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요약

이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.

초록

우리가 되돌릴 수 및 가변 식 제어할 수 있는 원격 제어 시스템 (다시versible Manipulation of Transcription Endogenous loci에서), 구현에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기는 생활의 내 생 유전자 시스템 모델. 원격 제어 시스템 다운-또는 단일 생물 학적 시스템 내에서 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 향상 된 락 억제와 tet 활성화 시스템을 사용 합니다. 꽉 억압 유연 하 게 위치한 사이트 바인딩 진압에서 달성 될 수 있다 녹음 방송 신장 억제 함으로써 녹음 방송 시작 위치의 하류까지. 강력한 upregulation 동족 발기인에 tet transcriptional 활성 제를 대상으로 내 생 유전자의 전사를 강화 하 여 달성 될 수 있다. 이 가역 및 가변 식 컨트롤 적용 하 고 유기 체에서 반복적으로 철수 수 있습니다. 힘과 같이 내 인 성 Dnmt1 , 여기에 대 한 시스템의 다양성을 허용할 것 이다 더 정확한 생체 조건 기능적인 분석 다양 한 식 수준에서 유전자 기능의 조사 함으로써 고의 반전 기능을 테스트 하 여는 표현 형입니다.

서문

유전자 녹아웃 또는 유전자 변형 접근 동물 모델에서 유전자 기능을 연구 하는 효과적인 수단 되었습니다. 그러나, 이러한 방법에의 한 식 규제 dichotomous (온/오프), 비 시간적, 이며 따라서 유전자의 완전 한 기능 스펙트럼을 드러내는 능력입니다. Spatio 시간적 비활성화 또는 활성화 유전자 함수, 조건부 Cre/LoxP 기술 허용 하지만 그들의 둘로 나눠진 본성 포즈 셀 치 및 경험 irreversibility1,2 등 한계를 계속 , 3.이 공 허를 채우기 위해 조건부 최저의 방법을 개발 되었으며 tet를 사용 하 여-shRNA 또는 미르4규제. 그러나, 오프 대상 효과 RNAi5 에 대 한 관심사를 유지 하 고 도전 vivo에서. 을 제어 하 더 최근에, CRISPR/Ca 중재 transcriptional 통제는 업 및 내 인 성 유전자 발현의 downregulation를 달성 하는 더 다양 한 접근법을 도입 기술과 그들의 유틸리티6,7 시연 . 그러나, transcriptional 제어 CRISPR/Ca 중재의 효과 아직 vivo에서 명확 하지 않다 고 리아 기반 억압의 가역 리아에 의해 본, 강한 억압 하 남아 있고 그것의 상호 작용 단백질 KAP1 유도 표시 되었습니다. 영구적인 유전자 침묵8,9.

이러한 한계를 해결 하기 위해 우리 소설 transcriptional 규제 시스템은 조건부로 제어는 가역에 내 인 성 유전자 발현의 수를 개발 하 고 마우스를 사용 하 여 조정할 수 있는 방식으로 간결한 이진 transcriptional 설계 규제 시스템10. 락 등 tet, 규제 ligands와 간결한 이진 transcriptional 규제 시스템 같은 가역 활성화 및 가변 식 제어11,12,13, 그러나 14., 현재 이진 시스템의 부적당 한 진압 힘 포유류에 내 인 성 유전자 발현을 제어 하기 위한 그들의 광범위 한 채택에 장애가 있다. 우리는 충분히 내 생 유전자의 진압에 대 한 강력한 향상 된 락 억압 시스템 개발 하 고 달성 하기 위해 내 생 유전자의 동족 발기인에 직접 tet transcriptional 활성 제를 대상으로의 새로운 전략을 채택 강력한 upregulation (그림 1)10. 이 기술로, 우리 가락, 유도할 수 있는, 그리고 가역 방식으로10내 생 Dnmt1 유전자의 거의 두 배나 식 제어를 달성 했다. 여기 우리는 다른 유전자와 마우스를 사용 하 여 모델 종으로 생물을 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다.

figure-introduction-1896
그림 1 : 원격 제어 시스템의 개요. 내 생 대상 유전자의 전사는 설계 lac 진압 tet 활성 시스템을 사용 하 여 조정할 수 있습니다. 대상 유전자 발기인 또는 intron 꽉 바인딩 LacIGY 진압 및 rt에 대 한 연산자를 포함 하는 설계 조교 M2 활성 제. R Repron (담당자ression 하루에에), 부분 토끼 beta globin intron 플러스 12 대칭 락 연산자 (S)를 포함 된 나타냅니다. T는 tet 연산자를 나타냅니다. 진압 또는 활성 제/조직 관련 발기인에서 표현 됩니다. 대상 유전자의 표현 수 있습니다 다음 역 조정 된 원하는 식 수준으로 IPTG (이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY 진압의 길 항 제) 또는 Doxycycline (Dox)의 관리에 의해. 이 그림 리 외.10에서 수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

이 프로토콜을 시작 하기 전에 표 1 유전자 발현의 원하는 컨트롤 관련 단계를 식별 하는 검토. 예를 들어 "X 유전자"의 가역 downregulation를 가능 하 게 마우스를, 섹션 1, 3, 및 4의 완료는 프로토콜 아래. 표 1 은 또한 원격 제어 시스템의 필요한 구성 요소를 요약합니다.

