und runter.
4. Inkubieren Sie die Lösung im Wasserbad 37 ° C für 20 min.
   Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die probiotischen Präbiotikum Lösung aus eine lebendige Kultur angelegt wird.
5. Platte eine fünf Reihe 10-divisibel Verdünnung auf MRS Agarplatten vor Magensonde, die probiotische genau zu quantifizieren, die Welpen verabreicht. Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die genaue Anzahl der KBE nicht benötigt wird.

3. Vorbereitung der Biosicherheit Kabinett

1. Verwenden Sie eine biologische Kabinett bei der Arbeit mit Probiotika um aseptische Technik beizubehalten. Legen Sie den Käfig mit Dämmen und Welpen auf eine Heizdecke (eingestellt auf ca. 38 ° C) auf einer Hälfte der Decke. Stellen Sie eine saubere, leere Tierkäfig auf die andere Hälfte das Wärme-Unterbett.
2. Statt einer desinfizierten oder sterilen, saugfähige pad auf das Wärme-Unterbett, um die Maus während der Magensonde neigen.
3. Sammeln Sie Nistmaterial für die Welpen von der Spitze des bestehenden, Damm geschaffene Nest zu und erstellen Sie eine neue konische Verschachtelung Tasse mit behandschuhten Händen, mit 70 % igem Ethanol desinfiziert und getrocknet. Platzieren Sie dieses neue Nest in den Käfig sauber, leere Holding. Dies erleichtert die Übertragung von dem Duft des Nestes zu den behandschuhten Händen und minimiert so die Einführung der anderen Düfte auf die Welpen beim Umgang mit ihnen für das Verfahren, Verringerung des Risikos von Kannibalisierung.
4. Verschieben Sie die Welpen in das konische Nest Käfig halten und entfernen Sie den Käfig mit dem Staudamm aus dem Schrank zu. Dies verringert den Stress für den Damm um verhindern, dass es die Welpen während des Verfahrens zu hören.
   Hinweis: Wenn die Probiotika eine bekannte Kolonisator des murinen Darms ist, müssen die Behandlungsbedingungen durch Käfige oder auch verschiedene biologische Sicherheit Schränke um die Möglichkeit der Kolonisation zu vermeiden getrennt werden.

