에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

요약

Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 대사가 조혈 줄기 세포 (HSC) 자기 갱신의 중요한 레귤레이터이기 때문에, 조혈 항상성에서 미토콘드리아가 하는 다양한 역할은 HSC 연구원에 의해 광범위하게 연구되었습니다. 미토콘드리아 활성 수준은 TMRM(테트라메틸라호다민, 메틸 에스테르)과 같은 세포-식양이온염료로 측정할 수 있는 막 전위(ΔΘm)에 반영됩니다. 그러나 세포에서 이러한 염료를 돌출하는 유출 펌프의 능력은 그 유용성을 제한할 수 있습니다. xenobiotic 수송기는 분화한 세포에서 보다는 HSC에 있는 발현 그리고 활동의 상부를 전시하기 때문에 결과 측정 편향은 HSC를 평가할 때 특히 중요합니다. 여기에서는 여러 골수 집단에서 ΔΘm을 정확하게 측정하기 위해 유출 펌프 억제제인 Verapamil을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 펌프 활동의 결과 억제는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에서 TMRM 강도를 증가시키는 것으로 나타났으며 성숙한 분획에서 상대적으로 변하지 않은 채로 남습니다. 이것은 ΔΘm 의존염료가 사용될 때 요구되는 염료-유출 활동에 주의를 강조하고, 서면 및 시각화될 때, 이 프로토콜은 골수 내의 다른 인구, 또는 동일 인구를 정확하게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다 다양한 실험 모델에 걸쳐.

서문

조혈 줄기 세포 (HSC)는 자가 갱신, 다중 강력하며 혈액의 모든 세포를 발생시킬 수있습니다 1,^2. 세포 대사는 전사 인자, 본질적인 신호 및 미세 환경^3,4,5와함께 HSC 유지 보수의 주요 조절제입니다. 따라서 미토콘드리아 기능 및 품질의 적절한 제어는HSC 유지 보수 6,^7에매우 중요합니다.

미토콘드리아 멤브레인 전위(ΔΘm)는 미토콘드리아의 기능을 직접 반영하기 때문에 미토콘드리아의 평가에서 핵심 적인 매개 변수이며, 이는 전자 수송 사슬에서 양성자 펌핑 활성의 평형과 F를 통한 양성자 흐름에서 파생됩니다. ₁/F_O ATP 신디사이저. 이들은 모두 ATP^8,9에대한 ADP의 산소 의존성 인산화에 대해 (유전자 발현 및 기질 가용성에 따라 다름)이 요구된다. 미토콘드리아 구획의 전기적 성전성을 활용하여, ΔΘm을 측정하기 위해 다양한 전위성 염료가 개발되었습니다. 그 중 하나는 테트라메틸호다민 메틸에스테르 과염소산염(TMRM)으로, 이는 조혈줄기 및 전구세포(11)를포함하는 다양한 세포에서 유세포분석에 의해 ΔΔm을 측정하는데 광범위하게 사용되고 있다.

미토콘드리아 염료는 이러한 세포의 엑세바이오틱 액피펌프의 높은 활성이 염료 압출(12)을 초래할 수 있기때문에, HSC에서 몇 가지 주의를 기울여 사용해야 한다. 실제로, 로다민 123과 같은 미토콘드리아 염료의 압출은 연구원이 HSCs^13을 격리하거나 염료 Hoechst Blue 및 Hoechst Red^{14의 차동 압출을 이루에 의해 HSC "측군수"를 식별할 수 있게 해 주었습니다. 도 15}. 또한 FUmitremorgin C, ATP 결합 카세트 하위 패밀리 G 부재 2 (ABCG2) 수송의 특정 차단제, HSPC^16에서미토 트래커의 염색 패턴에 영향을미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과의 출판 후, 여러 연구는 xenobiotic 유출 펌프 억제제의 부재에 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행되었다, HSC는 낮은 Δm 16미토콘드리아의 소수만 가지고 있다는 광범위한 인상으로 이어지는 ^{, 17세 , 18}.

