JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Насосы Xenobiotic efflux очень активны в гематопоитических стволовых и прародителей (HSPCs) и вызывают экструзию TMRM, митохондриальной мембраны потенциал флуоресцентного красителя. Здесь мы представляем протокол для точного измерения митохондриального мембранного потенциала в HSPCs TMRM в присутствии Verapamil, ингибитор насоса efflux.

Аннотация

Поскольку клеточный метаболизм является ключевым регулятором самообновления гематопоитических стволовых клеток (HSC), различные роли, сыгранные митохондриями в гематопоиетическом гомеостазе, были широко изучены исследователями HSC. Уровни митохондриальной активности отражаются в их мембранных потенциалах ( им), которые могут быть измерены клеточными катионными красителями, такими как TMRM (тетраметилродамин, метил-эфир). Способность насосов efflux выдавливать эти красители из клеток может ограничить их полезность, однако. Результирующая смещение измерений особенно критично при оценке ГХК, так как ксенобиотические транспортеры обладают более высоким уровнем экспрессии и активности в ГХС, чем в дифференцированных клетках. Здесь мы описываем протокол, используя Verapamil, ингибитор насоса efflux, чтобы точно измерить м в различных популяциях костного мозга. В результате ингибирование активности насоса показано, что увеличение интенсивности TMRM в гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs), оставляя его относительно неизменным в зрелых фракций. Это подчеркивает пристальное внимание к красителя-эффлюкс деятельности, которая требуется, когда йм-зависимых красителей используются, и, как написано и визуализированы, этот протокол может быть использован для точного сравнения либо различных популяций в костном мозге, или той же популяции различных экспериментальных моделей.

Введение

Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) являются самообновляющимися, мультимощными и способными дать начало всем клеткам крови1,2. Клеточный метаболизм является ключевым регулятором обслуживания HSC, наряду с транскрипционнымифакторами, интродуциальными сигналами и микросредой 3,4,5. Надлежащий контроль митохондриальной функции и качества, следовательно, имеет решающее значение для hSC обслуживания6,7.

Митохондриальный мембранный потенциал (ЗМ) является ключевым параметром в оценке митохондрий, поскольку он непосредственно отражает их функциональность, которая вытекает из равновесия протонной насосной активности в цепочке транспортировки электронов и протонного потока через F 1/FO СПФ синтаза. Они оба необходимы (в зависимости от экспрессии генов и наличия субстрата) для кислородозависимого фосфорилирования ADP до АТФ8,9. Воспользовавшись электроотрицательностью митохондриального отсека, были разработаны различные потентиометрические красители для измерения м. Одним из них является тетраметилметилродамин метил-эфирпер перхлорат (TMRM), который широко используется для измерения цитометрии потока в различных клетках10, включая гематопоитический стебель и клетки-предтечи11.

Митохондриальные красители должны быть использованы с некоторой осторожностью в HSCs, однако, потому что высокая активность ксенобиотических насосов efflux этих клеток может привести к экструзии красителя12. Действительно, экструзия митохондриальных красителей, таких как родамин 123 позволило исследователям изолировать HSCs13 или определить HSC "побочных популяций", используя дифференциальной экструзии красителей Hoechst Blue и Hoechst Red14, 15. Было также показано, что Fumitremorgin C, конкретный блокировщик ATP-связывающей кассеты sub-family G member 2 (ABCG2) транспортер, не влияет на шаблон окрашивания MitoTracker в HSPCs16. После публикации этих результатов, несколько исследований были проведены с использованием митохондриальных красителей в отсутствие ингибиторов насоса ксенобиота, что привело к распространенному впечатлению, что HSCs имеют лишь небольшое количество митохондрий с низким , 17 Лет , 18.

Недавно было продемонстрировано, однако, что Verapamil, широкий спектр ингибитор efflux насосов, значительно изменяет окрашивающий шаблон митохондриальной краситель MitoTracker Green19. Это несоответствие, вероятно, связано с тем, что Фумитреморгин C является весьма избирательным для Abcg2, в то время как HSCs также выразить другие транспортеры, такие как Abcb1a (который только слабо чувствительны к Fumitremorgin C)19. Мы также сообщили, что другие митохондриальные красители, такие как TMRM, Nonyl acridine orange и Mitotracker Orange (MTO), демонстрируют те же модели, что и Mitotracker Green. Что еще более важно, мы заметили, что поток цитометрических моделей HSPCs отражают их йм в дополнение к митохондриальной массы11.

Потребление красителя TMRM строго зависит от отрицательного заряда митохондрий, но в результате накопления красителя находится в постоянном балансе между его потреблением и зазором на насосах efflux20. Разница в экспрессии насоса xenobiotic efflux между HSCs и возмужалыми популяциями клетки влияет на этот баланс и может вести к пристрастным результатам. Использование специальных ингибиторов, таких как Верапамил, должно быть рассмотрено при анализе «Мм» помощным красителям. Здесь мы описываем модифицированный протокол для точного измерения цитометрии потока на основе TMRM, который корректирует активность ксенобиотики переносчика с помощью специальных ингибиторов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна.

