Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

Zusammenfassung

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Zusammenfassung

Da der Zellstoffwechsel ein wichtiger Regulator der hämatopoetischen Stammzell-Selbsterneuerung (HSC) ist, wurden die verschiedenen Rollen, die die Mitochondrien bei der hämatopoetischen Homöostase spielen, von HSC-Forschern ausgiebig untersucht. Die mitochondrialen Aktivitätsniveaus spiegeln sich in ihren Membranpotentialen wider, die durch zellpermeant kationische Farbstoffe wie TMRM (Tetramethylrhodamin, Methylester) gemessen werden können. Die Fähigkeit von Effluxpumpen, diese Farbstoffe aus Zellen zu extrudieren, kann jedoch ihre Nützlichkeit einschränken. Die resultierende Messverzerrung ist besonders kritisch bei der Beurteilung von HSCs, da xenobiotische Transporter in HSCs eine höhere Expression und Aktivität aufweisen als in differenzierten Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Verapamil, einen Efflux-Pumpeninhibitor, verwendet, um mehrere Knochenmarkpopulationen genau zu messen. Die daraus resultierende Hemmung der Pumpenaktivität erhöht nachweislich die TMRM-Intensität in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), während sie in reifen Fraktionen relativ unverändert bleibt. Dies unterstreicht die Aufmerksamkeit auf die Farb-Efflux-Aktivität, die erforderlich ist, wenn m-abhängige Farbstoffe verwendet werden, und wie geschrieben und visualisiert, kann dieses Protokoll verwendet werden, um entweder verschiedene Populationen innerhalb des Knochenmarks oder die gleiche Population genau zu vergleichen. über verschiedene experimentelle Modelle hinweg.

Einleitung

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind sich selbst erneuernd, multipotent und in der Lage, alle Zellen des Blutes^1,2zu entsteht. Der Zellstoffwechsel ist ein wichtiger Regulator der HSC-Wartung, zusammen mit Transkriptionsfaktoren, intrinsischen Signalen und der Mikroumgebung^3,4,5. Die richtige Kontrolle der mitochondrialen Funktion und Qualität ist daher entscheidend für die HSC-Wartung^6,7.

Mitochondriales Membranpotential ist ein wichtiger Parameter bei der Beurteilung von Mitochondrien, da sie direkt ihre Funktionalität widerspiegelt, die sich aus dem Gleichgewicht der Protonenpumpaktivität in der Elektronentransportkette und des Protonenflusses durch F ergibt. ₁/F_O ATP-Synthase. Diese sind beide (abhängig von der Genexpression und substratverfügbarkeit) für die sauerstoffabhängige Phosphorylierung von ADP zu ATP^8,9erforderlich. Unter Ausnutzung der Elektronegativität des mitochondrialen Fachs wurden verschiedene potentiometrische Farbstoffe entwickelt, um die Messung von m zu messen. Eines davon ist Tetramethylrhodinmethylesterperchlorat (TMRM), das ausgiebig verwendet wurde, um die Durchflusszytometrie in einer Vielzahl von Zellen¹⁰zu messen, einschließlich hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen¹¹.

Mitochondriale Farbstoffe müssen jedoch mit einer gewissen Vorsicht in HSCs verwendet werden, da die hohe Aktivität der xenobiotischen Efflux-Pumpen dieser Zellen zu Farbstoffextrusion führen kann¹². Tatsächlich hat die Extrusion von mitochondrialen Farbstoffen wie Rhodamine 123 es Forschern ermöglicht, HSCs¹³ zu isolieren oder HSC-"Seitenpopulationen" zu identifizieren, indem sie die Differentialextrusion der Farbstoffe Hoechst Blue und Hoechst Red^{14 ausnutzen. 15}. Es hat sich auch gezeigt, dass Fumitremorgin C, ein spezifischer Blocker des ATP-bindenden Kassetten-Unterfamilien-Unterfamilien-G-Mitglieds-2 (ABCG2)-Transporters, das Färbemuster von MitoTracker in HSPCs¹⁶nicht beeinflusst. Nach der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Studien mit mitochondrialen Farbstoffen in Abwesenheit von xenobiotischen Efflux-Pumpeninhibitoren durchgeführt, was zu dem weit verbreiteten Eindruck führte, dass HSCs nur eine geringe Anzahl von Mitochondrien mit niedrigem ^{, 17 , 18}.