원하는 식 변화억압만활성화만억제 및 활성화
프로토콜의 관련 섹션1, 3-42-41-4
대상 유전자에 필요한 원격 제어 시퀀스Repron ("억압 intron"; 12 대칭 락 연산자와 부분 토끼 beta globin intron)Tet operator(s)Repron와 Tet operator(s)
원격 제어 시퀀스 위치Intron발기인Intron 및 발기인
활성 제/진압 원하는 제어에 필요한LacIGY 진압rtTA M2 활성 제LacIGY 진압 및 rtTA M2 활성 제
규제 LigandsIPTGDoxycyclineIPTG 또는 Doxycycline

표 1: 원격 제어 구성 요소 개요.

프로토콜

모든 동물 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 남부 캘리포니아 대학과 밴 Andel 연구소 및 가이드 준수의 승인을 실시 했다 15건강 국가 학회.

1. 원격 제어에 의해 억압에 대 한 관심사의 유전자를 수정

  1. Repron 시퀀스의 삽입에 대 한 관심사의 유전자의 5' 끝으로 transcriptionally 불활성 intron 식별 아래의 지침을 사용 하 여 ("담당자ression 하루에"; 12 대칭 락 연산자 플러스 부분 토끼 beta globin intron). 관심, 유전자에 대 한 대체 발기인의 인식 하 고 제어할 수 transcript(s)에 따르면 intron 선택 (즉 모든 성적 증명서 또는 하나에 의해 공유 하는 intron 원하는 사본에).
    참고: 유전자는 intron 없이 또는 3' 끝으로 그들에 대 한 Repron 시퀀스에 삽입 발기인 (리, 외.10 세부 절차에 대 한 참조).
    1. 관심사의 유전자를 위한 게놈 시퀀스를 가져옵니다.
      1. UCSC 게놈 브라우저16,17을 이동한 게놈 탭 아래 현재는 마우스 게놈 (마우스 GRCm38/mm10 간행물의 때에)의 최신 초안을 선택 합니다.
      2. 유전자에 대 한 성적표를 보려면 검색창에 이름이 나 관심사의 유전자의 기호를 입력 합니다. 이동을 클릭 합니다.
      3. 관심사의 유전자에 대 한 원하는 사본 이체를 선택 합니다.
      4. (이전에 선택한 대 본의 기호는 어두운 상자에 있을 것입니다)의 사본 변종 옆 유전자 기호를 클릭 하십시오.
      5. 시퀀스와 도구 및 데이터베이스 링크를 배너에서 게놈 시퀀스 링크를 클릭 합니다.
      6. 시퀀스 검색 영역 옵션을 선택만 Exons (5' UTR, CD, 및 3' UTR), Introns, 그리고 기본 유전자 당 하나의 FASTA 기록. 시퀀스 서식 옵션에 대 한 대문자, 소문자에 다른 모든 것 들에 Exons 및 마스크 n 반복 (반복 시퀀스를 숨기려고)를 선택 합니다. 제출을 클릭 합니다.
      7. 보존 위-이 순서를 저장 하 고 문서 또는 주석을 추가할 수 있는 프로그램에서 서식을 소문자.
    2. CpG 섬, 유전자 규제 기능 영역을 알 수 있습니다의 중단을 하지 마십시오.
      참고: 5' intron Repron 시퀀스의 삽입 하는 것이 좋습니다만, 첫 번째 intron 포함 될 수 있습니다 CpG 섬 (이 단계에서 시험 되는) transcriptional 규제 요소 또는 증강 요소 (단계 1.1.4에서에서 검사), Repron에 대 한 피할 수 있는 삽입입니다.
      1. UCSC 게놈 브라우저의 표현과 규제 기치 아래 CpG 섬 트랙 표시 를 선택 하 고 새로 고침을 클릭 합니다.
      2. 5' introns에 확대, 각 CpG 섬 (에 표시 된 녹색 경우 간행물의 때에), 클릭 하 고 이 기능에 대 한 보기 DNA를 선택 합니다.
      3. 마스크 n 반복을 선택한 후 DNA를 얻을 CpG 섬 시퀀스를 선택 합니다.
      4. 원래 시퀀스 파일이 시퀀스를 중첩 하 고 가능한 유전자 규정 하는 기능으로 인해 피하기 위해 intronic 영역으로 이러한 주석을.
    3. 그들은 규제 기능을 가질 경우에 비 코딩 RNAs, 중단을 하지 마십시오.
      1. UCSC 게놈 브라우저의 유전자와 유전자 예측 기치 아래 GENCODE (합) 트랙 표시 를 선택 하 고 새로 고침을 클릭 합니다.
      2. 5' introns에 확대, (있는 경우 간행물의 때에 녹색으로 표시), 각 비 코딩 RNA에 클릭 하 고 그것의 염색체 좌표를 클릭 하 여 각각에 대 한 DNA 순서를 얻을.
      3. 보기 드롭다운 메뉴에서 DNA, 선택 하 고 마스크 n 반복을 클릭 합니다. 다음 DNA를 얻을클릭 하십시오.
      4. 원래 시퀀스 파일이 시퀀스를 중첩 하 고 가능한 유전자 규정 하는 기능으로 인해 피하기 위해 intronic 영역으로 이러한 주석을.
    4. 관심, H3K4me1, H3K27ac, 등 DNase의 tissue(s)에 증강 서명 intronic 영역 방지 나 CTCF 바인딩 뿐만 아니라 과민성18,,1920,21, 22,23을 반복 하는 증강 인자 조절 사이트.
      1. 인코딩 데이터베이스24,25를 이동한 실험 아이콘을 선택 합니다.
      2. 분석 결과 형식에 대 한 칩 seq 또는 DNase seq선택 하 고 다른 범주 (유기 체, Biosample 유형, 등) 설계 될 셀에 채웁니다.
      3. 기능 선택 후 파란색, 무늬 위로 마우스를 이동 하 고 있는 목록으로 보기 결과 나타난 (간행물의 때에 맨 왼쪽 그림)를 선택 합니다.
      4. H3K4me1, H3K27ac, DNase의 대상에 대 한 데이터 집합을 선택, 그리고 CTCF 설계 될 셀을 가장 밀접 하 게 일치 하는.
      5. 파일 섹션으로 스크롤하여 각 관련 데이터 집합 내에서 그 mm10 (또는 최신 게놈 버전) 확인 및 UCSC 선택 되 고 시각화 단추를 클릭 합니다.
      6. 지금에서 UCSC 게놈 브라우저 및 관심사의 유전자에 대 한 5' introns에 확대, 클릭 각 H3K4me1, H3K27ac, DNase I, 및 그들의 각각 주석된 피크 트랙 CTCF 피크.
      7. 염색체의 좌표를 클릭 하 여 각 피크 지역에 대 한 DNA 순서를 얻을.
      8. 보기 드롭다운 메뉴에서 DNA, 선택 하 고 마스크 n 반복을 클릭 합니다. 다음 DNA를 얻을클릭 하십시오.
      9. 원래 시퀀스 파일이 시퀀스를 중첩 하 고 가능한 유전자 규정 하는 기능으로 인해 피하기 위해 intronic 영역으로 이러한 주석을.
    5. 합의 exons의 적절 한 접합을 방해할 수 없습니다 시퀀스 접합의 중단을 하지 마십시오.
      참고: 비록 접합에 필요한 시퀀스는 주로 국한 한 intron의 5' 끝에 약 6 기지에26 와 약 60 기지에 3' 끝27, 그것은 큰 intron, 이들에서 상당히 넓은 여백에 대 한 허용을 선택 하는 것이 좋습니다. 접합 영향의 가능성을 최소화 하기 위해 합의 영역입니다. SVM BPfinder28, 같은 intron 분석 도구를 사용 하 여 잠재적인 스플라이스 시퀀스의 더 철저 한 분석에 대 한 것이 좋습니다.
  2. 확인 후 (로 exemplified Dnmt1 에 대 한 보충 데이터에서), 위의 기준에 부합 한 온라인 sgRNA을 사용 하 여 시퀀스 화면 intronic 지역 높은 특이성을 가진 지역에 있는 sgRNA를 식별 하는 도구를 디자인 하 고 예측 효율성 점수입니다.
    1. CRISPOR29등 선택의 온라인 sgRNA 디자인 도구를 이동 합니다.
    2. 관심 intronic 영역의 시퀀스를 입력 하 고 관련 참조 게놈을 지정 원하는 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM)을 선택 합니다. 제출을 클릭 합니다.
    3. 특이성 평가 점수에 의해 예측 된 sgRNAs를 정렬 하 고 예측된 고효율29점수는 하나 이상의 sgRNAs를 선택 합니다.
      1. 선택 사항: 효과적인 sgRNA를 사용 하 여 가능성을 최대화 하려면 먼저 여러 상위 점수 sgRNAs의 분열 효율성을 테스트 하는 체 외 분석 결과30, 고 vivo에서 가장 효율적인 sgRNA와 함께 진행.
  3. 피트 (Pronuclear 주입 기반 대상 Transgenesis) 보충 그림 1A, B, 사이트31 컷 sgRNA에 해당 하는 60-자료 상 동 팔에 의해 양쪽에 형벌에 exemplified로 패드 시퀀스를 방문을 포함 하는 DNA 템플렛 디자인 .
    참고: 상륙 패드 두 heterotypic loxP 사이트 (JT15 및 Lox2272)를 포함 하 고 2 단계 접근; 통해 큰 시퀀스의 타겟된 삽입 가능 이 삽입의 연결 암호 결합 사이트를 만들지 않는 다는 것을 반드시 하십시오. 또는 전략에는 배아 줄기 세포 (ESC)-기반된 노크-Repron 시퀀스를 직접 삽입을 사용할 수 있습니다.
  4. 상륙 패드는 sgRNA, Cas9, 단백질과 단일 가닥 DNA (ssDNA) 서식 파일을 준비 하 고 설립된 프로토콜32,33에 따르면 (B6C3F1/J 쥐 또는 다른 원하는 스트레인)에서 수정 된 계란에 microinject.
  5. 상륙 패드 노크에 있는 쥐에 대 한 화면.
    1. PCR 뇌관 보완 설계 genomic 소재 시에 있지만 상 동 팔 보충 그림 1C에서 Dnmt1 에 대 한 증명으로 대상 지역 밖에. 뇌관을 디자인할 때 반복적인 게놈 시퀀스를 하지 마십시오.
    2. 34설립된 프로토콜 따르면 쥐의 꼬리 클립에서 DNA를 추출 합니다.
    3. PCR를 사용 하 고 젤 전기 이동 법 상륙 패드 삽입으로 마우스를 식별.
    4. 노크에서 성공적으로 되었는지 PCR 제품을 시퀀싱을 확인 합니다.
      참고: 원하지 않는 큰 삭제 및 재배열 CRISPR/Cas935, 그래서 주의 대상에서 편집에 대 한 심사 진행35,,3637전에 권고에 의해 도입 될 수 있습니다.
  6. ICre mRNA38 , JTZ17 및 Lox2272 재조합 사이트31,,3940, 에 의해 형벌 Repron 시퀀스를 포함 하는 유전자 변형 플라스 미드 microinject 상륙 패드 마우스에서 수정 된 알을 사용 하 여, 에 따라 41 설립 방법38,,4243.
  7. Repron 삽입와 쥐에 대 한 화면입니다.
    1. PCR 뇌관 Repron 삽입 외부 genomic 소재 시에 무료 디자인. 뇌관을 디자인할 때 반복적인 게놈 시퀀스를 하지 마십시오.
    2. 34설립된 프로토콜 따르면 쥐의 꼬리 클립에서 DNA를 추출 합니다.
    3. PCR를 사용 하 고 젤 전기 이동 법 Repron 삽입 쥐를 식별.
    4. 노크에 성공한 PCR 제품을 시퀀싱 하 여 확인 합니다.