(4) Intra-und Speiseröhrenkrebs Magensonde des Neugeborenen Maus

1. Öffnen Sie die Spritze Verpackung für einfachen Zugang. Öffnen Sie die Verpackung der Nadel auf sterile Weise und befestigen Sie es an die Spitze der Spritze. Waschen Sie die Nadel mit 70 % Ethanol und Autoklaven vor dem Eingriff. Verwenden Sie verschiedene Arten von Nadeln für die Behandlung und der Kontrollgruppe um Verunreinigungen zu vermeiden.
2. Ziehen Sie ein wenig mehr als die gewünschte Menge an probiotischen Farbstofflösung in die Spritze. Halten Sie die Spritze nach oben. Dann ziehen Sie weiter nach unten und streichen Sie mit dem Finger, um Luftblasen zu entfernen und drücken Sie auf den Kolben, Bubbles und die extra Flüssigkeitsvolumen zu vertreiben, bis die gewünschte Lautstärke erreicht ist. Dadurch gibt es keine Luftraum in der Nadel. DOL-2-Maus muss das Volumen der Magensonde 30 µL nicht überschreiten.
3. Ort der Welpe auf das sterile Saugkissen am Anfang das Heizkissen. Benutzen Sie die Fütterung Nadel (24 Gauge, 1" Nadel Länge, 1,25 mm Kugeldurchmesser) nach außen, um die Länge der Speiseröhre zu messen, indem man den Ball von der Nadel direkt unter dem Xiphoid Prozeß (untere Ende des Brustbeins). Markieren Sie die Nadel auf der Ebene des Mauls, beachten die Grenze der Einfügung der Nadel (Abbildung 1). Beobachten Sie die Welpen nach Gesundheit Zeichen, darunter regelmäßige Atmung und rosa Färbung der Haut.
4. Tauchen Sie die Spitze der Nadel in das Tauchbecken Lösungsmittel (5 % Traubenzucker Kochsalzlösung oder -das Medium verwendet, um die probiotischen auflösen und Pre-biotische), die Außenflächen der Fütterung Nadel zu schmieren. Dies ermöglicht die reibungslose Aufnahme der Nadel in die Speiseröhre der Maus.
5. Heben Sie den Welpen durch das Genick oder sanft hält Kopf und Körper zwischen Daumen und Zeigefinger. Sorgen für Kopf, Hals und Körper in einer geraden Position gehalten werden. Halten Sie nicht die Welpen durch das Genick für länger als 60 s als dort besteht die Gefahr der Obstruktion der Trachea zur Erstickung führen. Stellen Sie sicher, dass der Welpe atmen kann. Anzeichen für eine scruffen zu hart zählen Unfähigkeit zu atmen, bedeutende keuchend und die Zunge im Mund ausgefahren. Überwachen der Welpe Farbe und Atmung während des gesamten Verfahrens.
6. Legen Sie die Glühbirne der Nadel in die Mitte des Mundes des Welpen in einem 45° Winkel zur Ebene des Torsos, bis sie die Rückseite der Kehle erreicht.
7. Ändern Sie den Winkel der Nadel sanft durch Schwenken auf die Glühbirne der Nadel und verschieben die Spritze weg von der Gavaging Person (auf der dorsalen Seite des Welpen) bis es ist parallel zur Ebene der Wirbelsäule die Pup. Scruffen der Welpe hilft, die Nadel im Ort auf der Rückseite der Kehle und verhindert auch, dass die Maus windet. Stellen Sie sicher der Ball der Nadel nicht voraus oder üben Sie keinen Druck gegen die Rückseite der Kehle, während die Winkeländerung.
8. Wenn die Maus versucht, die Nadel zu schlucken, lassen Sie es auf natürliche Weise nach unten schieben und die Bewegung zu verhaften, wenn die Kennzeichnung auf der Nadel mit der Schnauze richtet. Die Spritze und Nadel sind in der Regel schwer genug, um Rutschen Due die Schwerkraft. Support für das Gewicht der Nadel zu allen Zeiten, so dass die Nadel leicht gleitet hinunter den Ösophagus mit keinen Druck von der Person, die die Magensonde.
   1. Erfüllt die Nadel Widerstand auf der Rückseite der Kehle, zurückziehen der Magensonde Nadel leicht, den Ball von der Nadel und neu Winkel zu verdrängen die Nadel im Mund nach links von der Maus (Handler rechts) langsam in kleinen, 1 mm-Schritten. Die Nadel sollte beginnen, die Speiseröhre leicht rutschen.
   2. Wenn die Nadel stoppt, bevor die Markierung auf der Nadel den Mund erreicht, injizieren Sie die Lösung nicht.
   3. Halten Sie nicht die Nadel für mehr als 20 s. In diesem Fall zurückziehen die Nadel langsam unter Beibehaltung der Spritze parallel zu den Torso und lassen Sie den Welpen ruhen auf dem Papierhandtuch für 30 s bis 1 min. versuchen Gavaging wieder schmieren die Außenfläche der Nadel mit dem Lösungsmittel.
      Hinweis: Anästhesie wird nicht für das Verfahren verwendet, da die Maus Reaktion notwendig, um den Erfolg der Magensonde zu messen ist.
9. Wenn die Markierung auf die Fütterung Nadel befindet sich über der Schnauze und an der Spitze der Schnauze ausgerichtet, lassen Sie nicht die Nadel bewegen oder irgendwelche weiter. Das gewünschte Volumen der Flüssigkeit langsam zu injizieren. Wenn die Flüssigkeit abgesaugt oder, um die Blase durch die Nase beobachtet, die Injektion sofort anhalten und langsam zurückziehen der Nadelöhrs.
   1. Stellen Sie die Pup aufrecht auf dem Papierhandtuch auf das Akku-Heizkissen um seine Genesung zu unterstützen. Aufmerksam verfolgen, für anhaltende Atemprobleme oder Veränderung der Farbe des Welpen, der Aspiration angibt. Einschläfern Sie Welpen, die sofort abgesaugt haben.
10. Nach Abschluss der Magensonde zurückziehen Sie sanft die Fütterung Nadel unter dem gleichen Winkel war, den es eingefügt. Ort der Welpe auf dem Papierhandtuch auf das gewärmte Heizkissen. Warten 10 s für die Welpen zu normaler Aktivität und Atmung wieder zu erlangen. Eine gesunde rosa Färbung sollte über die Pup Körper erscheinen und der Farbstoff sollte nur dann sichtbar, in der Magen-Fach. Zurück in den Käfig mit den anderen Welpen.
    Hinweis: Gavaging blaue Lebensmittelfarbe ist eine hervorragende Möglichkeit, die oben beschriebene Verfahren zu üben. Wenn die Magensonde erfolgreich ist, wird der Magen der Maus als einem blauen Farbton angezeigt. Blaue Farbstoff außerhalb der Bauch des Welpen (Hals, Brust oder axillären Region) gefunden wird, sollte das Tier artgerecht (in Übereinstimmung mit der Tierpflege-Regeln), eingeschläfert werden, da dies eine Ruptur des Ösophagus oder Aspiration zeigt.

(5) Sammlung von Intestional Proben für die Kolonisation Analyse

1. Während nachfolgende Überwachung oder Gavaging Sammle fäkale Microbiome Proben von Welpen.
   Hinweis: Der Welpe häufig uriniert und kotet, wenn gavaged und diesmal einsetzbar als Gelegenheit, um die fäkalen Proben für die Analyse Mikrobiom zu sammeln.
2. Für die Beendigung der Experimente sammeln Sie den Darm von Zwölffingerdarm Rektum nach Euthanasie der Welpen. Der Welpe zu einem chirurgischen Board stecken und desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol. Schneiden Sie die Haut in vier Quadranten ohne Beschädigung der peritonealen Schicht mit Werkzeugen mit 70 % Ethanol und eine heiße Perle Sterilisation bei 250 ° c sterilisiert
3. Verwenden Sie einen anderen Satz von sterilen Werkzeuge, das Peritoneum in vier Quadranten schneiden und verschieben Sie es weg von der Mitte in einer Weise, dass die viszeralen Organe ausgesetzt sind.
4. Suchen Sie den Magen und mithilfe einer Klemme unter den Pylorussphinkter und am Ende des Mastdarms Prise. Führen Sie die Länge des Darms mit einem stumpfen Werkzeug oder Zange zur Straffung der Darm und befreien es von Bindegewebe und mesenterialen Gewebe. Sobald die gesamte Länge des Darms von Bindegewebe befreit wurde, schneiden Sie an den eingespannten enden.
5. Markieren Sie die Aluminiumfolie mit der Ausrichtung des Darms, wickeln Sie auf sichere Weise und Einfrieren bei-80 ° C.
   Hinweis: Die DNA-Extraktionsverfahren kann durchgeführt werden an dieser Stelle ohne Einfrieren. Blaue Farbstoff galt auch den Darm über 24 h durchlaufen und Entnahme von Proben für Kolonisation Analyse am besten ist, wenn der Darm mindestens 24 Stunden gesammelt werden nach der letzten Magensonde. Signale können vor diesem Timepoint bakteriell das nicht eingehalten, die vorübergehend durch die Magensonde Mischung verstärkt.

6. DNA-Extraktion aus dem Darm zur Kolonisierung Analyse

Hinweis: Die DNA-Extraktion erfolgt mithilfe eines kommerziellen Kits mit Änderungen des Protokolls für den Darm DNA-Extraktion zu optimieren. Stellen Sie sicher das Heizgerät ist die gewünschte Temperatur einstellen und die Lösungen, die Veränderungen oder Vorwärmen benötigen entsprechend vorbereitet sind.