Kürzlich wurde jedoch nachgewiesen, dass Verapamil, ein Breitspektrum-Inhibitor von Efflux-Pumpen, das Färbemuster des mitochondrialen Farbstoffs MitoTracker Green¹⁹signifikant verändert. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass Fumitremorgin C sehr selektiv für Abcg2 ist, während HSCs auch andere Transporter wie Abcb1a (das nur schwach empfindlich auf Fumitremorgin C)¹⁹ausdrückt. Wir haben auch berichtet, dass andere mitochondriale Farbstoffe, wie TMRM, Nonyl-Akridin-Orange und Mitotracker Orange (MTO) die gleichen Muster wie Mitotracker Green aufweisen. Noch wichtiger ist, dass wir beobachtet haben, dass die zytometrischen Strömungsmuster von HSPCs zusätzlich zu der mitochondrialen Masse¹¹ihre M widerspiegeln.

Die Aufnahme von TMRM-Farbstoff hängt streng von der negativen Ladung von Mitochondrien ab, aber die resultierende Ansammlung von Farbstoff ist in einem konstanten Gleichgewicht zwischen seiner Aufnahme und Clearance durch Effluxpumpen²⁰. Der Unterschied in der xenobiotischen Efflux-Pumpenexpression zwischen HSCs und reifen Zellpopulationen wirkt sich auf dieses Gleichgewicht aus und kann zu verzerrten Ergebnissen führen. Die Verwendung von speziellen Inhibitoren wie Verapamil sollte bei der Analyse von 'm durch potentiometrische Farbstoffe berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zur genauen Messung durch TMRM-basierte Durchflusszytometrie, das die xenobiotische Transportaktivität durch den Einsatz spezieller Inhibitoren korrigiert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Färbepuffer (phosphatgepufferte Saline (PBS) + 2% fetales Rinderserum (FBS)): Fügen Sie 10 ml FBS in 500 ml einer sterilen PBS-Lösung hinzu.
   HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für mindestens einen Monat in sterilem Zustand gelagert werden. Bevor Sie mit den folgenden Verfahren beginnen, legen Sie ein Aliquot dieser Lösung (50 ml) auf Eis.
2. ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysing-Puffer: Legen Sie einen Aliquot von ACK-Lysing-Puffer (1 ml) auf Eis, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen.
   HINWEIS: Um den gleichen nicht-kommerziellen Puffer vorzubereiten, lösen Sie 8,02 g NH₄Cl, 1 g KHCO₃ und 37,2 mg Na₂EDTA in 1 L h2 O auf. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur aufbewahren.
3. Kulturmedium: Hinzufügen von 50 ng/ml Stammzellfaktor (SCF) und 50 ng/ml Thrombopoietin (TPO) zum serumfreien Medium für Kultur und Expansion hämatopoetischer Zellen (siehe Tabelle material für kommerzielles Medium empfohlen).
4. TMRM-Lagerlösung: Bereiten Sie die TMRM-Lösung (1 m) vor, indem Sie 5 g TMRM-Pulver in 10 ml Ethanol auflösen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C vor dem Licht schutzfrei auf.
5. Verapamil-Lagerlösung: Bereiten Sie Verapamil (50 mM) Lösung vor, indem Sie 24 mg Verapamil in 1 ml Ethanol verdünnen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C auf.
6. FCCP-Lagerlösung: Bereiten Sie carbonilcyanid p-Triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) Lösung vor, indem Sie 254 mg in 1 ml Ethanol auflösen. Bewahren Sie diese Lösung bei -20 °C vor dem Licht schutzfrei auf.