2. 원격 제어에 의해 upregulation에 대 한 관심사의 유전자를 수정

  1. 아래 지침을 사용 하 여, tet 연산자 시퀀스의 삽입 시 발기인 기능 교란 것은 관심사의 유전자의 발기인에 영역을 식별 합니다. 관심, 유전자에 대 한 대체 발기인의 인식 하 고 제어 하는 transcript(s)에 따라 발기인을 선택 (모든 성적 증명서 또는 하나에 의해 공유 즉 발기인 원하는 사본에).
    1. 관심의 발기인에 대 한 게놈 시퀀스를 가져옵니다.
      1. UCSC 게놈 브라우저16,17을 이동한 게놈 탭 아래 현재는 마우스 게놈 (마우스 GRCm38/mm10 간행물의 때에)의 최신 초안을 선택 합니다.
      2. 유전자에 대 한 성적표를 보려면 검색창에 이름이 나 관심사의 유전자의 기호를 입력 합니다. 이동을 클릭 합니다.
      3. 관심사의 유전자에 대 한 원하는 사본 이체를 선택 합니다.
      4. (이전에 선택한 대 본의 유전자 기호는 어두운 상자에 있을 것입니다)의 사본 변종 옆 유전자 기호를 클릭 하십시오.
      5. 시퀀스와 도구 및 데이터베이스 링크를 배너에서 게놈 시퀀스 링크를 클릭 합니다.
      6. 시퀀스 검색 영역 옵션을 1000으로 발기인/업스트림 기초만 선택 합니다. 시퀀스 서식 옵션을 (반복 시퀀스를 숨기려고) 마스크 n 반복 을 선택 합니다. 제출을 클릭 합니다.
      7. 문서 또는 주석을 달 수 있습니다 프로그램에이 발기인 순서를 저장 합니다.
    2. 이러한 시퀀스 방해로 putative 전사 인자 바인딩 사이트의 무료 선택 영역 내 인 성 유전자 발현을 변경할 수 있습니다.
      1. UCSC 게놈 브라우저를 이동 하 고 마우스 게놈의 최신 버전을 엽니다.
      2. 매핑 및 시퀀싱 배너 위에 허브를 추적을 선택 합니다.
      3. Mm10 JASPAR 2018 TFBS (또는 최신 JASPAR 버전)의 허브 이름 옆을 클릭 합니다.
      4. 유전자에 대 한 성적표를 보려면 검색창에 이름이 나 관심사의 유전자의 기호를 입력 합니다. 이동을 클릭 합니다.
      5. 관심사의 유전자에 대 한 원하는 사본 이체를 선택 합니다.
      6. JASPAR 2018 TFBS 배너 스크롤 하 고 뭉 개 버려같은 트랙에 대 한 원하는 보기 옵션을 선택 하려면 드롭다운 화살표를 클릭 합니다. 새로 고침을 클릭 합니다.
      7. 관심, 유전자의 프로모터 영역으로 확대 및 JASPAR 트랙에 따라 전사 인자 바인딩 사이트의 무료입니다 (또는 상대적으로 무료) 영역을 식별. 이 지역의 염색체 좌표를 기록 합니다.
      8. 검색 표시줄에 입력 하 고 이동을 클릭 하 여 이러한 염색체 좌표의 게놈 시퀀스를 얻을. 보기 드롭다운 메뉴에서 DNA, 선택 하 고 마스크 n 반복을 클릭 합니다. 다음 DNA를 얻을클릭 하십시오.
      9. 원래 시퀀스 파일이 시퀀스를 중첩 하 고 이상적인 발기인 녹음 방송 요인 바인딩의 부족 때문에 대상 영역으로 이러한 주석을.
    3. 이러한 시퀀스 내에서 상류 그러나 관심사의 유전자의 녹음 방송 시작 위치 근처 perturbable 발기인 영역을 선택 합니다.
      참고: 녹음 시작 사이트 방해 발기인 활동의 기회를 증가 시킬 수 있습니다 가까이 너무 있는 삽입 하지만 삽입을 너무 멀리 upregulation의 수준을 줄일 수 있습니다. (토론 참조)10테스트 녹음 방송 시작 위치의 상류 약 200 basepairs 두 발기인의 강력한 upregulation 귀착되는 tet 연산자 시퀀스 삽입.
  2. 화면 높은 특이성 및 예상된 효율 점수는 sgRNA 지역에서 식별 하는 온라인 sgRNA 디자인 도구를 사용 하 여 선택한 모터 지역.
    1. CRISPOR29등 선택의 온라인 sgRNA 디자인 도구를 이동 합니다.
    2. 관심 영역의 시퀀스를 입력 하 고 관련 참조 게놈을 지정 원하는 Protospacer 인접 한 모티브 (PAM)을 선택 합니다. 제출을 클릭 합니다.
    3. 특이성 평가 점수에 의해 예측 된 sgRNAs를 정렬 하 고 예측된 고효율29점수는 하나 이상의 sgRNAs를 선택 합니다.
      1. 선택 사항: 효과적인 sgRNA를 사용 하 여 가능성을 최대화 하려면 먼저 여러 sgRNAs의 분열 효율성을 테스트 하는 체 외 분석 결과30, 고 vivo에서 가장 효율적인 sgRNA와 함께 진행.
  3. Tet 연산자 sgRNA 사이트31,33컷에 해당 하는 60-자료 상 동 팔에 의해 양쪽에 형벌을 포함 하는 DNA 템플렛 디자인.
    참고: tet 연산자의 수는 사용자 정의; 2 ~ 4 tet 연산자 시퀀스에 삽입 이전 효과적 이기 위하여 보였다 그러나 원리에서 더 많은 연산자는 높은 식 구동을 위한 바람직한. 또는, tet 연산자를 삽입 하는 ESC 기반 노크에서 전략을 사용할 수 있습니다.
    1. 옵션: 실험적인 증거 제안된 수정 하지 관심사의 유전자의 내 생 transcriptional 활동 방해 가능성이 것입니다에 대 한 복제 (예: pGL3-Basic), 반딧불 luciferase 벡터에 설계 된 발기인 순서 및 luciferase 분석 결과 사용 하 여 원래 발기인에의 효능을 비교 합니다.
  4. sgRNA, Cas9, 단백질과 tet 연산자 시퀀스를 포함 하는 ssDNA 서식 파일을 준비 하 고 설립된 프로토콜32,33에 따르면 (B6C3F1/J 쥐 또는 다른 원하는 스트레인)에서 수정 된 계란에 microinject.
    참고: 반복 시퀀스를 합성의 복잡성 때문에 생체 외 녹음/반전 녹음 방송 기반 접근 것이 좋습니다 ssDNA 템플릿을 이중 가닥 DNA (dsDNA) 플라스 미드44에서 합성. 또는, dsDNA 서식 파일 microinjection, 사용 될 수 있습니다 하지만 노크 효율 감소45있을 수 있습니다.
  5. Tet 연산자의 노크에 있는 쥐에 대 한 화면.
    1. PCR 뇌관 homology 무기에 의해 타겟 지역 이외의 게놈 소재 시에 무료 디자인. 뇌관을 디자인할 때 반복적인 게놈 시퀀스를 하지 마십시오.
    2. 34설립된 프로토콜 따르면 쥐의 꼬리 클립에서 DNA를 추출 합니다.
    3. PCR를 사용 하 고 젤 전기 이동 법 tet 연산자의 삽입으로 마우스를 식별 하기 위해.
    4. 노크에서 성공적으로 되었는지 PCR 제품을 시퀀싱을 확인 합니다.
      참고: 원하지 않는 큰 삭제 및 재배열 CRISPR/Cas935, 그래서 주의 대상에서 편집에 대 한 심사 진행35,,3637전에 권고에 의해 도입 될 수 있습니다.

