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Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Implementierung des REMOTE-Control Systems (Rereversiblen MAnipulation of TRanscription an ENdogenous Loci), reversibel und abstimmbaren Ausdruck Kontrolle ermöglicht eine endogenen gen des Interesses an lebenden Modellsysteme. Die Fernsteueranlage beschäftigt erweiterte Lac Repression und Tet Aktivierung Systeme, Down- oder Hochregulation des Zielgens innerhalb eines biologischen Systems zu erreichen. Engen Unterdrückung erreicht werden, von Repressor Bindungsstellen flexibel befindet sich weit hinter der eine Transkription Startsite durch Hemmung der Transkription Dehnung. Robuste Hochregulation kann erreicht werden, durch die Stärkung der Transkription des endogenen Gens durch gezielte Tet transcriptional Aktivatoren für den cognate Projektträger. Diese reversible und abstimmbaren Expressions kann angewendet und in Organismen immer wieder zurückgezogen. Die Potenz und die Vielseitigkeit des Systems, wie für endogene Dnmt1 hier ermöglicht präzisere in-vivo Funktionsanalysen durch Untersuchung der Genfunktion auf verschiedenen Ebenen der Ausdruck aktivieren und testen die Reversibilität der eine Phänotyp.

Einleitung

Genetischen Ko oder transgene Ansätze wurden wirksame Mittel Genfunktion in Tiermodellen zu studieren. Jedoch Ausdruck Regulierung durch diese Ansätze ist dichotom (ein/aus), nichtzeitlichen, und so ist nicht in der Lage das komplette Funktionsspektrum eines Gens zu enthüllen. Bedingte Cre/LOxP Technologien haben räumlich-zeitliche Inaktivierung oder Aktivierung der Genfunktion zugelassen, aber ihre dichotomen Natur weiterhin Einschränkungen, z. B. Zelle Letalität und Irreversibilität1,2 , 3. um diese Lücke zu füllen, bedingte Knockdown Ansätze wurden entwickelt mit Tet-ShRNA oder MiRNA4geregelt. Ein Anliegen für RNAi5 bleiben jedoch Ziel Effekte und haben eine Herausforderung wurde, Steuern in-vivo. Vor kurzem haben CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen-Steuerungstechnik führte einen vielseitigeren Ansatz zur Erreichung sowohl up- und Downregulation der endogenen Genexpression und demonstriert ihre Dienstprogramme6,7 . CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen Kontrolle ist noch unklar, in Vivo und die Reversibilität der KRAB-basierte Unterdrückung bleibt jedoch zu gesehen, wie starke Unterdrückung durch KRAB und seine interagierenden Proteins KAP1 hat gezeigt, dass induzieren permanente Gen-silencing-8,9.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges transkriptionelle regulatorische System in der Lage bedingt kontrollieren endogene Genexpression in eine Reversible und abstimmbaren Weise bei Mäusen mit engineered transkriptionelle prokaryotische Binär Regulierungssysteme10. Prokaryotische binäre transkriptionelle Regelungssysteme mit regulatorischen Liganden wie Lac und Tet, konnten solche reversibel und abstimmbaren Ausdruck Steuern11,12,13, 14. jedoch die unzureichende Unterdrückung Potenz des aktuellen binären Systemen hat ihre breite Akzeptanz für die Steuerung der endogenen Genexpression bei Säugetieren behindert. Wir eine verbesserte Lac Unterdrückung System ausreichend potenten für die Unterdrückung der endogenen Genen entwickelt und verwendet eine neuartige Strategie des Zielens Tet transcriptional Aktivatoren direkt an den cognate Promotor des endogenen Gens zu erreichen robuste Hochregulation (Abbildung 1)10. Mit dieser Technologie haben wir fast zwei Größenordnungen Expressions des endogenen Dnmt1 Gens in einer einstellbaren, induzierbaren und reversible Weise10erreicht. Hier bieten wir schrittweise Anleitungen für die in-vivo Anwendung auf andere Gene und Organismen mit Hilfe von Mäusen als Modell Spezies.

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Abbildung 1 : Überblick über die Fernsteueranlage. Die Transkription des Zielgens eine endogene kann mit veränderter Lac Repressor und Tet Aktivator Systeme reguliert werden. Das Ziel gen Promoter oder Intron wurde entwickelt, um Operatoren für die feste Bindung LacIGY Repressor und/oder rtenthalten TA-M2-Aktivator. R steht für Repron (RepSitzung Intrauf), plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron enthält 12 symmetrische Lac Operatoren (S). T zeigt Tet Operator. Der Repressor und/oder Aktivator ist/sind von gewebespezifischen Promoter ausgedrückt. Der Ausdruck des Zielgens kann dann reversibel die gewünschte Expression durch Gabe von IPTG (Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside, ein Antagonist von der LacIGY-Repressor) oder Doxycyclin (Dox) abgestimmt werden. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Überprüfen Sie vor Beginn dieses Protokolls, Tabelle 1 , um die entsprechenden Schritte für die gewünschte Kontrolle der Genexpression zu identifizieren. Z. B. um eine Maus Ingenieur, die reversible Herabregulation der "Gen X" ermöglicht, abschließen, Abschnitte 1, 3 und 4 von den unter Protokoll. Tabelle 1 fasst auch die benötigten Komponenten der Fernsteueranlage.

Gewünschten Ausdruck ändernRepression nurAktivierung nurRepression und Aktivierung
Jeweiligen Abschnitten des Protokolls1, 3 und 42-41-4
Fernbedienung Sequenz in Zielgen benötigtRepron ("Repression Intron"; 12 symmetrische Lac Operatoren plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron)Tet OrtbestimmungRepron und Tet Ortbestimmung
Fernbedienung Sequenz LageIntronVeranstalterIntron & Promoter
Aktivator/Repressor für gewünschte Steuerelement benötigtLacIGY RepressorRtTA-M2-AktivatorLacIGY Repressor und RtTA-M2-Aktivator
Regulatorischen LigandenIPTGDoxycyclinIPTG und/oder Doxycyclin

Tabelle 1: Überblick über REMOTE-Control-Komponenten.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Southern California und Van Andel Research Institute und in Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. von den National Institutes of Health15.

1. ändern Sie das gen des Interesses für Unterdrückung durch Fernbedienung

  1. Mit den Richtlinien unten, transcriptionally inert Intron in Richtung 5'-Ende des Gens für die Einfügung der Repron Sequenz von Interesse zu identifizieren ("RepSitzung Intrauf"; 12 symmetrische Lac Operatoren plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron). Beachten Sie alternative Promotoren für das gen des Interesses, und wählen Sie ein Intron nach Studiennachweisen gesteuert werden (d.h. ein Intron geteilt durch alle Transkripte oder einen spezifisch für eine gewünschte Abschrift).
    Hinweis: Für Gene ohne ein Intron oder mit der 3'-Ende, legen Sie die Repron Sequenz in der Promoter (siehe Lee, Et Al.10 für ein detailliertes Verfahren).
    1. Erhalten der genomischen Sequenz des Gens von Interesse.
      1. Navigieren Sie zu der UCSC Genome Browser16,17, und wählen Sie im jüngsten Entwurf des Genoms Maus (Maus GRCm38/mm10 zum Zeitpunkt der Veröffentlichung), die derzeit unter der Registerkarte " Genome ".
      2. Geben Sie den Namen oder das Symbol des Gens von Interesse in die Suchleiste, die Protokolle für das Gen anzuzeigen. Klicken Sie auf go.
      3. Wählen Sie die gewünschte Abschrift-Variante für das gen des Interesses.
      4. Klicken Sie auf die gen-Symbol neben der Abschrift Variante von Interesse (das Symbol der zuvor ausgewählten Abschrift werden in einer dunklen Box).
      5. Klicken Sie unter dem Banner Sequenz und Links zu Tools und Datenbanken Genomischen Sequenz .
      6. Für Sequenz abrufen Region Optionen, wählen Sie nur die Exons (5' UTR, CDS, und 3' UTR), Introns und die Vorgabe einer FASTA Datensatz pro gen. Wählen Sie Optionen für das Formatieren von Sequenz Exons in Großbuchstaben geschrieben, alles in Kleinbuchstaben und Maske wiederholt zu N (, repetitive Sequenzen zu verbergen). Klicken Sie auf senden.
      7. Speichern Sie diese Sequenz, Erhaltung der oberen - und Kleinbuchstaben Sie Formatierungen in einem Dokument oder Programm, das mit Kommentaren versehen werden kann.
    2. Vermeiden Sie Unterbrechung der CpG Inseln, die Regionen mit regulatorischen Genfunktion hindeuten.
      Hinweis: Wenn ein 5' Intron zum Einsetzen der Repron Sequenz vorzuziehen ist, kann die ersten Intron transkriptionelle regulatorischen Elemente wie CpG Inseln (untersucht in diesem Schritt) oder Enhancer-Elemente (untersucht im Schritt 1.1.4), die für Repron vermieden werden enthalten einsetzen.
      1. Wählen Sie unter dem Ausdruck und Verordnung Banner der UCSC Genome Browser für den CpG Inseln Track zeigen , und klicken Sie auf Aktualisieren.
      2. Zoomen auf die 5' Introns, klicken Sie auf jede CpG-Insel (zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vorhanden grün dargestellt), und wählen Sie Ansicht DNA für diese Funktion.
      3. Wählen Sie nach der Auswahl Maske wiederholt an N, DNA zu bekommen , um die CpG Insel Sequenz.
      4. Überlagern Sie diese Sequenzen mit der Originaldatei Sequenz und kommentieren Sie diese als intronischen Regionen, aufgrund von möglichen regulatorischen Genfunktionen zu vermeiden.
    3. Vermeiden Sie Unterbrechung der nicht-kodierende RNAs, für den Fall, dass sie eine regulatorische Funktion haben.
      1. Wählen Sie unter dem Gene und Gene vorhersagen Banner der UCSC Genome Browser für den GENCODE (Ensembl) Track zeigen , und klicken Sie auf Aktualisieren.
      2. Zoomen auf die 5' Introns, klicken Sie auf jedes nicht-kodierender RNA (zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vorhanden grün dargestellt) und erhalten Sie die DNA-Sequenz jeweils durch Anklicken der chromosomalen Koordinaten.
      3. Wählen Sie im Drop-Down-Menü Ansicht DNA, und klicken Sie auf Maske wiederholt bis N. Klicken Sie auf DNS zu erhalten.
      4. Überlagern Sie diese Sequenzen mit der Originaldatei Sequenz und kommentieren Sie diese als intronischen Regionen, aufgrund von möglichen regulatorischen Genfunktionen zu vermeiden.
    4. Vermeiden Sie intronischen Regionen mit Enhancer Signaturen in der Tissue(s) von Interesse, wie H3K4me1, H3K27ac und DNase ich Überempfindlichkeit18,19,20,21, sowie CTCF Bindung Websites, die Enhancer22,23looping zu regulieren.
      1. Navigieren Sie zu der ENCODE Datenbank24,25, und wählen Sie das Symbol der Experimente .
      2. Wählen Sie für den Assay-Typ ChIP-Seq oder DNase-Seq, und füllen Sie die anderen Kategorien (Organismus, Biosample Artusw.) entsprechend der Zellen entwickelt werden.
      3. Zeigen Sie nach Funktionsauswahl auf die Piktogramme in blau, und wählen Sie das für die Ergebnisse als Liste anzeigen (am weitesten links zum Zeitpunkt der Veröffentlichung) Piktogramm.
      4. Wählen Sie die Datensätze für die Ziele des H3K4me1, H3K27ac, DNase I und CTCF, die die Zellen entwickelt werden, die am ehesten entsprechen.
