Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt ein Modell zur Untersuchung des Herzumbaus nach Myokard-Kryoverletzung bei Mäusen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von Tiermodellen ist für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für das akute Koronarsyndrom und seine Komplikationen unerlässlich. In diesem Artikel zeigen wir ein murines Kryoverletzungsinfarktmodell, das präzise Infarktgrößen mit hoher Reproduzierbarkeit und Reproduzierbarkeit erzeugt. Kurz gesagt, nach Intubation und Sternotomie des Tieres wird das Herz aus dem Thorax gehoben. Die Sonde eines handgeführten flüssigen Stickstoffzufuhrsystems wird auf die Myokardwand aufgetragen, um Kryoverletzungen auszulösen. Beeinträchtigte ventrikuläre Funktion und elektrische Leitung können mit Echokardiographie oder optischer Kartierung überwacht werden. Die transmuraale myokardiale Umgestaltung des Infarktbereichs ist durch Kollagenablagerung und den Verlust von Kardiomyozyten gekennzeichnet. Im Vergleich zu anderen Modellen (z.B. LAD-Ligation) nutzt dieses Modell ein handgehaltenes Flüssigstickstoff-Liefersystem, um einheitlichere Infarktgrößen zu erzeugen.

Einleitung

Akutes Koronarsyndrom (ACS) ist die häufigste Todesursache in der westlichen Welt^1,2. Akute Okklusion der Herzkranzgefäße führt zur Aktivierung der ischämischen Kaskade und Nekrose des betroffenen Herzgewebes³. Beschädigtes Myokard wird nach und nach durch nicht-kontraktiles Narbengewebe ersetzt, das sich klinisch als Herzinsuffizienz^{manifestiert 4,5}. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Behandlung von ACS, die Prävalenz von ACS und ACS-bedingte Herzinsuffizienz steigt, und therapeutische Optionen sind begrenzt^6,7. Daher ist die Entwicklung von Tiermodellen zur Untersuchung von ACS und seinen Komplikationen von immensem Interesse.

Bis heute ist das am weitesten verbreitete Tiermodell zur Untersuchung von ACS- und ACS-induziertem Myokardumbau die Ligation der linken absteigenden Herzkranzgefäße (LAD). Ligation des LAD führt zu akuter Ischämie des Myokards, ähnlich wie beim menschlichen Myokardgewebe während ACS.  Inkonsistente Infarktgrößen bleiben jedoch die Achillesferse der LAD-Liga. Chirurgische Variation und anatomische Variabilität des LAD führen zu inkonsistenten Infarktgrößen und behindern die Reproduzierbarkeit und Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens^8,9,10. Darüber hinaus hat die LAD-Ligation eine hohe intra- und postchirurgische Sterblichkeit. Trotz der jüngsten Bemühungen, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Sterblichkeit zu senken^11,12, sind immer noch eine große Anzahl von Tieren erforderlich, um Anti-Remodeling-Therapien richtig zu bewerten.

Alternative Modelle von ACS wurden in den letzten Jahren vorgeschlagen und untersucht, einschließlich Hochfrequenz¹³, thermische¹⁴ oder kryogene Verletzungen^15,16,17,18. Aktuelle Kryoverletzungsmethoden wenden einen metallenen Stab vorgekühlt in flüssigem Stickstoff an, um das Herzgewebe des Subjekts zu schädigen^15,16. Dieses Verfahren muss jedoch mehrmals wiederholt werden, um eine ausreichende Infarktgröße zu erzeugen. Durch die hohe Leitfähigkeit und geringe Wärmekapazität der Stange im Vergleich zum Gewebe erwärmt sich die Sonde schnell und das Gewebe wird heterogen gekühlt (und damit infarktiert). Um diese Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier in einem Kryoinfarktmodell unter Verwendung eines handgehaltenen flüssigen Stickstoffabgabesystems. Dieses Modell ist reproduzierbar, einfach durchzuführen und lässt sich schnell und zuverlässig etablieren. Es entsteht eine reproduzierbare transmurale Infarktläsion unabhängig von der koronaren Anatomie, die schließlich zu Herzinsuffizienz führt. Diese Methode eignet sich besonders zur Untersuchung des Umbauprozesses zur Bewertung neuartiger therapeutischer pharmakologischer und gewebetechnischer Strategien.

Protokoll

Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Prinzipien von Labortieren, der vom Institut für Labortierressourcen erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, humane Pflege erhalten. Alle Tierprotokolle wurden von der zuständigen lokalen Behörde (Dem Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der University of California San Francisco (UCSF) genehmigt.

1. Tierpflege

1. Erhalten Sie Mäuse im Alter von 14 Wochen mit einem Gewicht von ca. 27 g (z. B. vom Institut für Labortiere).
   HINWEIS: FÜR diesen Artikel werden BALB/c-Mäuse verwendet.
2. Halten Sie Mäuse unter konventionellen Bedingungen in belüfteten Schränken, füttern sie Standard-Mäuse Chow und autoklaviertes Wasser ad libitum.

2. Mausvorbereitung

1. Verwenden Sie eine Induktionskammer, um die Maus mit Isofluran (3,5%) zu beästhesieren.
2. Entfernen Sie das Haar über Brust und Hals mit einem Haarschneider.
3. Legen Sie die Maus in supine Position auf einem beheizten Pad und halten Sie Anästhesie mit einer Gesichtsmaske, die Mund und Nase der Maus bedeckt.
4. Überprüfen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hinterfüße und den Schwanz kneifen, um das Fehlen von Reflexen zu überprüfen.
5. Subkutanes Buprenorphin (0,03 mg/kg) zur Analgesie injizieren.
6. Verteilen Sie die Hinter- und Vorderbeine und fixieren Sie ihre Position mit Klebeband.
7. Mit Povidon-Jod, desinfizieren Sie den rasierten Bereich, gefolgt von Schrubben mit 80% Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
8. Verwenden Sie eine kleine Schere, um einen Mittellinien-Hautschnitt vom unteren Drittel des Brustbeins bis zum Kinn zu machen.
9. Verwenden Sie gekrümmte Zangen und trennen Sie vorsichtig die Muskeln um den Hals, um die Luftröhre freizulegen.
10. Verwenden Sie eine Mikroschere, um eine Tracheotomie zwischen dem zweiten und dritten Knorpelringen durchzuführen.
11. Stellen Sie das Beatmungsgerät auf eine Belüftungsfrequenz von 110/min bei einem Gezeitenvolumen von 0,5 ml ein.
12. Entfernen Sie die Gesichtsmaske und legen Sie eine Mitschleifkanüle (20 G), die mit dem Beatmungsgerät verbunden ist, in die Luftröhre ein. Belüften Sie das Tier.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lüftungskanüle nicht zu tief eingesetzt wird, indem Sie die bilaterale Lungenbelüftung bestätigen.
13. Verwenden Sie Kautery, um den rechten Pectoralis-Muskel von seinem sternalen Ursprung zwischen der dritten und siebten Rippe zu lösen.
14. Verwenden Sie seitlich abgewinkelte Federschere, um die vierte bis sechste Rippe so nah wie möglich am Brustbein zu schneiden.
15. Cauterize dieBrustarterie, wenn Blutungen sichtbar sind.
16. Isofluran auf 2,5% verringern.
17. Sezieren Sie das zugrunde liegende Bindegewebe, um einen klaren Blick in die Brusthöhle zu erhalten.
18. Verwenden Sie stumpfe Zange, um das Perikard zu öffnen und das Herz freizulegen.
19. Verwenden Sie einen Mini Goldstein Retraktor, um die Rippen zu verteilen und halten Sie die Brusthöhle offen.
20. Heben Sie das Herz aus der Brusthöhle mit einer stumpfen Stange.
21. Verringern Sie die Spannung des Retraktors, um die Brustöffnung zu reduzieren und das Herz vor dem Zurückfallen zu bewahren.
22. Die Kryoprobe (3 mm Durchmesser) für 10 s vorkühlen.
23. Tragen Sie die Kryoprobe auf die vordere linke Ventrikelwand auf und frieren Sie 10 s ein, um einen linksventrikulären Kryoverletzungsinfarkt zu erzeugen.
    HINWEIS: Die Kryoprobe kann je nach wissenschaftlicher Frage und Bedarf auf verschiedene Herzwände aufgebracht werden.
24. Bewässern Sie die Kryosonde mit Raumtemperatur-Salin, um die Sonde von der linken ventrikulären Wand zu lösen.
25. Verwenden Sie den Retraktor, um die Brustöffnung zu vergrößern.
26. Bringen Sie das Herz vorsichtig mit einer stumpfen Stange in die Brusthöhle zurück.
27. Entfernen Sie den Retraktor und verbinden Sie die Sternotomie mit einem einzigen Knoten mit 6-0 Naht.
28. Schließen Sie die Brusthöhle mit 6-0 Laufnaht. Verwenden Sie eine 10 ml Spritze, um die verbleibende Luft aus der Brust zu evakuieren, bevor Sie den Knoten binden.
29. Passen Sie die Haut an der kaudalen Kante an und verschließen Sie sie bis zur Stelle der Trachealöffnung mit laufender Naht (5-0).
30. Set Isoflurane auf 1,5% und warten, bis das Tier spontane Atmung erhält.
31. Entfernen Sie den Luftröhrenkatheter und tragen Sie die Gesichtsmaske erneut auf den Mund und die Nase des Tieres auf, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
32. Schließen Sie den Trachealschnitt mit einem 8-0 naht.
33. Positionieren Sie die ventralen Nackenmuskeln wieder in ihre Position, um die Luftröhre zu bedecken.
34. Vervollständigen Sie die Hautnaht.
35. Fügen Sie Metamizol in das Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) für Schmerzanalgesie für 3 Tage und überwachen Sie das Tier täglich.
    HINWEIS: Der Beobachtungszeitraum für dieses Modell beträgt 8 Wochen. Achten Sie darauf, die Richtlinien Ihrer Institution in Bezug auf Analgesie-Regime zu befolgen.

Ergebnisse

Das Kryoverletzungsinfarktmodell eignet sich zur Untersuchung von ACS und seinen Komplikationen. Niedrige Sterblichkeitsraten und effiziente postoperative Genesung sind in diesem Modell zu sehen. Kryoverletzung induzierte Myokardschäden führen zu reduzierter Herzfunktion, elektrischer Entkopplung und transmuraalem Umbau.

Echokardiographie kann verwendet werden, um die Herzfunktion nicht invivo zu überwachen. In kryoverletzten Herzen zeigt die Echokardiographie eine signifikant reduzierte Au...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt ein Maus-Kryoverletzungsmodell zur Untersuchung von ACS und verwandten pharmakologischen und therapeutischen Optionen.

Der wichtigste Schritt ist die Anwendung der Kryoprobe auf das Herzgewebe. Die Kontaktdauer muss streng kontrolliert werden, um die optimale Infarktgröße zu erhalten und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Eine längere Abkühlung des Myokards führt zu übergroßen Infarkten oder ventrikulärer Senforation. Im Gegensatz dazu erzeugt verk?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S