3. 활성 제 및 진압 표현 마우스 개발

  1. 관심의 tissue(s) 또는 셀 형식에 대 한 견고 하 게 표현 발기인을 식별 합니다.
    참고: 문학 검색 및 조직의 특정 발기인 데이터베이스46 수 있습니다 이러한 발기인을 식별 하는 데 유용.
  2. 제공된 된 락 진압 또는 유전자 변형 구조를 생성 하기 위해 원하는 발기인의 하류 tet 활성 시퀀스를 놓습니다.
  3. 표준 유전자 변형 절차42,,4347를 사용 하 여 유전자 변형 마우스 줄을 생성 합니다. 또는, 사이트 transgenesis 접근 위치 효과 방지 하 고 단일 복사 transgene 삽입31,48를 허용 사용할 수 있습니다.
  4. 창시자, 전파 하 고 식 패턴 및 각 창시자의 자손에 transgene의 수준을 결정 합니다. 더 번 식에 대 한 의도 조직 파트에 강력한 식으로 라인을 선택 합니다.
    1. Wildtype 마우스 설립자를 사육 한다.
    2. 활성 제 및 진압의 삽입 감지 PCR 뇌관 디자인.
    3. 설립된 프로토콜34에 따라 자손의 꼬리 클립에서 DNA를 추출 합니다.
    4. PCR를 사용 하 고 젤 삽입으로 마우스를 식별 하기 위해 전기 이동 법.
    5. PCR 제품의 연속 transgene 삽입을 확인 합니다.
    6. 전달 유전자 변형 라인.
    7. 각 줄에서 몇 강아지를 희생 하 고 수집 qRT-PCR, immunohistochemistry, 및 대상 조직 파트에 관심사의 유전자/단백질의 식을 분석 하 서 부 럽에 대 한 관심의 조직.
    8. 섹션 4에서에서 사용에 대 한 관심의 조직에 강한 식으로 라인을 선택 합니다.