      5. Innerhalb jedes relevante Dataset, scrollen Sie zum Abschnitt " Dateien ", stellen Sie sicher, dass mm10 (oder die neueste Version von Genom) und UCSC werden ausgewählt, und klicken Sie auf die Schaltfläche " visualisieren ".
      6. Jetzt im UCSC Genome Browser und Zoomen auf die 5' Introns für das gen des Interesses, klicken Sie auf jedes H3K4me1, H3K27ac, DNase ich und CTCF Peak in ihren jeweiligen kommentierte Peak-Tracks.
      7. Erhalten Sie die DNA-Sequenz für jede Region Höhepunkt indem er auf seine chromosomalen Koordinaten.
      8. Wählen Sie im Drop-Down-Menü Ansicht DNA, und klicken Sie auf Maske wiederholt bis N. Klicken Sie auf DNS zu erhalten.
      9. Überlagern Sie diese Sequenzen mit der Originaldatei Sequenz und kommentieren Sie diese als intronischen Regionen, aufgrund von möglichen regulatorischen Genfunktionen zu vermeiden.
    5. Unterbrechungen des Konsenses Spleißen Sequenzen, um geeignete Spleißen der Exons stören nicht zu vermeiden.
      Hinweis: Obwohl Sequenzen erforderlich für das Spleißen weitgehend beschränkt sind, etwa sechs Stützpunkte am 5' Ende ein Intron26 und etwa 60 Basen am 3' Ende27, es empfiehlt sich, eine große Intron, zulassend erheblich größere Margen aus diesen wählen Konsens-Regionen, die Wahrscheinlichkeit einer Beeinträchtigung Spleißen zu minimieren. Nutzung der Intron-Analyse-Tools, wie z. B. SVM-BPfinder28, empfiehlt sich für eine tiefer gehende Analyse der potenziellen Spleiß-Sequenzen.
  2. Nach der Identifizierung eine intronischen Region, dass erfüllt die oben genannten Kriterien (als beispielhaft für Dnmt1 in den ergänzenden Daten), Bildschirm der Sequenz mithilfe eines Online-SgRNA design-Werkzeug, um eine SgRNA in der Region mit hoher Spezifität zu identifizieren und vorhergesagt Effizienz punktet.
    1. Navigieren Sie zu einem Online-SgRNA-Design-Tool der Wahl, z. B. CRISPOR29.
    2. Geben Sie die Reihenfolge der intronischen Region von Interesse, geben Sie das entsprechenden Verweis Genom, und wählen Sie die gewünschte Protospacer angrenzenden Motiv (PAM). Klicken Sie auf senden.
    3. Sortieren Sie der vorhergesagten SgRNAs nach Spezifität Partitur, und wählen Sie eine oder mehrere SgRNAs, die auch eine hohe prognostizierte Effizienz29Punkten.
      1. Optional: Um die Wahrscheinlichkeit auf eine effektive SgRNA zu maximieren, zuerst testen Sie die Spaltung Effizienz von mehreren Top-scoring SgRNAs in eine in-vitro-Assay-30, und fahren Sie mit der effizientesten SgRNA in-vivo.
  3. Entwerfen einer DNA-Vorlage mit einem PITT (man Injektion basierende gezielte Transgenese) landing Pad Sequenz, wie zusätzliche Abbildung 1A, B, 60-Base Homologie-Arme, die die SgRNA Website31 Schnitt entsprechen, auf beiden Seiten flankiert .
    Hinweis: Der Landeplatz enthält zwei Zellkulturmodells LoxP -Websites (JT15 und Lox2272) und ermöglicht gezielte Einbau von großen Sequenzen durch ein zweistufiges Konzept; Achten Sie darauf dass die Kreuzungen dieser Einfügung keine kryptischen Spleißstellen verursachen. Alternativ kann eine embryonale Stammzelle (ESC) - Basis Knock - in-Strategie verwendet werden, um die Repron-Sequenz direkt einzufügen.
  4. Bereiten Sie die SgRNA, Cas9 Protein und einzelsträngiger DNA (SsDNA) Vorlage für den Landeplatz und microinject in die befruchtete Eizelle (von Mäusen B6C3F1/J oder andere gewünschte Sorte) gemäß etablierte Protokolle32,33.
  5. Bildschirm für Mäuse mit der Landung Pad Knock-in.
    1. Design-PCR Zündkapseln ergänzende genomischen Locus, sondern außerhalb der Regionen durch die Homologie Arme wie für Dnmt1 in ergänzende Abbildung 1gezeigt. Vermeiden Sie sich wiederholende Genomsequenzen beim Entwerfen der Primer.
    2. Tail-Clips der Mäuse nach etablierte Protokolle34extrahieren Sie DNA.
    3. Verwenden PCR und gel-Elektrophorese um Mäuse mit einer Landung Pad einfügen zu identifizieren.
    4. Bestätigen Sie, dass die Knock-in erfolgreich war durch Sequenzierung der PCR-Produkte.
      Hinweis: Unerwünschte große Deletionen und Rearrangements können durch CRISPR/Cas935, so vorsichtig, dass Screening zum Ziel bearbeiten bevor Sie fortfahren35,36,37empfiehlt eingeleitet werden.
  6. Verwendung von befruchteten Eizellen von der Landung Pad Mäuse, microinject iCre mRNA38 und einer transgenen Plasmid enthält die Repron-Sequenz flankiert von JTZ17 und Lox2272 Rekombination Seiten31,39,40, 41 nach etablierte Methoden38,42,43.
  7. Bildschirm für Mäuse mit dem Repron einsetzen.
    1. Design PCR Primer komplementär zu der genomischen Locus, außerhalb der Repron einfügen. Vermeiden Sie sich wiederholende Genomsequenzen beim Entwerfen der Primer.
    2. Tail-Clips der Mäuse nach etablierte Protokolle34extrahieren Sie DNA.
    3. Verwenden PCR und gel-Elektrophorese um Mäuse mit einer Repron Einfügung zu identifizieren.
    4. Bestätigen Sie, dass die Knock-in erfolgreich war durch Sequenzierung der PCR-Produkte.

