Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

Riepilogo

Questo articolo dimostra un modello per studiare il rimodellamento cardiaco dopo la crioinfortuni miocardica nei topi.

Abstract

L'uso di modelli animali è essenziale per sviluppare nuove strategie terapeutiche per la sindrome coronarica acuta e le sue complicazioni. In questo articolo, dimostriamo un modello infarto crioinfortunio criologico murino che genera dimensioni infarto precise con elevata riproducibilità e replicabilità. In breve, dopo l'intubazione e la sternotomia dell'animale, il cuore viene sollevato dal torace. La sonda di un sistema di erogazione di azoto liquido portatile viene applicata sulla parete miocardiale per indurre criolesioni. La funzione ventricolare alterata e la conduzione elettrica possono essere monitorate con ecocardiografia o mappatura ottica. Il rimodellamento miocardico transmurale dell'area infartuata è caratterizzato dalla deposizione di collagene e dalla perdita di cardiomiociti. Rispetto ad altri modelli (ad esempio, la legatura LAD), questo modello utilizza un sistema di somministrazione di azoto liquido portatile per generare dimensioni infarto più uniformi.

Introduzione

La sindrome coronarica acuta (ACS) è la principale causa di morte nel mondo occidentale^1,2. L'occlusione acuta delle arterie coronarie porta all'attivazione della cascata ischemica e della necrosi del tessuto cardiaco interessato³. Il miocardio danneggiato viene gradualmente sostituito dal tessuto cicatriziale non contrattuale, che manifesta clinicamente come insufficienza cardiaca^4,5. Nonostante i recenti progressi nel trattamento dell'ACS, la prevalenza di ACS e insufficienza cardiaca correlata all'ACS è in aumento e le opzioni terapeutiche sono limitate^6,7. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali per studiare ACS e le sue complicazioni sono di immenso interesse.

Ad oggi, il modello animale più utilizzato per studiare il rimodellamento miocardico indotto da ACS e ACS è la legatura dell'arteria coronaria discendente sinistra (LAD). La legatura del LAD porta ad ischemia acuta del miocardio, simile al tessuto miocardico umano durante l'ACS.  Tuttavia, le dimensioni infarto incoerenti rimangono il tallone d'Achille della legatura LAD. La variazione chirurgica e la variabilità anatomica del LAD portano a dimensioni incoerenti degli infarti e ostacolano la riproducibilità e la replicabilità di questa procedura^8,9,10. Inoltre, la legatura LAD ha un'alta mortalità intra e postchirurgica. Nonostante i recenti sforzi per migliorare la riproducibilità e ridurre la mortalità^11,12, un gran numero di animali sono ancora necessari per valutare correttamente le terapie anti-rimodellamento.

Modelli alternativi di ACS sono stati proposti e studiati negli ultimi anni, tra cui radiofrequenza¹³,¹⁴ termiche o lesioni criogeniche^15,16,17,18. Gli attuali metodi di crioinfortuni applicare un'asta metallica pre-raffreddata in azoto liquido per danneggiare il tessuto cardiaco del soggetto^15,16. Tuttavia, questa procedura deve essere ripetuta più volte per generare una dimensione infarto sufficiente. A causa dell'elevata conduttività e della bassa capacità di calore dell'asta rispetto al tessuto, la sonda si riscalda rapidamente e il tessuto viene raffreddato (e quindi infarcerato) eterogeneamente. Per superare queste limitazioni, descriviamo qui un modello di criointazione utilizzando un sistema portatile di somministrazione di azoto liquido. Questo modello è riproducibile, facile da eseguire e può essere stabilito velocemente e in modo affidabile. Viene generata una lesione infarto riproducebile indipendente dall'anatomia coronarica, che alla fine porta a insufficienza cardiaca. Questo metodo è particolarmente adatto per studiare il processo di rimodellamento per la valutazione di nuove strategie terapeutiche basate sull'ingegneria farmacologica e tissutale.

Protocollo

Gli animali hanno ricevuto cure umane nel rispetto della Guida per i Principi degli Animali da Laboratorio, preparata dall'Istituto di Risorse Animali da Laboratorio, e pubblicata dai National Institutes of Health. Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dall'autorità locale competente (comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California (UCSF).

1. Cura degli animali

1. Ottenere topi all'età di 14 settimane del peso di circa 27 g (ad esempio, dall'Istituto di Animali da laboratorio).
   NOTA: i mouse BALB/c vengono utilizzati per questo articolo.
2. Tenere i topi in condizioni convenzionali in armadi ventilati, alimentando loro cilici standard e acqua autoclaved ad libitum.