4. 조작 vivo에서 유전자 발현

  1. 설립된 번 식 사례49에 따라 섹션 3에서에서 유전자 변형 생쥐와 관심 (섹션 1 또는 2)의 수정 된 유전자를 가진 쥐를 사육 한다. 최대 식 제어에 대 한 수정 된 대립 유전자에 대 한 homozygosity 쥐를 사육 한다.
  2. 귀선 또는 대상 유전자의 진압의 조정, 식용 수에서 IPTG을 관리 합니다.
    1. 치료 복용량의 범위 중 적절 한 유전자 형 및 컨트롤의 마우스 사용 IPTG의 복용량을 실험적으로 확인 하려면 (권장 범위 시작: 0-400 mM IPTG) 적어도 1 주50,51. 치료 그룹, 당 적어도 3 쥐를 포함 하 고 연령과 성별 계획된 미래 실험에 가장 관련이 있는 마우스의 선택 합니다. 참고: 쥐의 번 식 쌍13, 원하는 경우 자손에 게 IPTG의 발달 노출을 제공 하 IPTG 물으로 대우 될 수 있다 또는 마우스 치료 출산 후 언제 든 지 시작할 수 있습니다.
      1. 관리, 하루에 원하는 대량의 IPTG 멸 균 증류수에 녹이 고 5 분 또는 완전히 녹아 때까지 저 어 바 저 어.
      2. 랩 호 일, 병 그리고 빛 보호 병에 IPTG 물 관리. 일주일에 두 번을 교체 합니다. 0 mM IPTG 받는 쥐 물 같은 소스를 제공 합니다.
      3. 적어도 1 주일 후에 마우스를 희생 하 고 qRT-PCR, immunohistochemistry, 및 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 대상 tissue(s)에 관심사의 유전자의 표현 분석.
      4. Wildtype 컨트롤의 관심사의 유전자의 식을 복원 복용량을 식별 하 고이 복용량을 사용 하 여 미래 실험에서 유전자의 정상적인 표현 달성.
  3. 유전자 upregulation의 유도, 식단에 Doxycycline (Dox)을 관리 합니다.
    1. 실험적 Dox 관리 하의 농도 확인, 치료를 적절 한 유전자 형 및 Dox 범위 농도 중 하나는 컨트롤의 마우스 (권장 범위 시작: 0-5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) 적어도 한 주52 53, 치료 그룹 당 최소한 3 쥐를 포함 하 여. Dox 포함 된 마우스 음식 상업용 공급 업체에서 구입.
      참고: 마우스의 쌍을 사육 Dox 음식54,55, 원하는 경우 자손에 Dox의 발달 노출을 제공 하 대우 될 수 있다 또는 마우스 치료 출산 후 언제 든 지 시작할 수 있습니다.
    2. 주 당 한 번 다이어트를 교체 합니다. Dox 무료 음식 받는 쥐 같은 기본 다이어트를 제공 합니다.
    3. 적어도 1 주일 후에 마우스를 희생 하 고 qRT-PCR, immunohistochemistry, 및 서쪽에 게 더 럽 히기을 사용 하 여 대상 tissue(s)에 관심사의 유전자의 표현 분석.
    4. 관심사의 유전자의 표현을 원하는 수준으로 끌어올리고 복용량을 식별 하 고 미래 실험에서 유전자의 overexpression를 달성 하기 위해이 복용량을 사용 하 여.

결과

원격 제어 시스템의 억제 기능까지 두 가지 다른 방법에서 입증 되었습니다. 첫 번째 접근 방법에서 락 진압 바인딩 사이트 Dnmt1 유전자의 내 생 발기인에 삽입 되었다. 이 프로토콜에 의해 추천 되는 두 번째 방법에서는 진압 바인딩 사이트 다운스트림 intron 삽입 하 여 발기인 기능에 영향을 미치는 잠재적인 위험을 피하기 위해 그리고 그로 인하여 원격 제어의 응용 프로그램을 단순화 하기 위해 삽입 된 시스템입니다. 두 방법 모두 결과 성공적인 억압 (그림 2A, B 및 그림 3A-C)10. Dnmt1 표현 했다 발기인 기반 방식 (그림 2A)를 사용 하 여 관계가 없는 레벨의 15%를 억 누른 다. 이 꽉 억압 복용량 의존 방식으로 생쥐 IPTG (그림 2A) 다양 한 양의 치료 하 여 반전 했다. 관찰 된 Dnmt1 억압 immunostaining (그림 2B) 의해 단백질 수준에서 유효 했다. 우리는 Dnmt1사이 Dnmt1 식의 어떤 눈에 띄는 차이 관찰 하지 않았다+ + 및 Dnmt1LO/LO 쥐, lac 연산자 삽입 우리의 정상적인 발기인을 방해 하지 했다 확인 기능10. 연산자에서 90% 억제 보다는 intron 기반 접근 달성 전사 신장 (그림 3A, B)10을 약하게 하 여 녹음 방송 시작 위치의 여러 kilobases를 하류에 위치 해 있습니다. Intron 기반 이렇게 했다 7 추가 강력한 발기인 (그림 3C)에 추가 검증 됩니다. 변함없이 꽉 억압 모든 테스트 발기인에서 달성 되었다. 잔여 식 수준 및 발기인의 강점 사이의 상관 관계가 관찰 되었다 (테스트 우리의 억압 intron 기반 시스템의 억압 용량 모든 강력한 발기인의 transcriptional 힘 초과 제안 그림 3 C)입니다.

원격 제어 시스템의 기능을 vivo에서 upregulation Dnmt1 유전자에도 시연 했다. 우리 Dnmt1 발기인, 락 연산자 시퀀스, 함께 upregulation 또는 단백질은 어떤 이펙터에 따라 downregulation 있도록에 tet 연산자의 두 복사본을 소개 했다. 강력한 upregulation 및 2 개의 크기 순서 (10 ~ 650%), 가까운 Dnmt1 식의 downregulation ESCs 포함 하는 수정 된 생 Dnmt1 대립 유전자 (Dnmt1LGT)(그림 4)에 달성 했다10 . 두 규정 되었고 완전히 가역 IPTG Dox 치료로 유도할 수 있는 각각(그림 4). 우리는 다음 원격 제어 시스템의 생체 조건 upregulation 기능을 테스트 하려면 마우스 생식에 Dnmt1LGT 수정 도입. 반면 마음에 없는 감지 upregulation (그림 4B)7관찰 되었다 Dnmt1 의 강한 upregulation 간, 비장, 신장에서 관찰 되었다. Dnmt1 의 세포 주기 의존적인 식 패턴 및 심장에 증식 세포의 부족이 관찰10,56기반이 될 수 있습니다 됩니다. 그것은 바인딩 사이트의 수 또는 활성 제 식 수준을 증가 하 여이 한계를 극복할 수 있는 여부를 볼 수 있다.

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그림 2 : Vivo에서 LacIGY 진압에 의해 Dnmt1 의 억압. Dnmt1 발기인, 또는 LacIGY의 표현 없이 삽입 락 사업자 (LO)와 (A) 마우스 IPTG의 다양 한 복용량으로 대우 했다. qRT-PCR 분석 Dnmt1 식의 IPTG 치료에 의해 vivo에서 Dnmt1 억압의 복용량 의존 반전을 보여 줍니다. 각 막대는 다른 마우스에서 데이터를 나타냅니다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). 쥐의 저 승 지하실에 Dnmt1 단백질의 (B) Immunostaining 3 주 동안 또는 160mm IPTG 없이 식 수를 제공합니다. 이 그림 리 외.10에서 수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3 : Vivo에서 및 원격 제어 시스템에 의해 다양 한 발기인의 생체 외에서 억압. (A) Repron 시퀀스 (R *)의 초기 버전 Villin mKate2 유전자 변형 마우스 (VilmKate2)에 Villin 발기인의 하류는 intron에 삽입 했다. qRT-PCR 분석 또는 LacIGY 진압 없이 쥐의 소장에 mKate2 식의 표시 됩니다. 각 막대는 다른 마우스에서 데이터를 나타냅니다. (B) 공초점 mKate2 이미지 LacIGY 식 없이 소장. (C) 6 대칭 락 연산자 (S) 다양 한 발기인 및 luciferase 기자 사이 삽입 했다. 기자 (50 ng/96 잘 접시에 잘)와 진압 플라스 미드 정도 1:1 어 금 니 비율에서 NIH/3T3 세포로 소개 되었다. Luciferase 값 transfection 후 평가 24 h를 했다. 이러한 생체 외에서 데이터 LacIGY에 luciferase 식의 %를 나타내는-비 기능 LacI (NFlacI) 표현 들을 기준으로 셀을 표현. T-테스트 는 통계적 의미를 확인 하기 위해 사용 되었다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01. 이 그림 리 외.10에서 수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4 : 다운-또는 생체 외에서 그리고 vivo에서 Dnmt1 식의 upregulation. (A) 완벽 한 원격 제어 시스템 electroporation 유전자를 대상으로 접근 하 여 교양된 ESCs에 설계 되었습니다. 최대한 활성화 IPTG와 Dox 처리에 의해 달성 하는 동안 최대한 억압 Dnmt1 식의 치료와 함께 달성 했다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01 (웰 치의 t-테스트). (B) 원격 제어 시스템, 원격 제어 마우스에서 다양 한 조직에서 Dnmt1 단백질의 immunostaining에 의해 증명으로 Dnmt1 의 vivo에서 활성화 LGT 대립 유전자 발기인 수정을 락 연산자와 tet 활성 바인딩 사이트를 포함 하도록 Dnmt1 를 나타냅니다. 마우스는 한 달 동안 정상 또는 포함 하는 Dox 다이어트 (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate)로 치료 했다. 이 그림 리 외.10에서 수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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보충 그림 1 : Murine Dnmt1 intron 1에 패드 삽입 방문의 예. 패드 삽입, Quadros 외. (2015)31에서 적응을 착륙을 위한 DNA 템플렛의 (A) 회로도 Heterotypic loxP 사이트, JT15 및 Lox2272, 짧은 공백 시퀀스 (sp)으로 구분 되며 60-bp 대상 게놈 지역에 동종은 DNA의 각 측면에 어귀. 대 한 다음 sgRNA를 사용 하 여 Dnmt1 intron에 패드 삽입 (B) DNA 샘플 템플릿: CTAGTACCACTCCTGTACCG (이 역 가닥을 대상). 선택한 intronic 지역 bioinformatically 단계 1.1, 정보 그리고는 sgRNA CRISPOR29를 사용 하 여 확인 되었다. (C) 상륙 패드의 삽입을 평가 하기 위한 PCR 뇌관 디자인의 예입니다. PCR 뇌관 생 Dnmt1통합 확인 하 상 동 팔 서식 파일의 외부 설계 되었습니다. Wildtype PCR amplicon는 213 혈압; 삽입 시 291 된다 bp. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

