Un modèle cryo-blessure pour étudier l'infarctus du myocarde chez la souris

Résumé

Cet article démontre un modèle pour étudier le remodelage cardiaque après cryoinjury myocardique chez les souris.

Résumé

L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le syndrome coronarien aigu et ses complications. Dans cet article, nous démontrons un modèle d'infarctus de cryoblessure de murine qui génère des tailles précises d'infarctus avec la reproductibilité et la replicabilité élevées. En bref, après l'intubation et la sénotomie de l'animal, le cœur est soulevé du thorax. La sonde d'un système portatif de livraison d'azote liquide est appliquée sur la paroi myocardique pour induire la cryoblessure. La fonction ventriculaire altérée et la conduction électrique peuvent être surveillées avec l'échocardiographie ou la cartographie optique. Le remodelage myocardique transmural de la zone infarctus est caractérisé par le dépôt de collagène et la perte des cardiomyocytes. Comparativement à d'autres modèles (p. ex., la ligature laLaD), ce modèle utilise un système portatif de distribution d'azote liquide pour générer des infarctus plus uniformes.

Introduction

Le syndrome coronarien aigu (SCA) est la principale cause de décès dans le monde occidental^1,2. L'occlusion aigue des artères coronaires mène à l'activation de la cascade ischémique et de la nécrose du tissu cardiaque affecté^3. Le myocarde endommagé est progressivement remplacé par le tissu cicatriciel non contractile, qui se manifeste cliniquement comme une insuffisance cardiaque^4,5. Malgré les progrès récents dans le traitement de l'ACS, la prévalence de l'ACS et de l'insuffisance cardiaque liée à l'ACS est en hausse, et les options thérapeutiques sont limitées^6,7. Par conséquent, le développement de modèles animaux pour étudier l'ACS et ses complications est d'un immense intérêt.

À ce jour, le modèle animal le plus largement utilisé pour étudier le remodelage myocardique induit par l'ACS et l'ACS est la ligature de l'artère coronaire descendante gauche (LAD). La lignation de la LAD mène à l'ischémie aigue du myocarde, semblable au tissu myocardique humain pendant ACS.  Cependant, les tailles incohérentes d'infarctus restent le talon d'Achille de la ligature de LAD. La variation chirurgicale et la variabilité anatomique de la LAD conduisent à des tailles infarctus incohérentes et entravent la reproductibilité et la reproductibilité de cette procédure^8,9,10. En outre, la ligature de LAD a une mortalité intra- et post-chirurgicale élevée. Malgré les efforts récents pour améliorer la reproductibilité et réduire la mortalité^11,12, un grand nombre d'animaux sont encore nécessaires pour évaluer correctement les thérapies anti-remodelage.

D'autres modèles d'ACS ont été proposés et étudiés au cours des dernières années, y compris la radiofréquence¹³, thermique¹⁴ ou les blessures cryogéniques^15,16,17,18. Les méthodes actuelles de cryo-blessure appliquent une tige de métal pré-refroidie dans l'azote liquide pour endommager le tissu cardiaque du sujet^15,16. Cependant, cette procédure doit être répétée plusieurs fois pour générer une taille infarctus suffisante. En raison de la conductivité élevée et de la faible capacité de chaleur de la tige par rapport au tissu, la sonde se réchauffe rapidement, et le tissu est refroidi (et donc infarctus) hétérogènement. Pour surmonter ces limitations, nous décrivons ici un modèle de cryoinfarction utilisant un système portatif de livraison d'azote liquide. Ce modèle est reproductible, facile à exécuter et peut être établi rapidement et de manière fiable. Une lésion infarctus transmurale reproductible indépendante de l'anatomie coronaire est produite, qui mène par la suite à l'échec cardiaque. Cette méthode est particulièrement appropriée pour étudier le processus de remodelage pour l'évaluation de nouvelles stratégies pharmacologiques thérapeutiques et basées sur l'ingénierie tissulaire.

Protocole

Les animaux ont reçu des soins humains conformément au Guide des principes des animaux de laboratoire, préparé par l'Institut des ressources animales de laboratoire et publié par les National Institutes of Health. Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par l'autorité locale responsable (University of California San Francisco (UCSF) Institutional Animal Care and Use Committee).

1. Soins aux animaux

1. Obtenir des souris à l'âge de 14 semaines pesant environ 27 g (p. ex., de l'Institut des animaux de laboratoire).
   REMARQUE: Les souris BALB/c sont utilisées pour cet article.
2. Gardez les souris dans des conditions conventionnelles dans des armoires ventilées, en leur donnant des souris standard chow et de l'eau autoclaved ad libitum.

2. Préparation de la souris

1. Utilisez une chambre d'induction pour anesthésier la souris avec de l'isoflurane (3,5 %).
2. Enlever les cheveux sur la poitrine et le cou à l'aide d'un taille-cheveux.
3. Placez la souris en position de supine sur un coussinet chauffé et maintenez l'anesthésie avec un masque couvrant la bouche et le nez de la souris.
4. Vérifiez la profondeur suffisante de l'anesthésie en pinçant les pattes postérieures et la queue pour vérifier l'absence de réflexes.
5. Injecter de la buprénorphine sous-cutanée (0,03 mg/kg) pour l'analgésie.
6. Étendre les membres postérieurs et avant et fixer leur position à l'aide de ruban adhésif.
7. Avec de l'iode de povidone, désinfecter la zone rasée, puis frotter avec 80% d'éthanol. Répétez cette étape deux fois.
8. Utilisez un petit ciseaux pour faire une incision de la peau médiane du tiers inférieur du sternum au menton.
9. Utilisez des forceps incurvés et séparez soigneusement les muscles autour du cou pour exposer la trachée.
10. Utilisez un micro-ciseaux pour effectuer une trachéotomie entre les deuxième et troisième anneaux de cartilage.
11. Régler le ventilateur à une fréquence de ventilation de 110/min avec un volume de marée de 0,5 ml.
12. Retirez le masque facial et insérez une canule en plastique (20 G), reliée au ventilateur, dans la trachée. Ventiler l'animal.
    REMARQUE : Assurez-vous que la canule de ventilation n'est pas insérée trop profondément en confirmant la ventilation pulmonaire bilatérale.
13. Utilisez la cautérisation pour détacher le muscle pectoralis droit de son origine sternale entre les troisième et septième côtes.
14. Utilisez des ciseaux de ressort inclinés latéralement pour couper les quatrième à sixième côtes aussi près que possible du sternum.
15. Cauteriser l'artèremammaire, si le saignement est visible.
16. Diminution isoflurane à 2,5%.
17. Disséquer le tissu conjonctif sous-jacent pour obtenir une vue claire dans la cavité thoracique.
18. Utilisez des forceps émoussés pour ouvrir le péricarde et exposer le cœur.
19. Utilisez un mini rétracteur Goldstein pour écarter les côtes et garder la cavité thoracique ouverte.
20. Soulevez le cœur de la cavité thoracique à l'aide d'une tige émoussée.
21. Diminuer la tension du rétracteur pour réduire l'ouverture de la poitrine et pour empêcher le cœur de retomber.
22. Prérefroidir la cryosonde (3 mm de diamètre) pendant 10 s.
23. Appliquer la cryosonde sur la paroi ventriculaire gauche antérieure et congeler pendant 10 s pour générer un infarctus de cryo-blessure ventriculaire gauche.
    REMARQUE : La cryosonde peut être appliquée à différentes parois de coeur selon la question scientifique et le besoin.
24. Irriguer la cryosonde avec la saline à température ambiante pour détacher la sonde de la paroi ventriculaire gauche.
25. Utilisez le rétracteur pour agrandir l'ouverture de la poitrine.
26. Remettre doucement le cœur dans la cavité thoracique à l'aide d'une tige émoussée.
27. Retirez le rétracteur et connectez la sténotomie avec un seul noeud en utilisant la suture 6-0.
28. Fermer la cavité thoracique à l'aide de 6-0 suture en cours d'exécution. Utilisez une seringue de 10 ml pour évacuer l'air restant de la poitrine avant de lier le noeud.
29. Adapter la peau au bord caudal et la suturer jusqu'au point de l'ouverture trachéale avec la suture en cours d'exécution (5-0).
30. Définir isoflurane à 1,5% et attendre jusqu'à ce que l'animal gagne respiration spontanée.
31. Retirez le cathéter trachéal et réappliquez le masque facial sur la bouche et le nez des animaux pour maintenir l'anesthésie.
32. Fermer l'incision trachéale avec un 8-0 suture.
33. Repositionnez les muscles ventral du cou à leur position pour couvrir la trachée.
34. Complétez la suture de la peau.
35. Ajouter le métamétzole à l'eau potable (50 mg de métamétazole par 100 ml) pour l'analgésie de la douleur pendant 3 jours et surveiller l'animal tous les jours.
    REMARQUE : La période d'observation de ce modèle est de 8 semaines. Assurez-vous de suivre les directives de votre établissement concernant le régime d'analgésie.

Résultats

Le modèle d'infarctus de cryomutilation est approprié pour étudier ACS et ses complications. De faibles taux de mortalité et un rétablissement postchirurgical efficace sont observés dans ce modèle. Les dommages myocardiques induits de cryoblessure mènent à la fonction cardiaque réduite, au découplage électrique, et au remodelage transmural.

L'échocardiographie peut être utilisée pour surveiller la fonction cardiaque non invasive in vivo. Dans les cœurs cryo-blessés, l'échocar...

Discussion

Cet article décrit un modèle de cryomutilation de souris pour étudier ACS et les options pharmacologiques et thérapeutiques connexes.

L'étape la plus cruciale est l'application de la cryosonde sur le tissu cardiaque. La durée du contact doit être étroitement contrôlée afin d'obtenir la taille optimale de l'infarctus et de garantir des résultats reproductibles. Un refroidissement prolongé du myocarde entraînera des infarctus surdimensionnés ou une perforation ventriculaire. En rev...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S