2. Preparazione del mouse

1. Utilizzare una camera di induzione per anantenere il topo con isoflurane (3,5%).
2. Rimuovere i capelli sul petto e sul collo con un trimmer per capelli.
3. Posizionare il mouse in posizione supina su un pad riscaldato e mantenere l'anestesia con una maschera facciale che copre bocca e naso del mouse.
4. Controllare la profondità sufficiente di anestesia pizzicando i piedi posteriori e la coda per verificare l'assenza di riflessi.
5. Iniettare buprenorphina sottocutanea (0,03 mg/kg) per l'analgesia.
6. Stendere gli arti posteriori e anteriori e fissare la loro posizione utilizzando il nastro.
7. Con iodio povidone, disinfettare l'area rasata, seguita da strofinamento con 80% di etanolo. Ripetere questo passaggio due volte.
8. Utilizzare una piccola forbice per fare un'incisione della pelle mediana dal terzo inferiore dello sterno al mento.
9. Utilizzare pinze curve e separare con attenzione i muscoli intorno al collo per esporre la trachea.
10. Utilizzare una micro forbice per eseguire una tracheotomia tra il secondo e il terzo anello della cartilagine.
11. Impostare il ventilatore su una frequenza di ventilazione di 110/min con un volume di marea di 0,5 mL.
12. Rimuovere la maschera facciale e inserire una cannula di plastica (20 G), collegata al ventilatore, nella trachea. Ventilate l'animale.
    NOTA: Assicurarsi che la cannula di ventilazione non sia inserita troppo in profondità confermando la ventilazione polmonare bilaterale.
13. Utilizzare il cauterio per staccare il muscolo pettorale destro dalla sua origine sternale tra la terza e la settima costola.
14. Utilizzare forbici a molla angolate laterali per tagliare la quarta o la sesta costola il più vicino possibile allo sterno.
15. Cauterizzare l'arteriamammaria, se il sanguinamento è visibile.
16. Diminuire l'isoflurane al 2,5%.
17. Disseta il tessuto connettivo alla base per ottenere una visione chiara nella cavità toracica.
18. Utilizzare pinze smussate per aprire il pericardio ed esporre il cuore.
19. Utilizzare un mini retrattore Goldstein per stendere le costole e mantenere aperta la cavità toracica.
20. Sollevare il cuore dalla cavità toracica con un'asta smussata.
21. Diminuire la tensione del retrattore per ridurre l'apertura del torace e per evitare che il cuore ricada.
22. Precool la criosonia (3 mm di diametro) per 10 s.
23. Applicare la criosonia sulla parete anteriore del ventricolo sinistro e congelare per 10 s per generare un infarto crioferico ventricolare sinistro.
    NOTA: Il criosone può essere applicato a diverse pareti del cuore a seconda della domanda scientifica e delle necessità.
24. Irrigare la criosonia con salina a temperatura ambiente per staccare la sonda dalla parete ventricolare sinistra.
25. Utilizzare il retrattore per ingrandire l'apertura del torace.
26. Riportare delicatamente il cuore alla cavità toracica con un'asta smussata.
27. Rimuovere il retrattore e collegare la sternotomia con un singolo nodo utilizzando 6-0 sutura.
28. Chiudere la cavità toracica con sutura in esecuzione 6-0. Utilizzare una siringa da 10 mL per evacuare l'aria rimanente dal petto prima di legare il nodo.
29. Adattare la pelle sul bordo caudale e suturarla fino al punto dell'apertura tracheale con sutura in esecuzione (5-0).
30. Impostare isoflurane all'1,5% e attendere che l'animale acquisisca la respirazione spontanea.
31. Rimuovere il catetere tracheale e riapplicare la maschera facciale sulla bocca e sul naso dell'animale per mantenere l'anestesia.
32. Chiudere l'incisione tracheale con un 8-0 sutura.
33. Riposizionare i muscoli ventrali del collo nella loro posizione per coprire la trachea.
34. Completare la sutura della pelle.
35. Aggiungere metamizolo all'acqua potabile (50 mg di metamizolo per 100 mL) per l'analgesia del dolore per 3 giorni e monitorare l'animale ogni giorno.
    NOTA: il periodo di osservazione per questo modello è di 8 settimane. Assicurati di seguire le linee guida della tua istituzione in materia di regime di analgesia.

Risultati

Il modello infarto crioinfortuni è adatto per studiare ACS e le sue complicazioni. In questo modello si riscontrano bassi tassi di mortalità e un efficiente recupero postchirurgico. Il crioinfortuni ha indotto danni miocardici che portano a una ridotta funzione cardiaca, allo saccoppiamento elettrico e al rimodellamento transmurale.

L'ecocardiografia può essere utilizzata per monitorare la funzione cardiaca in modo non invasivo in vivo. Nei cuori crioferiti, l'ecocardiografia dimostra una r...

Discussione

Questo articolo descrive un modello di crioglione del topo per studiare ACS e le relative opzioni farmacologiche e terapeutiche.

Il passo più importante è l'applicazione della criosonia sul tessuto cardiaco. La durata del contatto deve essere strettamente controllata per ottenere la dimensione ottimale dell'infarto e per garantire risultati riproducibili. Il raffreddamento prolungato del miocardio porterà a infarti di grandi dimensioni o perforazione ventricolare. Al contrario, il tempo di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S