2. Knochenmarkisolierung

1. Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Inhalation nach institutionellen Richtlinien und sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Dieser Schritt verhindert eine Kontamination der gefährdeten Zellen, ohne die experimentellen Ergebnisse zu beeinträchtigen.
2. Mit einem Paar Zange und scharfe Schere, machen Sie einen kleinen Schnipsen in der ventralen Haut der Maus und dehnen Sie die Haut.
3. Extrahieren Sie den Oberschenkelknochen und Tibia, während Sie darauf achten, die Köpfe des Oberschenkelknochens nicht zu vertreiben, da sie eine große Menge an Knochenmarkzellen enthalten. Legen Sie die entfernten Knochen in eine 6-Well-Platte, gefüllt mit 1,5 ml Färbepuffer.
   HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert keinen sterilen Bereich.
4. Entfernen Sie die Muskeln aus den Knochen und schneiden Sie die Enden der Knochen, so dass der Ausgang des Knochenmarks (Abbildung 1A). Legen Sie die gereinigten Knochen in neue Brunnen mit 1,5 ml Färbepuffer.
   HINWEIS: Muskeln und andere Gewebe müssen sorgfältig entfernt werden, um spritzenverstopfen im nächsten Schritt zu vermeiden.
5. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 3 ml Spritze mit einer 25 G Nadel aus.
   HINWEIS: Spülen Sie das Knochenmark weiter, bis der Knochen weiß wird (Abbildung 1B).
6. Sammeln Sie alle Zellen in einem 1,5 ml Rohr, Zentrifuge für 5 min bei 180 x g dann entsorgen Sie den Überstand (Abbildung 1C).
7. Das Pellet in 300 l eiskalten ACK-Lysing-Puffer sehr sorgfältig aufsetzen, 1 min auf Eis legen und sofort inaktive Lyse durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer. Zentrifuge für 5 min bei 180 x g.
   HINWEIS: Das Zellpellet erscheint weiß (Abbildung 1D). Die Gesamtzahl der isolierten Zellen beträgt etwa 2-4 x 10⁷.
8. Setzen Sie die Pellets in 1 ml Färbepuffer wieder auf und filtern Sie mit einer Zell-Siebkappe (12 x 75 mm², 5 ml Kapazität) mit einem 35 m Sm Nylongewebe, das zur Gewinnung mononukleistischer Zellen eingebaut ist. Nach dem Blockieren die Probe auf Eis halten.

3. Immunostainierung zur Detektion von HSC

1. Bereiten Sie Lineage (Lin) Cocktail. In 400 l Desfärbepuffers 4 l der folgenden biotinilierten Antikörper gegen CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM und Il7Ra hinzufügen, um eine endgültige Verdünnung 1:100 zu erhalten.
2. Vorbereiten von fluorophoren konjugierten Antikörpern (Abs). In 400 l DesFärbepuffers 4 l der folgenden Abs hinzufügen, um eine endgültige Verdünnung 1:100 zu erhalten. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 und CD34-FITC. Im Eis aufbewahren, vor Licht geschützt.
3. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 180 x g, dann entsorgen Sie den Überstand.
4. Fügen Sie 400 L L Lin-Cocktail-Lösung zu den Zellen Pellet. Fügen Sie 4 L CD135-biotinilierten Ab. Vortex schnell zu mischen und für 30 min in Eis zu brüten.
5. Waschen Sie die Probe mit 3 ml Färbepuffer, drehen Sie sie 5 min bei 180 x g nach unten und entsorgen Sie den Überstand.
6. Fügen Sie 400 L Abs-Lösung hinzu. Wirbel schnell zu mischen und inkubieren für 30 min auf Eis.
7. Waschen Sie die Proben mit 3 ml Färbepuffer, drehen Sie sie 5 min bei 180 x g herunter und entsorgen Sie den Überstand.

4. TMRM Färbung

1. Bereiten Sie die TMRM-Färbelösung vor. Fügen Sie 2,2 l TMRM-Stammlösung und 1,1 l Verapamil (2 nM bzw. 50 m als Endkonzentration) in 1,1 ml serumfreiem Medium für die Kultur und Expansion hämatopoetischer Zellen (siehe Tabelle des Materials für kommerzielles Medium empfohlen) mit TPO hinzu. und SCF.
   HINWEIS: Dies ist der wichtigste Schritt des Protokolls. Verapamil Addition ist notwendig, um die Efflux-Pumpen zu blockieren, die stark in den HSCs exprimiert werden und TMRM extrudieren können.
2. Das Knochenmark in 1 ml TMRM-Färbelösung wieder aufsetzen, schnell wirbeln und 1 h bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: TMRM-Färbung darf nicht ausgewaschen werden. Die PE-dedicated Compensation Control wird auch in 100 l TMRM-Färbungslösung resuspendiert und nach schnellem Wirbel für 1 h bei 37 °C inkubiert.
3. Filtern Sie die Probe mit einer Zell-Siebkappe (12 x 75 mm², 5 ml Kapazität) mit einem 35 m Nylongewebe eingebaut, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden.
   HINWEIS: TMRM-Färbung erhöht die Möglichkeit der Verstopftenbildung in der Probe. Die Filtration der Probe kurz vor flow assays wird empfohlen.
4. Fügen Sie 1 l von 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzu, um abgestorbene Zellen durch Durchflusszytometrie auszuschließen.