2. ändern Sie das gen des Interesses für Hochregulation von REMOTE-control

  1. Mit den folgenden Richtlinien identifizieren einer Region in der Promoter des Gens von Interesse, die unwahrscheinlich, dass Veranstalter Funktion beim Einstecken des Tet -Operator-Sequenzen zu belästigen. Beachten Sie alternative Promotoren für das gen des Interesses, und wählen Sie Förderer nach den Studiennachweisen gesteuert werden (d.h. ein Promotor geteilt durch alle Transkripte oder einen spezifisch für eine gewünschte Abschrift).
    1. Erhalten Sie die genomische Sequenz für den Promotor von Interesse.
      1. Navigieren Sie zu der UCSC Genome Browser16,17, und wählen Sie im jüngsten Entwurf des Genoms Maus (Maus GRCm38/mm10 zum Zeitpunkt der Veröffentlichung), die derzeit unter der Registerkarte " Genome ".
      2. Geben Sie den Namen oder das Symbol des Gens von Interesse in die Suchleiste, die Protokolle für das Gen anzuzeigen. Klicken Sie auf go.
      3. Wählen Sie die gewünschte Abschrift-Variante für das gen des Interesses.
      4. Klicken Sie auf die gen-Symbol neben der Abschrift Variante von Interesse (gen Symbol der zuvor ausgewählten Abschrift werden in einer dunklen Box).
      5. Klicken Sie unter dem Banner Sequenz und Links zu Tools und Datenbanken Genomischen Sequenz .
      6. Sequenz abrufen Region Optionenwählen Sie in der nur Promoter/Upstream von 1000 Basen. Sequenz Formatierung Optionenwählen Sie in der Maske wiederholt zu N (, repetitive Sequenzen zu verbergen). Klicken Sie auf senden.
      7. Speichern Sie diese Promotorsequenz in einem Dokument oder Programm, das mit Kommentaren versehen werden kann.
    2. Ausgewählte Regionen, die frei von vermeintlichen Transkription Faktor Bindungsstellen als unterbrechen diese Sequenzen können endogene Genexpression verändern.
      1. Navigieren Sie zu der UCSC-Genom-Browser, und öffnen Sie die neueste Version von der Maus Genom.
      2. Wählen Sie über das Mapping und Sequenzierung Banner Naben zu verfolgen.
      3. Klicken Sie auf mm10 neben dem Namen der Hub von JASPAR 2018 TFBS (oder die neueste Version von JASPAR).
      4. Geben Sie den Namen oder das Symbol des Gens von Interesse in die Suchleiste, die Protokolle für das Gen anzuzeigen. Klicken Sie auf go.
      5. Wählen Sie die gewünschte Abschrift-Variante für das gen des Interesses.
      6. Scrollen Sie die JASPAR 2018 TFBS -Banner, und klicken Sie auf den Dropdown-Pfeil, um wählen die gewünschte Anzeigeoption für die Spur, wie quetschen. Klicken Sie auf Aktualisieren.
      7. Zoom in der Promotor-Region des Gens von Interesse, und Regionen, die kostenlose (oder relativ frei) der Transkription Faktor Bindungsstellen nach JASPAR Track zu identifizieren. Notieren Sie die chromosomalen Koordinaten dieser Regionen.
      8. Erhalten Sie die genomische Sequenz dieser chromosomalen Koordinaten indem Sie sie in die Suchleiste eingeben und auf gehen. Wählen Sie im Drop-Down-Menü Ansicht DNA, und klicken Sie auf Maske wiederholt bis N. Klicken Sie auf DNS zu erhalten.
      9. Überlagern Sie diese Sequenzen mit der Originaldatei Sequenz und kommentieren Sie diese als ideale Förderer Regionen, wegen des Mangels an Transkription Faktor verbindlichen Zielen.
    3. Wählen Sie in diesen Sequenzen eine perturbable Promotor-Region, die stromaufwärts, aber in der Nähe der Startsite Transkription des Gens von Interesse ist.
      Hinweis: Eine Einfügung, die zu nahe ist, dass die Transkription Startseite die Möglichkeit der Beeinträchtigung Promotoraktivität erhöhen kann, aber eine Einfügung, die zu weit ist, kann das Niveau der Hochregulation verringern. Einfügen von Tet -Operator-Sequenzen ca. 200 Basenpaaren stromaufwärts des Standortes Transkription Start führte robuste Hochregulation der zwei Promotoren getestet (siehe Diskussion)10.
  2. Bildschirm der ausgewählten Promotor-Region mit Hilfe eines Online-SgRNA-Design-Tool, um ein SgRNA in der Region mit hoher Spezifität und prognostizierte Effizienz Partituren zu identifizieren.
    1. Navigieren Sie zu einem Online-SgRNA-Design-Tool der Wahl, z. B. CRISPOR29.
    2. Geben Sie die Reihenfolge der Region von Interesse, geben Sie das entsprechenden Verweis Genom, und wählen Sie die gewünschte Protospacer angrenzenden Motiv (PAM). Klicken Sie auf senden.
    3. Sortieren Sie der vorhergesagten SgRNAs nach Spezifität Partitur, und wählen Sie eine oder mehrere SgRNAs, die auch eine hohe prognostizierte Effizienz29Punkten.
      1. Optional: Um die Wahrscheinlichkeit auf eine effektive SgRNA zu maximieren, zuerst testen Sie die Spaltung Effizienz von mehreren SgRNAs in einer in-vitro-Assay-30und fahren Sie mit der effizientesten SgRNA in-vivo.
  3. Entwerfen einer DNA-Vorlage mit Tet Betreiber 60-Base Homologie-Arme, die die SgRNA schneiden Seite31,33entsprechen, auf beiden Seiten flankiert.
    Hinweis: Die Zahl der Tet -Betreiber ist anpassbar; Einfügen von zwei bis vier Tet Operator-Sequenzen im Tandem hat zuvor wirksam erwiesen, aber im Prinzip mehr Betreiber sind wünschenswert für das fahren der höheren Ausdruck. Alternativ kann eine ESC-basierten-Knock-in-Strategie die Tet -Operatoren einfügen verwendet werden.
    1. Optional: Für experimentelle Beweise dafür, dass die vorgeschlagenen Änderungen der endogene transkriptionelle Aktivität des Gens von Interesse wahrscheinlich nicht stören werden, Klonen veränderter Promotorsequenz in einen Firefly Luciferase-Vektor (z. B. pGL3-Basic), und Vergleichen Sie ihre Wirksamkeit gegenüber dem ursprünglichen Veranstalter mit einem Luciferase Assay.
  4. Bereiten die SgRNA, Cas9 Protein und die SsDNA-Vorlage, die die Tet -Operator-Sequenzen enthalten, und in die befruchtete Eizelle (von Mäusen B6C3F1/J oder andere gewünschte Sorte) gemäß etablierte Protokolle32,33microinject.
    Hinweis: Aufgrund der Komplexität der Synthese einer sich wiederholende Sequenz empfiehlt ein in-vitro-Transkription/Reverse Transkription basierenden Ansatz eine SsDNA Vorlage aus einem doppelsträngige DNA (DsDNA) Plasmid44zu synthetisieren. Alternativ eine DsDNA-Vorlage für die Mikroinjektion verwendet werden, aber die Knock-in-Effizienz möglicherweise reduzierten45.
  5. Bildschirm für Mäuse mit Knock-in der Tet -Betreiber.
    1. PCR-Primer komplementär zu der genomischen Locus, außerhalb der Regionen durch die Homologie Arme zu entwerfen. Vermeiden Sie sich wiederholende Genomsequenzen beim Entwerfen der Primer.
    2. Tail-Clips der Mäuse nach etablierte Protokolle34extrahieren Sie DNA.
    3. Verwenden PCR und gel-Elektrophorese um Mäuse mit dem Einsetzen der Tet -Betreiber zu identifizieren.
    4. Bestätigen Sie, dass die Knock-in erfolgreich war durch Sequenzierung der PCR-Produkte.
      Hinweis: Unerwünschte große Deletionen und Rearrangements können durch CRISPR/Cas935, so vorsichtig, dass Screening zum Ziel bearbeiten bevor Sie fortfahren35,36,37empfiehlt eingeleitet werden.