그러나 최근에는, 프럭스 펌프의 광범위한 스펙트럼 억제제인 베라파밀이 미토콘드리아 염료 미토트래커 그린(MitoTracker Green)의 염색 패턴을 현저하게 수정한다는 것이 입증되었다. 이러한 불일치는 Fumitremorgin C가 Abcg2에 대해 매우 선택적이라는 사실 로 인한 것일 수 있으며, HSC는 또한 Abcb1a (Fumitremorgin C에 약하게 민감함)와 같은 다른 운송업체를 표현합니다^19. 우리는 또한 다른 미토 콘 드리 아 염 염 염, TMRM 등, Nonyl 아크리딘 오렌지, 그리고 미토 트래커 오렌지 (MTO) 미토 트래커 그린과 동일한 패턴을 전시. 더 중요한 것은, 우리는 HSPC의 유동 세포 측정 패턴이 미토콘드리아 질량¹¹이외에 그들의 ΔΘm을 반영한다는 것을 관찰했습니다.

TMRM 염료의 섭취는 엄격하게 미토콘드리아의 음전하에 따라 달라지지만, 그 결과 로 인한 염료 축적은 efflux 펌프^20에의한 섭취와 클리어런스 사이의 일정한 균형입니다. HSC와 성숙한 세포 집단 사이의 xenobiotic 유출 펌프 발현의 차이는 이 균형에 영향을 미치고 편향된 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. Verapamil과 같은 전용 억제제의 사용은 전위성 염료에 의한 ΔΘm의 분석에서 고려되어야 합니다. 여기에서 우리는 전용 억제제의 사용을 통해 xenobiotic 수송기 활동을 정정하는 TMRM 기지를 둔 유량 세포측정에 의하여 정확한 ΔΘm 측정을 위한 수정된 프로토콜을 기술합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 염색 완충제 (인산 완충 식염수 (PBS) + 2 % 태아 소 혈청 (FBS)): 멸균 PBS 용액의 500 mL에 FBS 10 mL을 추가하십시오.
   참고: 이 용액은 멸균 상태에서 적어도 1 개월 동안 4 °C에서 보관될 수 있다. 다음 절차를 시작하기 전에 이 용액(50 mL)의 별칭을 얼음 위에 놓습니다.
2. ACK (암모늄 염화물 칼륨) 라이징 버퍼 : 절차를 시작하기 전에 ACK 라이징 버퍼 (1 mL)의 aliquot를 얼음위에 놓습니다.
   참고: 동일한 비상업적 완충액을 준비하려면, NH₄Cl 8.02 g, KHCO₃ g 1 g 및 Na₂EDTA 의 37.2 mg을 H₂O의 1 L에 용해하여 pH를 7.2-7.4로 조정한다. 실온에서 최대 6개월간 보관하십시오.
3. 배양 배지: 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지에 50 ng/mL 줄기 세포 인자(SCF)와 50 ng/mL 혈전포이에틴(TPO)을 추가합니다(상업용 배지용 재료 표 참조).
4. TMRM 스톡 용액: 에탄올 10 mL에 5 μg의 TMRM 분말을 용해시킴으로써 TMRM(1 μM) 용액을 준비한다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.
5. Verapamil 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 24 mg의 베라파밀을 희석하여 베라파밀(50 mM) 용액을 준비합니다. 이 용액을 -20 °C에 보관하십시오.
6. FCCP 스톡 솔루션: 에탄올 1 mL에 254 mg을 용해시켜 카보닐시아니드 p-트리플루오메톡시페닐히드라존(FCCP) (1M) 용액을 준비합니다. 이 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오.