1. Подготовка решений

  1. Окрашивающий буфер (фосфат-буферный солен (PBS) - 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS)): Добавьте 10 мл FBS в 500 мл стерильного раствора PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение по крайней мере одного месяца в стерильном состоянии. Перед началом следующих процедур поставьте аликот этого раствора (50 мл) на лед.
  2. ACK (аммоний-хлорид-калий) лизационный буфер: Поместите аликвот aclying буфера (1 мл) на льду перед началом процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки того же некоммерческого буфера растворите 8,02 г NH4Cl, 1 г KHCO3 и 37,2 мг Na2EDTA в 1 Л H2O. Отрегулируйте рН до 7,2-7,4. Хранить до 6 месяцев при комнатной температуре.
  3. Культура среды: Добавить 50 нг / мл фактор стволовых клеток (SCF) и 50 нг / мЛ тромбопоэтина (TPO) в сыворотке свободной среде для культуры и расширения гематопоэтических клеток (см. Таблица Материала для коммерческих средних рекомендуется).
  4. Решение запасов TMRM: Приготовьте раствор TMRM (1 мкм), растворив 5 мкг порошка TMRM в 10 мл этанола. Храните этот раствор при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света.
  5. Раствор бульона Верапамил: Приготовьте раствор Верапамил (50 мМ), разбавив 24 мг верапамиля в 1 мл этанола. Храните это решение при -20 градусах Цельсия.
  6. FccP фондовый раствор: Подготовка карбонилцианид р-трифлуометоксифенилгидзон (FCCP) (1 М) решение путем растворения 254 мг в 1 мл этанола. Храните этот раствор при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света.

2. Изоляция костного мозга

  1. Эвтанизировать мышь путем вдыхания CO2 в соответствии с институциональными руководящими принципами и распылить мышей с 70% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает загрязнение клеток, представляющих интерес без ущерба для экспериментальных результатов.
  2. Используя пару щипц и острые ножницы, сделать небольшой фрагмент в брюшной кожи мыши и растянуть кожу.
  3. Извлеките бедренную кость и голени пока заботясь для того чтобы не выбить головки бедренной кости по мере того как они содержат большое количество клеток костного мозга. Поместите удаленные кости в 6-колодную пластину, наполненную 1,5 мл окрашивающего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура не требует стерильной области.
  4. Удалить мышцы из костей и сократить концы костей, что позволяет выход из костного мозга(рисунок 1A). Поместите очищенные кости в новые скважины с 1,5 мл окрашивающего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы и другие ткани должны быть тщательно удалены, чтобы избежать засорения шприца на следующем этапе.
  5. Промыть костный мозг с помощью 3 мл шприц с 25 G иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте промыть костный мозг до тех пор, пока кость не станет белой(рисунок 1B).
  6. Соберите все клетки в трубке 1,5 мл, центрифуге в течение 5 мин при 180 х г, затем отбросьте супернатант (рисунок1С).
  7. Приостановите гранулы в 300 л ледяного буфера ACK, выкладывая его очень осторожно, поставьте на лед в течение 1 мин и сразу же неактивный лиза, добавив 1 мл окрашивающего буфера. Центрифуга в течение 5 мин при 180 х г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки гранулы появляется белый(Рисунок 1D). Общее количество изолированных ячеек составляет около2-4 х 10 7.
  8. Приостановите гранулы в 1 мл окрашивающего буфера и процедите спомощью крышки для клеток-ситектора (12 х 75 мм 2, 5 мл мощности) с 35 мл нейлоновой сеткой, включенной для получения моноядерных элементов. После блокировки держите образец на льду.

3. Иммуностоинг для обнаружения HSC

  1. Подготовка Lineage (Лин) коктейль. В 400 qL буфера окрашивания, добавить 4 зл и l следующих биотинилаированных антител против CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM и Il7Ra для получения окончательного разбавления 1:100.
  2. Подготовка флюорофоров конъюгированных антител (Abs). В 400 л окрашивающего буфера добавьте 4 qL следующих абс, чтобы получить окончательное разбавление 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 и CD34-FITC. Хранить во льду, защищенном от света.
  3. Centrifuge образец в течение 5 мин на 180 х г, затем отбросить супернатант.
  4. Добавьте 400 л раствора коктейля Лин к клеткам гранул. Добавьте 4 qL CD135-биотинилатированных Ab. Vortex быстро смешать и инкубировать в течение 30 минут во льду.
  5. Вымойте образец, добавив 3 мл окрашивающего буфера, отвратите 5 мин при 180 х г и отбросьте супернатант.
  6. Добавьте 400 л раствора Abs. Вихрь быстро смешивать и инкубировать в течение 30 минут на льду.
  7. Вымойте образцы с 3 мл окрашивающего буфера, вращаться вниз в течение 5 мин на 180 х г и отказаться от супернатанта.