3. entwickeln Sie Aktivator und/oder Repressor exprimierenden Mäuse

  1. Identifizieren Sie kräftig mit dem Ausdruck ihrer Förderer für die Tissue(s) oder Zelle (n) von Interesse.
    Hinweis: Eine Literaturrecherche und der gewebespezifischen Promoter Datenbank46 können zur Identifizierung solcher Förderer nützlich sein.
  2. Platzieren Sie die bereitgestellten erweiterten Lac Repressor oder Tet Aktivator Sequenz stromabwärts von der gewünschten Veranstalter um ein transgener Konstrukt zu generieren.
  3. Die transgenen Maus Zeile(n) mit transgenen Standardverfahren42,43,47zu produzieren. Alternativ kann ein ortsspezifische Transgenese Ansatz Positionseffekte zu vermeiden und ermöglichen Single Copy Transgen Einfügung31,48verwendet werden.
  4. Propagieren Sie die Gründer zu, und bestimmen Sie die Muster des Ausdrucks und des Transgens bei den Nachkommen von jedem Gründer. Wählen Sie Zeilen mit robusten Ausdruck in die vorgesehenen Gewebe (n) für die weitere Zucht.
    1. Die Gründer den Wildtyp-Mäusen zu züchten.
    2. Entwerfen Sie PCR-Primer, die die Einfügung der Aktivator und/oder Repressor erkennen werden.
    3. Tail-Clips der Nachkommen nach etablierte Protokolle34extrahieren Sie DNA.
    4. Verwenden PCR und gel-Elektrophorese um Mäuse mit der Einfügung zu identifizieren.
    5. Bestätigen Sie die Transgen-Einfügung durch Sequenzierung der PCR-Produkte.
    6. Propagieren die transgenen Linien.
    7. Ein paar Welpen aus jeder Zeile zu opfern, und das Gewebe von Interesse für qRT-PCR, Immunohistochemistry und/oder westliche Beflecken zu analysieren, die Ausdruck des Gens/Proteins des Interesses an die Ziel-Gewebe (n) sammeln.
    8. Wählen Sie die Linien mit dem stärksten Ausdruck in den Geweben von Interesse für den Einsatz in Abschnitt 4.