2. 골수 격리

1. 기관 지침에 따라_CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고 마우스를 70% 에탄올로 분무하였다.
   참고: 이 단계는 실험 결과를 손상시키지 않으면서 관심 있는 세포의 오염을 방지합니다.
2. 집게와 날카로운 가위를 사용하여 마우스의 복부 피부에 작은 스니핑을하고 피부를 스트레칭하십시오.
3. 대퇴골과 경골은 대퇴골의 머리를 빼내지 않도록 주의하면서 다량의 골수 세포를 함유하고 있습니다. 제거된 뼈를 1.5 mL의 염색 버퍼로 채워진 6웰 플레이트에 놓습니다.
   참고: 이 절차는 멸균 영역을 필요로하지 않습니다.
4. 뼈에서 근육을 제거하고 골수의 출구를 허용 뼈의 끝을 잘라 (그림1A). 1.5 mL의 염색 버퍼로 깨끗한 뼈를 새 우물에 놓습니다.
   참고: 근육과 다른 조직은 다음 단계에서 주사기 막힘을 피하기 위해 신중하게 제거해야합니다.
5. 25G 바늘로 3 mL 주사기를 사용하여 골수를 씻어 내보하십시오.
   참고: 뼈가 하얗게 될 때까지 골수를계속 씻어 내보릅니다(그림 1B).
6. 1.5 mL 튜브에 있는 모든 세포를 수집하고, 원심분리기를 180 x g에서 5분 간 제거한 다음 상월체를 버린다(도1C).
7. 300 μL의 얼음 차가운 ACK 용해 완충액에서 펠릿을 매우 신중하게 중단하고 1 분 동안 얼음에 넣고 즉시 비활성 용해1 mL의 염색 버퍼를 추가하십시오. 원심분리기 180 x g에서5 분.
   참고: 세포 펠릿이 흰색으로 나타납니다(그림1D). 분리된 세포의 총 수는 약 2-4x 10 7이다.
8. 단핵 세포를 얻기 위해 통합 된 35 μm 나일론 메쉬로 셀 스트레이너캡 (12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 1 mL의 염색 버퍼 및 필터에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 차단 한 후, 얼음에 샘플을 유지합니다.

3. HSC 검출을 위한 면역 염색

1. 리니지(린) 칵테일을 준비합니다. 염색 완충액의 400 μL에서, CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM 및 Il7Ra에 대하여 다음의 생체질화 항체의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다.
2. 형광공 컨쥬게이터 항체 (Abs)를 준비하십시오. 400 μL의 염색 완충제에서, 다음 복근의 4 μL을 첨가하여 최종 희석 1:100을 얻었다. 스트렙타비딘-퍼시픽 블루, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 및 CD34-FITC. 빛으로부터 보호, 얼음에 보관합니다.
3. 샘플을 180 x g에서 5 분 동안 원심 분리한 다음 상한체를 버립니다.
4. 세포 펠릿에 린 칵테일 용액 400 μL을 추가합니다. 4 μL의 CD135-바이오틴틸화된 Ab. Vortex를 빠르게 넣고 얼음에서 30분 동안 혼합하고 배양합니다.
5. 3 mL의 염색 버퍼를 추가 한 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한제를 버립니다.
6. 400 μL의 복근 용액을 추가하십시오. 소용돌이는 빠르게 혼합하고 얼음에 30 분 동안 배양.
7. 3 mL의 염색 버퍼로 샘플을 씻고 180 x g에서 5 분 동안 회전시키고 상한을 버립니다.

4. TMRM 염색

1. TMRM 염색 용액을 준비합니다. TPO를 사용하여 배양 및 조혈 세포의 배양 및 확장을 위한 혈청이 없는 배지의 1.1 mL에 TMRM 스톡 용액 2.2 μL과 Verapamil 1.1 μL(각각 최종 농도로 50 μM)을 추가합니다(상업용 배지권장 재료 표 참조). 및 SCF.
   참고: 이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. Verapamil 추가는 HSC에서 고도로 표현되고 TMRM을 돌출할 수 있는 유출 펌프를 막기 위해 필요합니다.
2. TMRM 염색 용액의 1 mL에서 골수를 재중단하고, 와류를 빠르게 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   참고: TMRM 염색은 씻어낼 수 없습니다. PE 전용 보상 제어는 또한 TMRM 염색 용액의 100 μL에서 재중단되고, 빠른 와류 후 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션을 행하였다.
3. 유세포계의 막힘을 방지하기 위해 35 μm나일론 메쉬로 셀 스트레이너 캡(12 x 75 mm 2, 5 mL 용량)을 사용하여 샘플을 필터링합니다.
   참고: TMRM 염색은 시료에서 막힘 형성의 가능성을 증가시킨다. 유동 검문바로 전에 시료의 여과가 권장됩니다.
4. 유세포 측정에 의한 죽은 세포를 배제하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐린들레(DAPI)의 1 μL을 추가합니다.

5. 유세포계에 의한 취득

1. 골수 샘플을 실행하고 적어도 1 x 10⁶ 이벤트를 획득합니다.
2. 게이팅 전략을 설정하여 상이한 조혈 인구를 식별합니다(그림 2).
   1. 디스플레이 라이브 골수 모노 핵 세포 (BM-MNCs), DAPI^- 분율, CD135를 식별하기 위해 태평양 블루 플롯^-린^- (린^-) 및 린⁺ 분수.
   2. 플롯 린^- C 키트⁺ Sca-1⁺로, 다능한 선조 (MPP) 분율을 식별하기 위해 PE / Cy7 (Sca-1) 대 APC / Cy7 (c 키트)에 대한 분율 .
   3. CD150⁺ 및 CD48로, HSC 분수를 식별하기 위해 PerCP / Cy5.5 (CD150)에 대한 APC (CD48) 대 MPP 분획을 플롯^-.
   4. -HSC 및 CD34⁺-HSC^-- - - - - - FITC (CD34)에 대한 HSC 분획을 표시합니다.
3. 각 집단에서 TMRM 강도(PE 채널)를 획득한다.
4. 획득 후, FCCP의 샘플 1 μL을 첨가하여 1 mM의 최종 농도를 얻고 37°C에서 5분 동안 배양한 다음 1 x 10 6개의 이벤트를 획득한다.
   참고: FCCP는 ΔΘm을 발산하는 데 사용되는 미토콘드리아 비커플러입니다. TMRM 염색이 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 실험 제어로 사용됩니다. FCCP의 투여 후, TMRM 강도는 크게감소되어야한다 (그림 3A).
5. 모든 BM-MNIC의 PE 강도에 따라 각 모집단의 PE의 평균 강도를 정상화하는 데이터를 분석합니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 마우스 모델에서 BM-MNIC를 쉽게 격리할 수 있습니다. 그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약합니다: 골수 분리, 골수에서 플러시, 적혈구 포리해, 및 항체 염색 다음에 TMRM 염색은 특정 조혈 집단에서 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해 .

BM-MNIC는 HSC를 포함하여 몇몇 세포 인구를 포함합니다. 이 프로토콜에 사용되?...

토론

미토콘드리아 막 전위 측정은 세포의 대사 상태에 중요한 미토콘드리아의 분석 그리고 평가의 초석입니다. 여기서, TMRM 염색에 의한 ΔΘm의 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. TMRM은 ΔΘm으로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포-천형형 염료이며, 각각의 수준은 세포외, 세포질 및 미토콘드리아^구획(10)사이의 평형 상태로 유지된다. 이 프로토콜은 테트라메틸호다민, 에틸 에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysing buffer	Life Technologies	A1049201
B220-biotin	BD Bioscience	553086
CD3e-biotin	Life Technologies	13-0031-85
CD4-biotin	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-biotin	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-biotin	BD Bioscience	553309
CD19-biotin	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-biotin	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
Cyclosporin H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
Fetal Bovine Serum (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-biotin	Biolegend	108404
IgM-biotin	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-biotin	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-biotin	Fischer Scientific	BDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF murine	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM medium	STEMCELL technologies	9605
Streptavidin-Pacific Blue	eBioscience	48-4317-82
Ter119-biotin	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
Verapamil hydrochloride	Millipore Sigma	V4629-1G