4. TMRM окрашивание

  1. Подготовьте решение для окрашивания TMRM. Добавьте 2,2 л бульонного раствора TMRM и 1,1 л верапамил (2 нМ и 50 мкм в качестве конечной концентрации, соответственно) в 1,1 мл среды без сыворотки для культуры и расширения гематопоитических клеток (см. Таблица Материала для коммерческой среды рекомендуется) и SCF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый важный шаг протокола. Добавление Verapamil необходимо блокировать насосы efflux, которые высоко выражены в HSCs и могут выдавливать TMRM.
  2. Приостановите срок действия костного мозга в 1 мл окрашивающего раствора TMRM, вихрь быстро и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TMRM окрашивание не должно быть вымыто. PE-посвященный компенсации контроля также вновь в 100 Зл TMRM окрашивая раствор, и подвергаются инкубации в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию после быстрого вихря.
  3. Фильтр образца с помощью ячейки ситечко крышка (12 х 75 мм2, 5 мл мощности) с 35 мкм нейлоновой сетки включены, чтобы избежать засорения цитометра потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TMRM окрашивание увеличивает возможность засорения образования в образце. Рекомендуется фильтрация образца непосредственно перед анализом потока.
  4. Добавьте 1 зл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), чтобы исключить мертвые клетки цитометрией потока.

5. Приобретение цитометром потока

  1. Запустите образец костного мозга и приобрести по крайней мере 1 х 106 событий.
  2. Настройка стратегии gating для выявления различных гематопоетической популяции(рисунок 2).
    1. Отображение живых моноядерных клеток костного мозга (BM-MNCs), DAPIи фракции, в сюжете для Pacific Blue для идентификации CD135иLin( Lin)и Линй и Линьи фракции.
    2. Участок Лин- фракция для APC/Cy7 (c-kit) по сравнению с PE/Cy7 (Sca-1) для определения многопотентных прародителей (MPP) фракции, как c-kitи Sca-1.
    3. Фракция MPP участка для APC (CD48) против PerCP/Cy5.5 (CD150) для того чтобы определить фракцию HSC, как CD150и CD48-.
    4. Отображение фракции HSC для FITC (CD34) дляразделения CD34 -HSC и CD34 -HSC.
  3. Приобретайте интенсивность TMRM (канал PE) в каждой популяции.
  4. После приобретения добавьте в образец 1 зл и л РККП, чтобы получить окончательную концентрацию 1 мМ и инкубировать при 37 градусах По кв. 5 мин, затем приобретите 1 х 106 событий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FCCP является митохондриальным разъединением, который используется для рассеиваемого м. Он используется в качестве экспериментального контроля, чтобы подтвердить, что TMRM окрашивания работает правильно. После введения FCCP интенсивность TMRM должна быть резко снижена(рисунок 3A).
  5. Анализ данных, нормализующих среднюю интенсивность ПЭ каждой популяции, по интенсивности ПЭ всех БМ-МНК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описанный выше протокол позволяет легко обезобрать БМ-МНК от мышиной модели. Рисунок 1 обобщает основные этапы протокола: костная изоляция, промывка костного мозга, лизис красных кровяных телец и окрашивание антител с последующим окрашиванием TMRM для измерения потенциа...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Измерение потенциала митохондриальной мембраны является краеугольным камнем анализа и оценки митохондрий, которые имеют решающее значение для метаболического состояния клетки. Здесь мы описываем протокол для анализа ам по окрашиванию TMRM. TMRM является клеточной люминесцентной красит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят всех членов лаборатории Ито, особенно K Ито и H Sato, и Институт стволовых клеток Эйнштейна за комментарии и Эйнштейна потока Цитометрии и аналитической визуализации основных объектов (финансируется Национальным институтом рака грант P30 CA013330) для помочь проводить эксперименты. K.I. поддерживается грантами Национальных институтов здравоохранения (R01DK98263, R01DK115577 и R01DK100689) и Департамента здравоохранения штата Нью-йорк в качестве основного директора одноклеточной геномики Эйнштейна/Эпигеномики (C029154). К.И. Ито является научным сотрудником Общества лейкемии и лимфомы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ACK lysing bufferLife TechnologiesA1049201
B220-biotinBD Bioscience553086
CD3e-biotinLife Technologies13-0031-85
CD4-biotinFischer ScientificBDB553782
CD8-biotinLife Technologies13-0081-85
CD11b-biotinBD Bioscience553309
CD19-biotinBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotineBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Cyclosporin HMillipore SigmaSML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)Life Technologies62248
Fetal Bovine Serum (FBS)DenvilleFB5001-H
FCCPMillipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotinBiolegend108404
IgM-biotinLife Technologies13-5790-85
Il7Rα-biotineBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotinFischer ScientificBDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF murinePEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL technologies9605
Streptavidin-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotinFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Verapamil hydrochlorideMillipore SigmaV4629-1G

Ссылки

  1. Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
  2. Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
  3. Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  4. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  5. Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
  6. Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
  7. Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
  8. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  9. Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
  10. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  11. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  12. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
  13. Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
  14. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  15. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  16. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  17. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125(2016).
  18. Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
  19. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  20. Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
  23. Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149TMRM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены