Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

Resumo

Este artigo demonstra um modelo para estudar o remodelamento cardíaco após o cryoinjúria miocárdico nos ratos.

Resumo

O uso de modelos animais é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a Síndrome Coronariana Aguda e suas complicações. Neste artigo, Nós demonstramos um modelo murino do infarto cryoinjela que gerencie tamanhos precisos do enfarte com reprodutibilidade e replicability elevados. Em suma, após a intubação e esternotomia do animal, o coração é levantado do tórax. A sonda de um sistema de entrega de nitrogênio líquido portátil é aplicada na parede miocárdica para induzir crioferimento. A função ventricular prejudicada e a condução elétrica podem ser monitoradas com ecocardiografia ou mapeamento óptico. A remodelação miocárdica transmural da área infartada caracteriza-se por deposição de colágeno e perda de cardiomiócitos. Comparado a outros modelos (por exemplo, Lad-ligadura), este modelo utiliza um sistema handheld da entrega do nitrogênio líquido para gerar uns tamanhos mais uniformes do infarto.

Introdução

A Síndrome Coronariana Aguda (SCA) é a principal causa de morte no mundo ocidental^1,2. A oclusão aguda das artérias coronárias leva à ativação da cascata isquêmica e necrose do tecido cardíaco afetado³. O miocárdio danificado é substituído gradualmente pelo tecido não-contractile da cicatriz, que manifestz clìnica como uma falha de coração^4,5. Apesar dos avanços recentes no tratamento de ACS, a predominância de ACS e de insuficiência cardíaca ACS-relacionada está levantando-se, e as opções terapêuticas são limitadas^6,7. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais para o estudo da SCA e suas complicações são de imenso interesse.

Até o momento, o modelo animal mais utilizado para o estudo da SCA e a remodelação miocárdica induzida pela SCA é a ligadura da artéria coronária descendente esquerda (LAD). A ligadura do LAD conduz à isquemia aguda do myocardium, similar ao tecido miocárdico humano durante ACS.  Entretanto, os tamanhos inconsistentes do infarto permanecem o calcanhar de Aquiles da ligadura do Lad. A variação cirúrgica e a variabilidade anatômica do rapaz levam a tamanhos de infarto inconsistentes e dificultam a reprodutibilidade e a replicabilidade desse procedimento^8,9,10. Além, a ligadura do LAD tem uma mortalidade intra e postsurgical elevada. Apesar de esforços recentes para melhorar a reprodutibilidade e reduzir a mortalidade^11,12, um grande número de animais ainda são necessários para avaliar adequadamente as terapias antiremodeladoras.

Modelos alternativos de ACS têm sido propostos e estudados nos últimos anos, incluindo rádio-frequência¹³, térmico¹⁴ ou lesões criogênicas^15,16,17,18. Os métodos de criolesão atual aplicam uma haste metálica pré-resfriada em nitrogênio líquido para danificar o tecido cardíaco do indivíduo^15,16. Entretanto, este procedimento precisa de ser repetido diversas vezes para gerar um tamanho suficiente do infarto. Devido à alta condutividade e baixa capacidade de calor da haste em comparação com o tecido, a sonda aquece rapidamente, e o tecido é resfriado (e, portanto, infartado) de forma heterogênea. Para superar estas limitações, nós descrevemos nisto um modelo do cryoinfarction que utiliza um sistema de entrega de nitrogênio líquido à mão. Este modelo é reprodutível, fácil de executar e pode ser estabelecido de forma rápida e confiável. Uma lesão transmural reprodutível do infarto independente da anatomia coronária é gerada, que conduz eventualmente à falha cardíaca. Este método é especialmente adequado para estudar o processo de remodelação para a avaliação de novas estratégias terapêuticas farmacológicas e baseadas em engenharia tecidual.

Protocolo

Os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com o guia para os princípios de animais de laboratório, elaborado pelo Instituto de recursos animais de laboratório, e publicados pelos institutos nacionais de saúde. Todos os protocolos de animais foram aprovados pela autoridade local responsável (a Universidade da Califórnia San Francisco (UCSF) institucional de cuidados e uso do animal Committee).

1. cuidados com os animais

1. Obter camundongos com a idade de 14 semanas pesando aproximadamente 27 g (por exemplo, do Instituto de animais de laboratório).
   Observação: camundongos BALB/c são usados para este artigo.
2. Mantenha os ratos condições convencionais em armários ventilados, alimentando-os ratos padrão Chow e água autoclavada ad libitum.

2. preparação do mouse

1. Use uma câmara de indução para anestesiizar o rato com isoflurano (3,5%).
2. Retire o cabelo sobre o peito e pescoço usando um aparador de cabelo.
3. Coloc o rato na posição supina em uma almofada aquecida e mantenha a anestesia com uma boca da coberta do facemask e o nariz do rato.
4. Verifique se há profundidade suficiente de anestesia por beliscar os pés traseiros e cauda para verificar a ausência de reflexos.
5. Injetar buprenorfina subcutânea (0, 3 mg/kg) para analgesia.
6. Espalhe os membros traseiros e dianteiros e fixe sua posição usando a fita.
7. Com iodo povidona, desinfete a área raspada, seguida de esfregando com 80% de etanol. Repita este passo duas vezes.
8. Use um pequeno Scissor para fazer uma incisão da pele do midline do terço mais baixo do esterno ao queixo.
9. Use fórceps curvo e separe cuidadosamente os músculos ao redor do pescoço para expor a traquéia.
10. Use uma Microtesoura para realizar uma traqueotomia entre a segunda e terceira cartilagem anéis.
11. Ajuste o ventilador a uma frequência de ventilação de 110/min com um volume corrente de 0,5 mL.
12. Retire o facemask e insira uma cânula plástica (20 G), conectada ao ventilador, na traquéia. Ventilar o animal.
    Nota: Assegure-se de que a cânula de ventilação não esteja muito profunda, confirmando a ventilação pulmonar bilateral.
13. Use cauterização para separar o músculo peitoral direito de sua origem esternal entre a terceira e sétima costelas.
14. Use as tesouras angulares laterais da mola para cortar o quarto a sexto reforços tão perto como possível ao esterno.
15. Cauterize a artéria mamária, se o sangramento é visível.
16. Diminua o isoflurano para 2,5%.
17. Dissecar o tecido conjuntivo subjacente para obter uma visão clara da cavidade torácica.
18. Use fórceps sem corte para abrir o pericárdio e expor o coração.
19. Use um mini retractor Goldstein para espalhar as costelas e manter a cavidade torácica aberta.
20. Levante o coração da cavidade torácica com uma haste sem corte.
21. Diminua a tensão do retractor para reduzir a abertura do peito e para manter o coração de cair para trás.
22. Precool o criossonda (diâmetro de 3 milímetros) para 10 s.
23. Aplique o criossonda na parede anterior do ventrículo esquerdo e congele-se por 10 s para gerar um infarct ventricular esquerdo do Cryo-ferimento.
    Nota: o criossonda pode ser aplicado às paredes diferentes do coração dependendo em cima da pergunta e da necessidade científicas.
24. Irrigar o criossonda com a temperatura ambiente salina para separar a sonda da parede ventricular esquerda.
25. Use o retractor para ampliar a abertura do peito.
26. Retorne delicadamente o coração à cavidade torácica com uma haste sem corte.
27. Retire o retractor e conecte a esternotomia com um único nó usando 6-0 de sutura.
28. Feche a cavidade torácica usando 6-0 sutura running. Use uma seringa de 10 mL para evacuar qualquer ar restante do tórax antes de amarrar o nó.
29. Adaptar a pele na borda caudal e suturá-la até o ponto da abertura traqueal com sutura em funcionamento (5-0).
30. Defina isoflurano para 1,5% e aguarde até que o animal ganhe respiração espontânea.
31. Retire o cateter traqueal e reaplique o facemask na boca e no nariz dos animais para manter a anestesia.
32. Fechar a incisão traqueal com uma 8-0 Sutura.
33. Reposicione os músculos do pescoço ventral de volta à sua posição para cobrir a traquéia.
34. Complete a sutura cutânea.
35. Adicione metamizol à água potável (50 mg de metamizol por 100 mL) para analgesia de dor durante 3 dias e monitore o animal diariamente.
    Nota: o período de observação para este modelo é de 8 semanas. Certifique-se de seguir as diretrizes da sua instituição sobre o regime de analgesia.

Resultados

O modelo de infarto crioferimento é adequado para o estudo da SCA e suas complicações. As baixas taxas de mortalidade e a recuperação postsurgical eficiente são vistas neste modelo. O dano miocárdico induzido por crioferimentos leva à redução da função cardíaca, desacoplamento elétrico e remodelação transmural.

A Ecocardiografia pode ser usada para monitorar a função cardíaca não invasora in vivo. Em corações crioferidos, a Ecocardiografia demonstra fração de ejeção s...

Discussão

Este artigo descreve um modelo crioferimento do rato para investigar ACS e opções farmacológicas e terapêuticas relacionadas.

A etapa a mais crucial é a aplicação do criossonda no tecido cardíaco. A duração do contato deve ser controlada firmemente a fim obter o tamanho óptimo do infarto e garantir resultados reprodutíveis. O resfriamento prolongado do miocárdio levará a infartos superdimensionados ou perfuração ventricular. Em contraste, o tempo de resfriamento reduzido gera l...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S