4. bearbeiten Sie gen-Expression in-vivo

  1. Die Mäuse mit dem veränderten gen des Interesses (Abschnitt 1 und/oder 2) mit den transgenen Mäusen aus Abschnitt 3 nach etablierten Zucht Praktiken49zu züchten. Züchten Sie für maximale Expressions die Mäuse Homozygotie für das veränderte Allel.
  2. Verwalten Sie für Rückfall oder Anpassung der Repression des Zielgens IPTG im Trinkwasser.
    1. Um die Dosis von IPTG verwenden experimentell zu bestimmen, behandeln Mäuse der entsprechenden Genotyp und Steuerelemente mit einer Reihe von Dosen (empfohlen ab Palette: 0 – 400 mM IPTG) für mindestens eine Woche50,51. Gehören Sie mindestens drei Mäuse pro Behandlungsgruppe, und wählen Sie das Alter und Geschlecht der Mäuse, die für die geplante zukünftige Experimente am wichtigsten sind. Hinweis: Brutpaare von Mäusen mit IPTG Wasser zu Entwicklungsstörungen Exposition von IPTG an die Nachkommen auf Wunsch13behandelt werden können oder Mäuse können die Behandlung jederzeit nach der Geburt beginnen.
      1. Auflösen der gewünschten Mass von IPTG in sterilem destilliertem Wasser am Tag der Verabreichung, und rühren mit Stir Bar für 5 Minuten oder bis vollständig aufgelöst.
      2. Wickeln Sie die Flasche mit Folie und verwalten Sie IPTG Wasser in einer Flasche lichtgeschützt zu. Zweimal in der Woche zu ersetzen. Empfangen von 0 mM IPTG Mäuse ermöglichen Sie derselben Quelle des Wassers.
      3. Nach mindestens einer Woche Opfern Sie die Mäuse zu, und analysieren Sie die Expression des Gens von Interesse in der Ziel-Tissue(s) mit qRT-PCR, Immunohistochemistry und/oder westliche Beflecken.
      4. Identifizieren Sie die Dosis, die die Expression des Gens von Interesse der Wildtyp-Steuerelemente wiederhergestellt wird, und diese Dosis um normaler Ausdruck des Gens in zukünftige Experimente zu erreichen.
  3. Verwalten Sie für die Induktion von gen Hochregulation Doxycyclin (Dox) in der Ernährung.
    1. Um die Konzentration der Dox verwalten experimentell zu bestimmen, behandeln Mäuse der entsprechenden Genotyp und Steuerelemente mit einem der eine Reihe von Dox-Konzentrationen (empfohlen ab Palette: 0 – 5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) für mindestens eine Woche52 ,53, einschließlich mindestens drei Mäusen pro Behandlungsgruppe. Erwerben Sie Dox-haltigen Maus Essen von einem kommerziellen Anbieter.
      Hinweis: Brutpaare von Mäusen mit Dox Essen zu Entwicklungsstörungen Exposition von Dox an die Nachkommen54,55, auf Wunsch behandelt werden kann oder Mäuse können die Behandlung jederzeit nach der Geburt beginnen.
    2. Ersetzen Sie die Diät einmal pro Woche. Bieten Sie die gleichen base-Diät für Mäuse Dox-freie Lebensmittel erhalten.
    3. Nach mindestens einer Woche Opfern Sie die Mäuse zu, und analysieren Sie die Expression des Gens von Interesse in der Ziel-Tissue(s) mit qRT-PCR, Immunohistochemistry und/oder westliche Beflecken.
    4. Identifizieren Sie die Dosis, die die Expression des Gens von Interesse auf das gewünschte Niveau erhebt, und diese Dosis um Überexpression des Gens in zukünftige Experimente zu erreichen.

Ergebnisse

Die Fähigkeit, Unterdrückung der REMOTE-Control-System wurde bisher in zwei verschiedene Ansätze nachgewiesen. Bei dem ersten Ansatz wurden Lac Repressor Bindungsstellen an der endogenen Promoter des Gens Dnmt1 eingefügt. Im zweiten Ansatz, der durch dieses Protokoll empfohlen wird, waren eine nachgeschaltete Intron potenzielle Förderer Funktion zu beeinträchtigen, durch die Einfügung zu vermeiden und damit zur Erleichterung der Anwendung der Fernbedienung Repressor-Bindungsstellen eingefügt. System. Beide Ansätze führte erfolgreiche Unterdrückung (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A-C)10. Dnmt1 Ausdruck wurde auf 15 % der unregulierten Ebenen mit dem Promotor-basierte Ansatz (Abb. 2A) unterdrückt. Diese engen Unterdrückung wurde in einer Dosis-abhängigen Weise umgekehrt, durch Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen Mengen von IPTG (Abb. 2A). Die beobachteten Dnmt1 Unterdrückung wurde auf Proteinebene von Immunostaining (Abbildung 2B) validiert. Wir waren nicht darauf bedacht, keine merklichen Unterschied in Dnmt1 Ausdruck zwischen Dnmt1+ / + und Dnmt1LO/LO -Mäuse, bestätigt, dass unsere Lac -Operator einfügen nicht normal Promotor gestört hatte Funktion10. Die Intron-basierten Ansatz erreicht mehr als 90 % Unterdrückung von Betreibern liegt mehrere Kilobases stromabwärts von der Transkription Startsite mildernde Transkription Dehnung (Bild 3A, B)10. Diese Intron-basierten Ansatz wurde weiter auf sieben weitere robuste Promotoren (Abb. 3C) validiert. Immer eng Repression wurde von allen die Promotoren getestet erreicht. Keine Korrelation zwischen den verbleibenden Ausdruck und die Stärken der Förderer wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Repression Kapazität unseres Repression Intron-basierten Systems die transkriptionelle Potenz aller von der robusten Promotoren übersteigt wir getestet () Abbildung 3 ( C).

Die Fähigkeit, in-vivo Hochregulation der REMOTE-Control-System zeigte sich auch auf dem Dnmt1 gen. Wir führten zwei Kopien des Operators Tet in Dnmt1 Promotor, zusammen mit Lac -Operator-Sequenzen zu ermöglichen, entweder Hochregulation oder Downregulation, je nachdem, welche Effektor Protein vorhanden ist. Robuste Hochregulation und Downregulation der Dnmt1 Ausdruck, in der Nähe von zwei Größenordnungen (10 % bis 650 %) wurden in WSR, enthält das modifizierte endogene Dnmt1 Allel (Dnmt1LGT) (Abb. 4A) erreicht10 . Beide Verordnungen waren vollständig reversibel und induzierbaren durch IPTG und Dox Behandlungen bzw. (Abb. 4A). Als nächstes haben wir die Dnmt1LGT Änderung in der Maus Keimbahn, die Fähigkeit, in-vivo Hochregulation der Fernsteueranlage testen eingeführt. Starke Hochregulation der Dnmt1 wurde von Leber, Milz und Niere, beobachtet, während keine nachweisbaren Hochregulation im Herzen (Abbildung 4B)7beobachtet wurde. Der Zellzyklus-abhängiges Expressionsmuster der Dnmt1 und der Knappheit der proliferativen Zellen im Herzen können diese Beobachtung10,56zugrunde liegen. Es bleibt abzuwarten, ob diese Einschränkung überwunden werden kann, durch die Erhöhung der Expression der Aktivator oder die Anzahl von seinen Bindungsstellen.