1. Die enzymatische Lyse Puffer (ELB) wie folgt vorbereiten: machen Sie eine Lösung mit 20 mM Tris-Cl, 2 mM Natrium EDTA und 1,2 % Triton x-100. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0. Fügen Sie unmittelbar vor Verwendung von ELB, Lysozym, eine Endkonzentration von 20 mg/mL.
2. Pre-belasten Sie Granat Perlen Röhrchen Analysenwaage mit den Kappen entfernt.
   Hinweis: Dies geschieht so, dass wenn die erforderliche Gewicht überschritten ist, es einfacher ist, den Darminhalt zu entfernen.
3. Schneiden Sie den Darm in kleine Segmente mit einem sterilen Einweg Skalpell und Schaufel die gewünschten Segmente in die vorgewogene Granat Perlen Röhrchen.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, Skalpelle zwischen jeder Probe zu ändern, wie DNA allgegenwärtig ist und PCR-Ergebnisse beeinflussen kann.
4. Fügen Sie 1 mL der ELB mit Lysozym (aus Schritt 6.1) für jedes Rohr auf vortexen Wulst Schläger und bei maximaler Einstellung (14) 5 Minuten laufen lassen.
5. Sobald das Gewebe gestört ist, übertragen Sie die Rohre auf 37° C-Wasserbad und inkubieren Sie für 30 Minuten.
   Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um Lysozym zu aktivieren und den Abbau der Zellwand Peptidoglycan von Gram-positiven Bakterien induzieren.
6. Jede Probe in einer Konzentration von 600 mAU pro mL Röhrchen mit 20 µL Proteinase K vorbereiten.
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 X g für 10 Minuten. Die lysate sollte klar mit einige Gewebe Rückstand auf die Perlen aussehen.
8. Übertragen Sie 180 µL des Überstandes (die obere Phase) in ein Röhrchen mit Proteinase K und dann das Rohr 200 µL des AL-Puffers hinzu. Wirbel für 15 s zu mischen.
9. Legen Sie Röhren auf dem Heizblock bei 56 ° C für 10 Minuten.
10. Das Rohr 200 µL 100 % Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen für 15 s.
11. Ca. 600 µL lysate (aus Kit) auf die Spin-Spalte hinzufügen.
12. Zentrifuge für 1 Minute bei 8.000 X g. Durchströmung zu verwerfen.
13. Wiederholen Sie Schritt 6.12 bis alle lysate wurde durch die Spalte gezogen.
14. Setzen Sie die Säule in einer neuen Kollektion-Röhre. Fügen Sie 500 µL Buffer AW1 und Zentrifuge bei 8.000 X g für 1 Minute.
15. Die Durchströmung zu verwerfen. Fügen Sie 500 µL Buffer AW2 und Zentrifuge bei 8.000 X g für 3 min.
16. Die Durchströmung zu verwerfen und die Spalte in eine leere Auflistung Röhre bei 8.000 X g für 3 min zentrifugieren.
17. Übertragen Sie die Spalte auf DNA Elution Rohr. 60 µL des PCR-Grade ultrareinem Wasser direkt auf die Membran hinzufügen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
18. Verwenden Sie das Wasser vorgewärmt Elution bei 37 ° C zu eluieren. Die Elution kann erfolgen zweimal mit halber Lautstärke die endgültige Elution und wiederholen Schritt 6.15 zweimal, den Ertrag zu steigern.
19. Zentrifuge für 1 Minute bei 8.000 X g , DNA zu eluieren.
20. Messen der Konzentration der DNA mit der gewünschten Quantifizierungsmethode eluiert. Die Gewinnung Prozess Erträge liegen im Bereich von 10-40 ng/µL DNA.
21. Speichern der eluierten DNS bei-20 ° C.

(7) qPCR-setup

1. PCR-Zustände
   1. Die Maschine schalten Sie ein und laden Sie das Programm in der Tabelle 1 in eine Echtzeit-qPCR-Maschine.
   2. Durchlaufen Sie Schritte 3 bis 5 in Tabelle 1 für 40 Zyklen und halten Sie die Probe bei 4 ° C am Ende der Reaktion.
2. PCR Versuchsaufbau
   1. Verwenden Sie den Primer und die Temperatur in Tabelle 2gefunden. Verwenden Sie die Konzentrationen und Reaktionsbedingungen, die in Tabelle 3gefunden. Jede Reaktion in dreifacher Ausfertigung zu steuern für prozedurale Variante eingerichtet.
3. Legen Sie die PCR Reaktion Schläuche/Platte in das qPCR-System und der Ausführung des Programms in das System von Schritt 7.1 geladen.
4. Das Rohr am Ende des Laufs zu entfernen, legen Sie es auf 4 ° C und bereiten für Gel geladen.

(8) Quantifizierung der LP Kolonisation

1. 10 µL oder 20 µL Reaktionen nach Tabelle 3qPCR Mischungen vorbereiten.
2. LP genomische DNA Standardkurve 10⁷ bis 10¹ Kopien/µL
   Hinweis: Da 4 µL jeder Verdünnung überzogen sein wird, 10⁷ Exemplare in 4 µL oder 2,5 x 10⁶ Exemplare pro Mikroliter ist erforderlich in den ab Lager. Verwenden Sie das gleiche Prinzip für den Rest der Kurve.
   1. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:4:10⁷ Exemplare pro Mikroliter in 50 µL.
      3.147 µL LPDNA + 46.85 µL dH₂O = 2,5 x 10⁶ Stück pro Mikroliter
   2. Seriell 10-fach verdünnen: 45 µL dH₂O für 1,25 x 10⁵ Kopien/µL 5 µL hinzufügen.
   3. Platte 4 µL pro Verdünnung pro Bohrloch.
3. Visualisierung von LP Amplifikate
   1. Eine 2 % Agarosegel verwenden, um eine klare Trennung von erreichen die ~ 197 bp LP verstärkte Fragment.
   2. Laden Sie 9 µL der einzelnen PCR-Produkte in das Gel.
   3. Führen Sie das Gel für 30 Minuten bei 120 V.

Ergebnisse

Die Einzigartigkeit dieses Verfahrens liegt in seiner Anpassung an die Gavaging-Technik, um die Größe und Zerbrechlichkeit einer Neugeborenen Maus. Im vorherige Abschnitt beschrieben die wichtigen Schritte bei der Durchführung einer erfolgreichen Magensonde Verfahren auf Mausklick DOL 2. Um eine gute Quantifizierung Maßstab herzustellen, wurde eine Standardkurve generiert mit reinen LP DNA mit drei technischen Wiederholungen (Abbildung 2). Die Standardkurve bereitgestellt einen Dynamikbereich von Erkennung von der LP-DNA mit Primer. Der Dynamikumfang war zwischen 7 und 28 Zyklen, wo eine Reihe von 10¹ bis 10⁷ Exemplare der LP DNA erkannt wurde. Die stetige Steigung der Standardkurve vertreten die Effizienz und Skalierbarkeit der Reaktion.

Das Verfahren der IE Magensonde wurde bei Erwachsenen Mäusen mit relativer Leichtigkeit eingesetzt. Jedoch die obere Gastrointestinaltrakt einer Neugeborenen Maus ist zerbrechlich und erforderlichen kalibrierte Bewegungen von der Magensonde Nadel während des Verfahrens. Wiederholte Gavages könnte die Chancen von Intra-und Speiseröhrenkrebs Reizungen, Verletzungen und Versagen oder Ablehnung durch den Damm durch das Handling erhöhen. So, zwei verschiedene Gavaging Zeitpläne wurden getestet und die intestinale Kolonisation wurde mit der DNA von ganzen Darm Homogenates quantifiziert. Mäuse waren gavaged von DOL 2 bis DOL 8 mit probiotischen verwaltet jeden Tag oder alle zwei Tage (Abbildung 3). Jede Probe enthielt eine technische replizieren und jede Bedingung hatte mindestens zwei biologische repliziert. Die Welpen gavaged hatten jeden Tag mit 7 Dosen rund 10³ Kopien von LP, während die Welpen gavaged alle zwei Tage mit 4 Dosen rund 10⁵ Exemplare hatten. Die Konsistenz der Ergebnisse zwischen den Wiederholungen Guthaben an die Präzision der Technik. Es gab mehr LP im Darm des Welpen gavaged alle zwei Tage im Vergleich zu den Welpen, die gavaged jeden Tag wurden erkannt. Angesichts dieser wurden nachfolgende Experimente mit einer Magensonde Zeitplan für jeden zweiten Tag eingerichtet, wie es auch die Belastung für die Welpen reduziert.

Es ist wichtig zu vermeiden, Intra-Wurf probiotische Kreuzkontaminationen bei der Arbeit mit Probiotika. Das Mikrobiom von Wurfgeschwistern erwartete ähnlich zu sein, da sie die gleiche Mutter und Verschachtelung Umwelt teilen. Dies beweist ein Problem für probiotische Studien, wenn die Behandlung und Kontrolle Bedingungen innerhalb der gleichen Wurf anwesend waren, wie die probiotischen Organismus das Potenzial hat, ein Bestandteil der Mikrobiota ("Kolonisation zu verbreiten"). Um festzustellen, ob ein Probiotikum unbehandelte Wurfgeschwistern zu kolonisieren und verunreinigen, die Hälfte eines Wurfes war gavaged als oben und den Darm für qPCR gesammelt wurden. Intestinale qPCR Analyse von DOL 10 Mäusen zeigte erwartete Verstärkung des LP-DNA in die gavaged Mäuse, aber auch in geringerem Maße in den nicht-gavaged Wurfgeschwistern (Abbildung 4). Der Darm der gleichen DOL Mäuse aus einer unbehandelten Käfig zeigte keine Verstärkung oder minimale Verstärkung bei Zyklen größer als 32. Dies stellte Beweis für den gemeinsamen Austausch von Microbiome innerhalb einen Wurf in einem Käfig. Daher sollte für Experimente mit Probiotika die Behandlungsgruppen durch Käfige zu steuern für Variabilität durch Kreuzkontamination getrennt werden. Die Verwendung von foster Dämmen kann betrachtet werden, wenn ein Experiment innerhalb eingerichtet werden soll ein Wurf-Einstellung, aber verwirrende Effekte wie verminderte Versorgung von der Pflegefamilie Staumauer und Ablehnung sollten ausgewertet und optimiert für. Wenn Mäuse gavaged bis DOL 8 blieben für sechs Tage unbehandelt und die intestinale DNA wurde bei DOL 14 analysiert, fanden sich etwa 10 Exemplare des LP (Abbildung 5). So, die Besiedlung der LP wurde festgestellt, dass vorübergehend und nachweisbare Bevölkerung im Laufe der Zeit vermindert.

Abbildung 1 . Messung der Länge zwischen dem Xiphoid-Prozess (unteres Ende des Brustbeins) und die Schnauze, maximale Aufnahme Kennzeichnung für die Nadel zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . Standardkurve über LP Grundierungen und ATCC LP DNA hergestellt. Eine serielle Verdünnung der ATCC LP DNA wurde nachweisbaren Dynamikbereich für die in der Studie verwendeten Primer zu etablieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . LP-Verstärkung der intestinalen DNA aus DOL 10 Welpen behandelt DOL 2 bis DOL 8 geplanten Gavages täglich (7 Dosen) und jeden zweiten Tag (4 Dosen). Gavaging jeden zweiten Tag zeigten höhere Darm LP im Vergleich zu Gavaging jeden Tag. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . LP-Verstärkung der intestinalen DNA aus DOL 10 Welpen mit 2 behandelten und 2 unbehandelt in einem Wurf von 4 Welpen. Die Magensonde wurde zwischen DOL 2 und DOL 8 im geplanten Gavages täglich (7 Dosen). Die zwei Probiotika behandelt Welpen zeigen die erwartete Verstärkung-Profil. Die unbehandelten Welpen zeigen Variable Verstärkung der LP angibt, kommunale Teilen des probiotischen Organismus innerhalb eines Wurfes. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 . LP-Verstärkung der intestinalen DNA aus DOL 14 Welpen behandelt DOL 2 bis DOL 8 geplanten Gavages täglich (7 Dosen) und jeden zweiten Tag (4 Dosen). Die LP Last Tropfen unten Zyklus 28 anzeigenden Clearance von LP im Laufe von 6 Tagen post letzte probiotische Magensonde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Schritt	Temperatur	Zeit
1	50 ° C	2 Minuten
2	95 ° C	3 Minuten
3	95 ° C	30 Sekunden
4	58 ° C	30 Sekunden
5	72 ° C	30 Sekunden

Tabelle 1. qPCR Verstärkung Bedingungen. Die Temperatur und Anzahl der Zyklus-Bedingungen für die PCR-Reaktion.

Ziel	16-23 s intergenetischer Spacer region
Erwarteten Fragmentgröße	144 bp
Zündkapsel Tm	58˚C
Forward Primer (FP)	LPN-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT
Rückwärts-Primer (RP)	LPN-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA

Tabelle 2: Details zu Komponenten der qPCR Reaktion. Details zu den Primern, deren Anlasstemperatur und erwarteten Fragmentgröße in der PCR-Reaktion.

	Konzentration	10 µL Reaktion	20 µL Reaktion
Schablone DNA	200 Pg/µL	1 ΜL	1 ΜL
SYBR Master Mix	-	5 ΜL	10 ΜL
FP	10 ΜM	0,3 ΜL	0,6 ΜL
RP	10 ΜM	0,3 ΜL	0,6 ΜL
dH2O	-	3.4 ΜL	8.8 ΜL

Tabelle 3. Pro Reaktion Volumen und Konzentrationen. Die Konzentration von Reagenzien und Volumina für Reaktionen.

Diskussion

Das Verfahren der IE Magensonde wurde entwickelt, um sicher zu eine bestimmte Dosis ein Probiotikum mit Neugeborenen Mäusen verwalten. Geringe Mengen an Flüssigkeit liefern wir zu den oberen Gastrointestinaltrakt mit einer Fütterung Nadel um zu streben und gleichzeitig die Lieferung der Dosierung in Vertrauen zu verhindern. Der Darm der Mäuse wurden zur Kolonisierung Analyse zwei und sechs Tage post Magensonde. Das Verfahren zur DNA-Extraktion wurde modifiziert, um hohe Ausbeute an probiotischen grampositive Organismus zu gewährleisten. Die qPCR-Analyse der DNA extrahiert zwei Tage Post letzte Magensonde zeigte relativ höheren Besiedlung der LP bei Mäusen gavaged alle zwei Tage im Vergleich zu Mäusen gavaged täglich zwischen DOL 2-8. Gab es auch eine Abnahme der Menge an LP über sechs Tage, zeigt diese probiotischen eine transiente Organismus in den Darm der Maus sein. Die Ergebnisse dieser Experimente schaffen die Bedingungen zu forschen mit hoher Härte in dieser Altersgruppe.