5. Erfassung durch Flow Cytometer

1. Führen Sie eine Knochenmarkprobe aus und erfassen Sie mindestens 1 x 10⁶ Ereignisse.
2. Richten Sie die Gating-Strategie ein, um die verschiedenen hämatopoetischen Populationen zu identifizieren (Abbildung 2).
   1. Zeigen Sie lebende Knochenmark-Mono-Kernzellen (BM-MNCs), DAPI- Fraktion, im Diagramm für Pacific Blue an, um CD135^-Lin^- (Lin⁾und Lin⁺ Brüche zu identifizieren.
   2. Plot Lin^- Fraktion für APC/Cy7 (c-kit) versus PE/Cy7 (Sca-1) zur Identifizierung multipotenter Vorläufer (MPP) Fraktion, als c-Kit⁺ und Sca-1⁺.
   3. Plot MPP-Fraktion für APC (CD48) im Vergleich zu PerCP/Cy5.5 (CD150), um HSC-Fraktion zu identifizieren, als CD150⁺ und CD48^.
   4. Anzeige des HSC-Anteils für FITC (CD34), um CD34^-HSCund CD34⁺-HSC zu teilen.
3. Erfassen Sie die TMRM-Intensität (PE-Kanal) in jeder Grundgesamtheit.
4. Nach dem Erwerb zur Probe 1 l FCCP hinzufügen, um die Endkonzentration von 1 mM zu erhalten und bei 37 °C für 5 min zu inkubieren, dann 1 x 10⁶ Ereignisse zu erwerben.
   HINWEIS: FCCP ist ein mitochondrialer Entkoppler, der verwendet wird, um die 'm zu zerstreuen. Es wird als experimentelle Kontrolle verwendet, um zu bestätigen, dass TMRM Färbung richtig funktioniert. Nach der Verabreichung von FCCP sollte die TMRM-Intensität drastisch verringert werden (Abbildung 3A).
5. Analysieren Sie Daten, die die durchschnittliche Intensität von PE jeder Population durch die Intensität von PE aller BM-MNCs normalisieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die einfache Isolierung von BM-MNCs von einem Mausmodell. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen: Knochenisolierung, Ausspülen aus dem Knochenmark, Rote Blutzelllyse und Antikörperfärbung gefolgt von TMRM-Färbung zur Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in einer bestimmten hämatopoetischen Population .

BM-MNCs enthalten mehrere Zellpopulationen, einschließlich HSCs. Die in diese...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Die mitochondriale Membranpotentialmessung ist ein Eckpfeiler der Analyse und Bewertung von Mitochondrien, die für den Stoffwechselzustand der Zelle entscheidend sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse von M durch TMRM-Färbung. TMRM ist ein zellpermeant Fluoreszenzfarbstoff, der sich in aktiven Mitochondrien aufgrund von m ansammelt, und seine jeweiligen Werte bleiben im Gleichgewicht zwischen den extrazellulären, zytoplasmatischen und mitochondrialen Kompartimenten¹⁰. Dieses Proto...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysing buffer	Life Technologies	A1049201
B220-biotin	BD Bioscience	553086
CD3e-biotin	Life Technologies	13-0031-85
CD4-biotin	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-biotin	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-biotin	BD Bioscience	553309
CD19-biotin	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-biotin	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
Cyclosporin H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
Fetal Bovine Serum (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-biotin	Biolegend	108404
IgM-biotin	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-biotin	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-biotin	Fischer Scientific	BDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF murine	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM medium	STEMCELL technologies	9605
Streptavidin-Pacific Blue	eBioscience	48-4317-82
Ter119-biotin	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
Verapamil hydrochloride	Millipore Sigma	V4629-1G