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Abbildung 2 : In vivo Unterdrückung der Dnmt1 durch die LacIGY-Repressor. (A) Mäuse mit Lac Operatoren (LO) in der Dnmt1 -Veranstalter, mit oder ohne Ausdruck des LacIGY, eingefügt mit verschiedenen Dosen von IPTG behandelt wurden. qRT-PCR Analyse der Dnmt1 Ausdruck zeigt die dosisabhängige Umkehrung der Dnmt1 Repression in-vivo durch IPTG Behandlung. Jeder Balken repräsentiert Daten aus eine andere Maus. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining Dnmt1 Proteins im Kolon Krypten von Mäusen lieferte Trinkwasser mit oder ohne 160 mM IPTG für 3 Wochen. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3 : In vivo und in-vitro-Unterdrückung der verschiedenen Promotoren von der REMOTE-Steuerung. (A) eine frühe Version der Repron-Sequenz (R *) wurde in einem Intron stromabwärts des Veranstalters Villin in einer Villin-mKate2 transgenen Maus (VilmKate2) eingefügt. qRT-PCR-Analyse des mKate2 Ausdrucks im Dünndarm von Mäusen mit oder ohne LacIGY -Repressor wird angezeigt. Jeder Balken repräsentiert Daten aus eine andere Maus. (B) konfokale mKate2 Bilder des Dünndarms mit und ohne LacIGY Ausdruck. (C) sechs symmetrische Lac Operatoren (S) wurden zwischen verschiedenen Promotoren und Luciferase Reporter eingefügt. Reporter (50 ng/Well in 96-Well-Platte) und Repressor Plasmide wurden vorübergehend in NIH/3 t 3 Zellen in einem Molverhältnis von 1:1 eingeführt. Luciferase Werte wurden bewertet 24 h nach Transfektion. Diese in-vitro-Daten repräsentieren die Prozent der Luciferase Ausdruck in LacIGY-Zellen im Vergleich zu denen mit dem Ausdruck nicht-funktionale LacI (NFlacI) zum Ausdruck zu bringen. T-Tests wurden verwendet, um statistische Signifikanz bestimmen. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4 : Down - und/oder Hochregulation der Dnmt1 Ausdruck in vitro und in vivo. (A) das komplette REMOTE-Control-System wurde in kultivierten WSR durch Gene targeting und Elektroporation Ansätze entwickelt. Maximale Unterdrückung der Dnmt1 Ausdruck wurde ohne Behandlung erreicht, während die maximale Aktivierung durch IPTG und Dox Behandlung erzielt wurde. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch es t-Tests). (B) In vivo Aktivierung der Dnmt1 durch die Fernsteueranlage wie Immunostaining Dnmt1 Protein in verschiedenen Geweben von REMOTE-Control-Mäusen gezeigt. Die LGT -Allel stellt Promotor Änderung der Dnmt1 , Lac -Operator und Tet Aktivator Bindungsstellen enthalten. Mäuse wurden einen Monat lang mit einer normalen oder Dox-haltige Ernährung (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) behandelt. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändertKlicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Zusätzliche Abbildung 1 : Beispiel der landing Pad einfügen in murinen Dnmt1 Intron 1. (A) schematische Darstellung der DNA Schablone für landing Pad einlegen, adaptiert von Quadros Et Al. (2015)31. Zellkulturmodells LoxP -Websites, JT15 und Lox2272, sind getrennt durch eine kurze Abstandhalter-Sequenz (sp) und 60-bp DNA, die homolog zu der genomischen Zielregion ist auf jeder Seite flankiert. (B) Probe DNA Schablone für landing Pad einfügen in der Dnmt1 Intron mithilfe der folgenden SgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (die umgekehrten Strang Ziele). Die ausgewählte intronischen Region war Bioinformatically für Schritt 1.1 informiert, und die SgRNA wurde durch CRISPOR29identifiziert. (C) Beispiel für PCR Primer Design für die Beurteilung der Einfügung der Landeplatz. PCR-Primer wurden außerhalb der Homologie Wappen der Vorlage entwickelt, um die Integration in endogene Dnmt1bestätigen. Der Wildtyp-PCR-Amplifikate ist 213 bp; beim Einfügen, wird es 291 BP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Ein wichtiger Schritt und mögliche Einschränkung des REMOTE-Control-Systems ist die Herausforderung, verbunden mit dem Einführen der Repressor bzw. Aktivator Bindungsstellen ohne Ziel Genexpression. Unsere ursprüngliche Unterdrückung Ansatz involviert, da auf das Dnmt1 gen angewendet Einfügen von Lac Repressor Bindungsstellen innerhalb transcriptionally kritischen Regionen eines Promotors. Zur Verringerung des Risikos des Projektträgers Funktion beeinträchtigen und damit zu verbessern die allgemeine Anwendbarkeit der REMOTE-Steuerung, entwickelten wir einen Unterdrückung Intron-basierten Ansatz. Die Wirkstärke von unserem erweiterten Lac -System erlaubt uns, fest die Transkription der starke Promotoren unterdrücken wir bei Betreibern befindet sich getestet hundert bis zu mehreren Kilobases flussabwärts der Transkription beginnen Websites (Abbildung 3A – C) 10. wichtig ist, das Niveau der Unterdrückung wurden unabhängig von transkriptionellen Stärken der Promotoren (Abbildung 3A – C)10. Dies deutet darauf hin, dass die Repression Kapazität unseres Repression Intron-basierten Systems die transkriptionelle Stärke der getesteten Promotoren übersteigt. In diesem Intron-basierten Ansatz ist es wahrscheinlich, dass die Unterdrückung durch körperliche Störungen zwischen zwei Komponenten, die Dehnung Transkriptionsmaschinerie und Lac Repressoren57vermittelt wird. Dieser einfache Unterdrückung Mechanismus und die nachgewiesene Robustheit der Intron-basierte Methode können dieser Ansatz generell für verschiedene Gene, Geweben und Organismen machen.

Die Hochregulation von der REMOTE-Steuerung erfordert die Transaktivator Bindung Sequenzen in der Nähe der Ziel-gen-Veranstalter, die eine Gefahr der Projektträger Funktion beeinträchtigen. Allerdings haben wir festgestellt, dass die Position der verbindlichen Sequenzen außerhalb der transcriptionally kritische Region sein kann. Dnmt1 und EF1α Projektträger waren robust hochreguliert Tet Postbetreibern befindet sich ein paar hundert Basen stromaufwärts der Transkription Start Seiten10. Diese entspannte Einschränkung reduziert die Chance der Projektträger Funktion des Zielgens in Ermangelung der Transaktivator beeinträchtigen. Erhöhung der Zahl der Bindung-Sequenzen und/oder Verwendung von stärkeren Transactivators könnte helfen, weiter zu reduzieren das Risiko durch Hochregulation von Websites weiter entfernt von der Transkription Startsite aktivieren.

Unser REMOTE-Control-System bietet elegante Kontrolle über die Höhe, Zeitpunkt und Ort der endogenen Genexpression, so dass für die Prüfung der Reversibilität des Phänotyps und die Folgen eines anderen Ausdruck Niveaus, die nicht ohne weiteres erreichbar sind aktuelle in-vivo-Expressions Gentechnologien. Es ist wichtig zu beachten, dass in den meisten Genexpressionsanalysen, einschließlich der unsrigen, Ausdruckswerte im Durchschnitt von einer Bevölkerung der Zellen repräsentieren unter denen erhebliche Unterschiede gefunden werden kann. Diese Heterogenität beeinflussen zellulären Entscheidungsprozesse, wie Differenzierung oder Apoptose58. Wenn die Genauigkeit der gen-Expressions durch zusätzliche genetische Schaltung engineering59wahrscheinlich weiter verbessert werden könnte, ermöglicht die beobachteten Wirksamkeit von unserem derzeitigen System nützliche Untersuchung der Genfunktion in vielen biologischen zusammenhängen. Darüber hinaus wird ein hohes Maß an Ziel-Spezifität aufgrund der Komplexität der die Operator-Sequenzen sowie der großen evolutionären Abstand zwischen Säugetieren und die ursprünglichen Arten der regulatorische Komponenten60erwartet. Darüber hinaus können transgene Mauslinien Repressors und Aktivatoren entwickelt und für jedes endogenen gen eingesetzt werden. Zum Beispiel können bestehende Tet Transaktivator Mausmodellen um Hochregulation von Zielgen in den gewünschten Maus Geweben zu erreichen angepasst werden. Kürzlich entwickelten wir eine transgene Linie, die robuste gewebespezifischen Ausdruck unserer verstärkten Lac Repressor in mehrere Gewebetypen durch die Einführung des LacIGY -Gens in der Hipp11 Locus48 in Kombination mit bestehenden Cre-Linien fahren kann unter der Kontrolle eines Lox-STOP-Lox-Elements (unveröffentlicht). Dieser Linie würde die gewebespezifischen Anwendung von REMOTE-Control-System erheblich erleichtern.

Gen Hochregulation von der REMOTE-Steuerung bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu aktuellen induzierbaren transgene Ansätze. Es erfordert keine Generation von mehrere transgene Linien für Positionseffekte der Insertion, zu testen, wie es die endogenen Locus nutzt. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für Hochregulierung von Genen mit starken Grundlinie Ausdruck weil es Ausdruck von einem bereits stabile Promoter verbessert während herkömmliche transgene Modelle auf minimale virale Promotoren verlassen. Zu guter Letzt das Gewebe Spezifität, Zellzyklus Kontrolle und Spleißen Varianten eines Ziel-Gens können beibehalten werden auf Hochregulation von unserem Ansatz, wie es Elemente der natürlichen Regulierung wie angeborene GUSbewahrt-regulatorischen Elementen. Das Aufkommen der CRISPR/Cas-mediated Gene-targeting-Technologie wird die Anwendung dieser Technologie in verschiedenen Modellsysteme erheblich erleichtern.

Offenlegungen

PWL dient auf der Scientific Advisory Boards von AnchorDx und Progenity, Inc.

Danksagungen

Wir bedanken uns bei den späten Dr. Heidi Scrable für ihre großzügige Gabe von den Säugetieren LacI Genkonstrukt (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankreich) für die Bereitstellung der Villin-Promoter und Dr. Laurie Jackson-Grusby (Kinderklinik, Boston, MA) für ihre Verdienste um den frühen Stadien der Technologieentwicklung. Wir sind dankbar für Dr. Nancy Wu und Dr. Robert Maxson für ihre Unterstützung bei der Erzeugung transgenen und Knockout-Mäusen. Wir bedanken uns bei die Mitgliedern des Laird Labors für hilfreiche Gespräche und unterstützen. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01-CA157918 und R01 CA212374, P.W.L. und 1F31CA213897-01A1, N.A.V.S] unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
B6C3F1/JThe Jackson Laboratory100010https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 ProteinPNA BioCP04http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPORHaeussler et al. 2016http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse DietEnvigoVaries by concentrationhttps://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE DatabaseStanford Universityhttps://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)Addgene65795https://www.addgene.org/65795/
IPTGGoldBioI2481Chttps://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-BasicPromegaE1751https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinderRegulatory Genomics, Pompeu Fabra Universityhttp://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter DatabaseDepartment of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://genome.ucsc.edu/

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