Um die langfristigen Wirkungen der Probiotika bei neugeborenen Mäusen zu beobachten, war es Neugeborene Mäuse auf DOL 2 verabreicht; verweisen Sie eine ähnliche Startzeit auf die Studie am Menschen. Oropharyngealen Fütterung von neugeborenen Mäusen ist bisher in der Literatur beschrieben und hat erst nach DOL 5-8^12,17 durchgeführt worden, wenn das Risiko der Aspiration durch ein gut ausgebautes schlucken Mechanik geringer ist. Oropharyngealen Fütterung ist jedoch nicht gut geeignet für DOL 2 Mäuse, wie höhere Preise der Aspiration in der Pilotstudie (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurden. Viskose Natur der probiotische und präbiotische Lösung hinzugefügt, um das Risiko einer Aspiration. Nach dem IE Gavaging Verfahren minimiert die Gefahr der Aspiration in DOL 2 Mäuse und liefert die gewünschte Lautstärke direkt an den oberen Magen-Darm-Trakt. Der Erfolg des Verfahrens wurde zuerst mit Lebensmittelfarbe infundiert probiotische Magensonde validiert. Die Lebensmittelfarbe fungiert als ein Symbol, das sich durch die Haut des Welpen sichtbar. Keine negativen Effekte wurden beobachtet bei Mäusen gavaged mit Lebensmittelfarbe, und es wird empfohlen, das Gavaging-Verfahren in dieser Weise vor Beginn der großen Experimente zu überprüfen. Die schnelle Lösung von keuchenden reflex gesehen Post Magensonde dient auch als ein zusätzlicher Indikator für eine erfolgreiche Magensonde. Wenn erst einmal die Maus auf das Wärme-Unterbett ist Post-Magensonde keuchende Reflex wird nachlassen und eine Erhöhung der Atemfrequenz innerhalb von 20 Sekunden eingehalten werden. Die Fortsetzung der keuchenden Reflex für länger als 30 Sekunden zeigt eine fehlgeschlagene Magensonde. Erfolgreiche Magensonde hängt auch von entsprechenden Einfügung der Fütterung Nadel mit der Glühbirne sitzt direkt über der Öffnung der kardiale Schließmuskel des Magens. Dies kann erleichtert werden, indem sichergestellt wird, dass die Markierung auf die Nadel, die Messung der Länge zwischen dem Xiphoid-Prozess und der Spitze der Schnauze geht nicht vorbei an der Schnauze der Maus während der Magensonde. Dies minimiert die Verletzungsgefahr für die Maus. Die Häufigkeit der Magensonde haben einen erheblichen Einfluss auf den experimentellen Ergebnissen. Häufige Gavaging kann auch mehr Stress für die Welpen und die Mutter durch ständige Störung von den Käfig und das Nest erstellen. Der optimale Magensonde Zeitplan ist wenn die Gavages zur geringsten Häufigkeit sind und über eine kürzere Zeitdauer ohne die erwartete Wirkung im System. Zur Gewährleistung der Sicherheit und die Sterilität des Verfahrens die Magensonde muss Nadel durch Waschen und Autoklavieren dazwischen Verwendung sterilisiert werden. Waschen rigoros auf außen mit einem Peeling und innen durch zwingt Wasser durch die Nadel mit einer Spritze, bevor Autoklavieren notwendig ist wie alle übrig gebliebenen Partikel auf der Nadel beim Autoklavieren sterben können und mit dem Gavaging-Verfahren beeinträchtigen können.