중요 한 단계 및 원격 제어 시스템의 잠재적인 제한 대상 유전자 발현에 영향을 주지 않고 진압 활성 바인딩 사이트의 삽입과 관련 된 도전 이다. 우리의 원래 억압 접근 Dnmt1 유전자에 적용 한 대로 삽입 발기인의 transcriptionally 중요 한 지역 내의 락 진압 바인딩 사이트의 참여. 발기인 기능에 영향을 미치는 이렇게 위험을 줄이기 위해 원격 제어 시스템의 일반적인 적용 개선, 우리는 억압 intron 기반 접근 방식을 개발. 우리의 향상 된 락 시스템의 힘 단단히 우리 연산자 위치에서 테스트 하는 모든 강한 발기인의 녹음을 억 누르다 수 수백 전사의 여러 kilobases 하류 시작 사이트 (그림 3A-C) 10. 중요 한 것은, 억압의 레벨 발기인 (그림 3A-C)10의 transcriptional 강점의 독립 했다. 이 우리의 억압 intron 기반 시스템의 억압 용량 초과 테스트 발기인의 transcriptional 강도 나왔다. 이 intron 기반 접근에 그것 억압은 두 가지 구성 요소, 녹음 방송 신장 기계와 락 repressors57사이 물리적 간섭을 통해 중재 높습니다. 이 간단한 억압 메커니즘 및 intron 기반 방법의 검증 된 견고성 렌더링 수 있습니다이 이렇게 다른 유전자, 조직, 및 유기 체에 일반적으로 적용 가능한.

원격 제어 시스템에 의해 upregulation 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 수 반하는 대상 유전자 발기인에 근접에 있을 transactivator 바인딩 시퀀스를 필요 합니다. 그러나, 우리는 바인딩 시퀀스 위치 transcriptionally 중요 영역 바깥에 있을 수 있습니다 발견. Dnmt1 및 EF1α 발기인 튼튼하게 upregulated tet 연산자에서 몇 백 기초 상류 녹음 방송 시작 사이트10의 위치 했다. 이 편안한 제약은 크게는 transactivator의 부재에서 대상 유전자의 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 줄여줍니다. 시퀀스의 바인딩 수를 증가 하거나 강한 transactivators의 사용 더 멀리 녹음 시작 사이트 사이트에서 upregulation 함으로써 위험을 줄일 수 합니다.

우리의 원격 제어 시스템은 우아한 제어 수준, 타이밍, 및 내 생 유전자 발현, 테스트는 표현 형의 반전 기능 및 다른 식 수준에 의해 쉽게 달성 되지 않은 결과 대 한 수의 위치 현재 생체 조건 유전자 식 제어 기술입니다. 우리를 포함 한 대부분 유전자 표정 분석 식 값 중 상당한 변이가 있습니다 셀의 모집단의 평균을 나타내는 중요 하다. 이 분화 또는 apoptosis58등 세포 의사 결정 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 진 식 제어의 정밀도 가능성이 향상 될 수 더 추가 유전자 회로 엔지니어링59, 비록 우리의 현재 시스템의 관찰된 힘 많은 생물학 문맥에서 유전자 기능의 유용한 조사를 허용할 것 이다. 또한, 대상 특이성의 고차 연산자 시퀀스 뿐만 아니라 포유류와 규제 구성 요소60의 원래 종 사이의 큰 진화 거리의 복잡성 때문에 예상 된다. 또한, repressors의 활성 유전자 변형 마우스 라인 개발 하 고 어떤 내 생 유전자에 대 한 고용 될 수 있습니다. 예를 들어 기존 tet transactivator 마우스 모델에서 원하는 마우스 조직 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 적응 될 수 있다. 우리는 최근 여러 조직 유형 Hipp11 소재 시48에 lacIGY 유전자를 도입 하 여 기존 Cre 라인와 결합 될 때에 우리의 향상 된 락 진압의 강력한 조직 관련 표현 구동할 수 유전자 변형 라인 개발 Lox-정지-Lox 요소 (미 출판)의 통제. 이 라인 것 실질적으로 원격 제어 시스템의 조직-특정 응용 프로그램을 촉진 한다.

원격 제어 시스템에 의해 유전자 upregulation 현재 유도할 수 있는 유전자 변형 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그것은 그것은 활용 내 생 로커 스 선의 여러 유전자 변형, 삽입의 위치 효과 대 한 테스트 생성이 필요 하지 않습니다. 또한,이 방식은 강한 초기 식으로 유전자의 upregulation 적합 이미 강력한 발기인에서 향상 하기 때문에 기존의 유전자 변형 모델 최소한의 바이러스 성 발기인에 의존 하는 반면. 마지막으로, 조직 특이성, 세포 주기 제어 및 대상 유전자의 이체를 접합 수 있습니다 유지 upregulation에 우리의 접근 방식에 의해 타고 난 cis등 자연의 요소를 유지로-규제 요소. CRISPR/Ca-중재 하는 유전자를 대상으로 기술의 출현 크게 다양 한 모델 시스템에서이 기술의 응용 프로그램을 촉진 한다.

공개

PWL 과학 자문 보드의 AnchorDx 및 Progenity, i n c.에서 제공

감사의 말

우리는 늦은 박사 하 이디 Scrable (메이 요 클리닉, 로체스터, 미네소타), 포유류 lacI 유전자 구성의 그녀의 관대 한 선물에 대 한 감사 Villin 발기인을 제공 하기 위한 박사 다니엘 Louvard (인 퀴리, 파리, 프랑스) 및 박사로 리 잭슨-Grusby (어린이 병원, 보스턴, MA)이 기술 개발의 초기 단계에 그녀의 기여 금을 위해. 우리는 그들의 지원을 생성 하는 유전자 변형 및 녹아웃 쥐에 대 한 박사 낸시 우와 박사 로버트 Maxson 감사입니다. 우리 유용한 토론 레어 실험실의 구성원 감사 하 고 지원 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, 및 P.W.L. R01 CA212374와 N.A.V.S에 1F31CA213897-01A1]에 의해 지원 되었다.

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