Höhere LP Kolonisation verzeichneten Welpen, die gavaged wurden jeden zweiten Tag im Vergleich zu gavaged Welpen jeden Tag. Dies kann durch die geringere Belastung auf Welpen gavaged jeden zweiten Tag und potenziell die probiotischen immer mehr Nährstoffe durch die relativ mehr Milch von diesen Welpen aufgenommen sein. Die Dosisabhängigkeit der probiotische Behandlung wurde zuvor in Maus-Modelle^18,19 untersucht und damit die Verwaltung der richtige Dosierung ist wichtig. Die probiotische Lösung bereit ist vor jeder Magensonde, eine genaue Zählung der KBE verabreicht bekommen plattiert. Wenn der probiotischen Organismus anaerobe ist, ist es wichtig zu sehen, ob es Unterschied in KBE wenn aerob oder anaerob kultiviert. Da LP ein fakultativ Anaerobe ist, es war kultiviert, mit beiden Methoden und keinen Unterschied in der KBE wurde beobachtet.

Die Post Magensonde Darm LP Lastanalyse erfolgte mit qPCR und qualitativ hochwertige DNA-Proben. Zur Minimierung von LP DNA-Kontaminationen zwischen der Behandlung und den Kontrollgruppen wurden unterschiedliche Fütterung Nadeln, Biosafety Schränke und chirurgische Geräte zur gewährleisten höchste Qualitätsproben. Die genaue Messung der probiotischen im Darm benötigt eine optimierte Methode der DNA-Extraktion. Die effizienteste Methoden für die Extraktion von DNA aus Hocker beinhaltet mehrere Perle schlagen Schritte^20,21,22. Diese Methode wurde für die Gewinnung von Darmbakterien mit Wulst schlagen verabschiedet und verminderte Darstellung beobachtet (< 10² Exemplare erholt) LP in den gesamten Darm DNA-Extraktion. Als LP ein Gram positive Organismus mit einer erheblichen Menge an Peptidoglycane in der Zellwand ist, wurde das Protokoll mit einem Peptidoglycan Auflösung Schritt mit Lysozym^23,24 hinzugefügt, um die enzymatische Lyse Puffer optimiert. Durch mehr als das Doppelte erhöht dies die Darstellung der LP in der gleichen Darm Probe. Die Lysozym-Behandlung sorgt für die Auflösung der äußeren Schicht, während die Wulst Schritt gegen die lyse des Organismus ermöglicht. Optimierung der Menge des Gewebes, die Art der Granat Perlen und die Dauer der Störung mit den Perlen ist notwendig, um optimale DNA-Produkte um die PCR-Analyse durchzuführen.

Die positive Wirkung von Probiotika verabreicht als Prophylaxe oder Behandlung in der vor- und Laufzeit Neugeborenen zeigt sich in den letzten Studien^25,26,27,28. Die Einrichtung von einem richtigen Neugeborenen Maus-Modell für Probiotika ist gerechtfertigt, die schützende Wirkung von Probiotika zu entpacken. Dieses Protokoll hier skizzierten stellt einen Leitfaden für Forscher nicht vertraut mit Arbeit mit Neugeborenen Mäusen mit Probiotika. Trotz der Probleme mit Nagetier Mikrobiota während seines Studiums der menschlichen Gesundheit und Krankheit kann diese Methode für die Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Änderungen des Mikrobiom durch Probiotika erweitert werden. Dieses Modell bietet auch eine Plattform, um Host-Mikroben-Interaktion und Immunreaktionen im Laufe der verschiedenen Entwicklungsphasen zu studieren.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe with slip tip	BD	309659
1.2% Triton X-100	Millipore-Sigma	X100-100ML
2 mM sodium EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
20 mM Tris·Cl	Thermo Fisher Scientific	15568025
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution	Baxter Corp.	JB1064
Alphaimager	Alpha Innotech	N/A	Gel imaging system
Anaerobic jar	Millipore-Sigma	28029-1EA-F	2.5 L
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets	BD	260678
BD Difco Lactobacilli MRS Broth	BD	288130
Disruptor Genie	Scientific Industries Inc.	SI-D236
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats	Cadence Science Inc.	01-290-1	24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter
Fructooligosaccharides	Millipore-Sigma	F8052	from chicory
Garnet bead tubes 0.70 mm	Qiagen	13123-50
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	172-5120
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al.	ATCC	BAA-793	for qPCR standard curve
Lyophilized probiotic bacteria	N/A	N/A
Lysozyme	Thermo Fisher Scientific	89833
Maltodextrin	Millipore-Sigma	419672	dextrose equivalent 4.0-7.0
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	1704406	Gel chamber
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	N/A
QIAamp Blood and Tissue kit	Qiagen	51504
StepOnePlus Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376600
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Ultrapure dH2O	Invitrogen	10977023